מאמר שיטה

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

9.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55319

⸱

10 במרץ 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Katz Family Drug Discovery Center and Division of Nephrology and Hypertension, Department of Medicine, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine, 2Department of Cell Biology and Anatomy, University of Miami Leonard M. Miller School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

תקציר

הכבד ממלא תפקיד מכריע בוויסות דלקת מערכתית. במחלת כליות כרונית בפרט, הכבד מגיב בתגובה המילייה אורמיה, סטרס חמצוני, endotoxemia ואת אישור ירד מחזורי ציטוקינים מעודדי דלקת על ידי הפקת מספר רב של המגיבים-השלב האקוטי. כלי ניסיוני ללמוד דלקת והתפקיד הבסיסי של hepatocytes הם קריטיים להבנת הרגולציה תרומת ציטוקינים כבדים לתגובה בשלב חריף מערכתית תרחיש הפר דלקתי ממושך, במיוחד בסביבה מורכבת כגון מחלת כליות כרונית. מאז לימוד מנגנונים מורכבים של דלקת in vivo נותר מאתגר, עתירי משאבים ובדרך כלל מחייב את השימוש של חיות טרנסגניות, hepatocytes מבודד העיקרי לספק כלי חזק כדי להשיג תובנות מכניסטית לתוך תגובה חריפה פאזיים בכבד. מאז טכניקה במבחנה זה כוללת עלויות מתונות, גבוה מחדשproducibility וידע טכני משותף, hepatocytes המבודד העיקרי יכולים גם לשמש בקלות כגישת הקרנה. כאן אנו מתארים שיטה אנזימטית מבוססי לבודד hepatocytes murine העיקרי, ואנחנו מתארים את הערכה של תגובה דלקתית בתאים אלה באמצעות ELISA ו- PCR כמותי בזמן אמת.

מבוא

מחלת כליות כרונית (CKD) יכולה להיות מוגדרת כמדינה של דלקת חריפה וכרונית 1. בחולים עם מחלת כליות כרונית, רמות בסרום של גורם גדילה פיברובלסטים הורמון phosphaturic 23 (FGF23) בהדרגה לעלות על מנת לשמור על הומאוסטזיס 2 פוספט בסרום. רמות FGF23 אצלה עלו קשורות באופן עצמאי עם תחלואה ותמותה קרדיו-וסקולרית בקרב חולים אשר מתחילים המודיאליזה טיפול 3, 4. יתר על כן, מספר מחקרים קליניים הראו קשר חזק בין רמות גבוהות FGF23 ורמות של C-reactive protein (CRP), אינטרלאוקין 6 (IL-6) ו גידול נמק α פקטור (TNFα) 5, 6. יתר על כן, במחקר ניסיוני, אנחנו הוכחנו לאחרונה כי FGF23 יכול למקד ישירות hepatocytes ולגרום לתגובה דלקתית על ידי הגדלת CRP ו- IL-6 עמ 'roduction בכבד 7. לפיכך, FGF23 עשוי לפעול כגורם במחזור שתורם דלקת מערכתית CKD.

בשנות ה -70 המוקדמות, hepatocytes העיקרי היו מבודדים למד בפעם הראשונה 8. מאז העיקרי תאים בכבד תרבותי נעשה שימוש נרחב לבחון עיבוד מטבולית, תפקוד הורמונלי, מטבוליזם התרופה ורעילות כמו גם חסינות ותגובות דלקתיות 9, 10. פרוטוקולים הקודם בעיקר תארו את הבידוד האנזימטית של hepatocytes העיקרי מרקמות כבדות אנושי 11, 12. בעוד מודל מצוין, זה משמיט את היכולת ללמוד כיצד מניפולציה גנטית משפיע מנגנוני איתות כבדה מורכבים כמו גם השלכות תפקודיות על סוגים של גירויים שונים. בחלק הבא, אנו מתארים את הבידוד של hepatocytes העיקרי murine. יש לציין, כי השפעת מספר מתווכים של התגובה חריפה פאזיים בכבד, כגון lipopolysaccharide (LPS), IL-6 ו- FGF23 ניתן לנתח באופן קל, מהיר לשחזור 13.

בזאת, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד האנזימטית של hepatocytes מעכברים בוגרים, ואנחנו מראים כי מעוררים הוקמו של דלקת, כגון LPS ו- IL-6, כמו גם מתווכים דלקתיים רומן כגון FGF23, יכול ישירות לעורר ביטוי הפרשה ציטוקינים דלקתיים, כגון CRP ו- IL-6 ב hepatocytes תרבותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים בעלי חיים הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) מאוניברסיטת מיאמי מילר מבית הספר לרפואה.

1. הכנה

  1. תקשורת וכבדה זלוף כבד מחממים לעכל תקשורת באמבט מים ב 37 ° C.
  2. גדר משאבת זלוף (30 mL / min). בזהירות ולמלא מראש את מערכת הצינורות של המשאבה עם תקשורת זלוף הכבד. הימנע מכל בועות אוויר במערכת ולהכין המיקרוסקופ stereotactic.
  3. מנות תרבית תאים מעיילות באמצעות קולגן סוג אני על פי הפרוטוקול של היצרן.

2. שחזור כבד

  1. להרדים את העכבר התורם באמצעות / חמצן משאיפת isoflurane (isoflurane 4% / 2 ליטר / דקה חמצן).
    1. לשמור על הרדמה באמצעות הורדת isoflurane ל 2-2.5% או על ידי הזרקת קטמין (100 מ"ג / ק"ג של משקל הגוף intraperitoneally) ו xylazine (10 מ"ג / ק"ג משקל גוף intraperitoneally). הרדמה isoflurane רציפה עדיפה מאז קטמין מורידה את לחץ הדם ויכול לגרום לרעילות כבדית.
  2. מניח את העכבר מורדם על כרית ספיגה. תקן את הגפיים של העכבר עם סרט דביק.
  3. לגלח ולחטא את הבטן של העכבר ולבצע פיום בטן גחון מן החיק לגבול גולגולתי של הכבד באמצעות מספרי כירורגיות עם טיפים חדים / קהים. לחתוך את דופן הבטן לשני הצדדים, זנב של הסרעפת.
  4. לחשוף את הווריד הנבוב הנח (IVC) על ידי הזזת המעי בזהירות לצד ימין. בזהירות לנתח רקמות שומן סביב IVC באמצעות מטליות קצה כותנה סטרילית מלקחיים קצה זוויתי.
  5. לחתוך את הסרעפת suprahepatic ולפתוח את חלל בית החזה על ידי שני חתכים לרוחב באמצעות מספריים כירורגיות בסדר עם טיפים חד / חדות. ולקשור את IVC החזה באמצעות משי כירורגית (5/0).
  6. Cannulate את IVC infrarenal באמצעות צנתר iv מוגן, להוציא את המחט בזהירות,לחבר את משאבת זלוף ולהתחיל מרוססת הכבדה. אם ביצע כראוי, הכבד צריך מיד להתחיל מחווירות להתנפח.
  7. Transect פורטל וריד המאפשר ניקוז מתאים של תקשורת דם זלוף באמצעות מספרי כירורגיות בסדר.
  8. Perfuse את הכבד עם כ 30 מ"ל של התקשורת זלוף הכבד, ולאחר מכן לעבור הכבד לעכל מדיה (30 מ"ל). כבה את המשאבה זלוף ולהסיר את הצינורית פעם זלוף תושלם.
  9. בעדינות לחשוף את האזור המרכזי של הכבד ולאתר את רקמת חיבור המקשרת את האונה של הכבד. תפוס את סיבי חיבור המרכזיים ובזהירות לנתח כל הרקמות מחזיקות הכבד במקום בעדינות להסיר את הכבד.
  10. מיד להעביר את הכבד לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של הכבד לעכל התקשורת.
    הערה: אין זמן אונליין ספציפי עבור שלב זה. לאחר זלוף, הכבד נשאר תקשורת לעכל להובלה כדי ברדס תרבית תאים סטריליים. כל זהצעדים ubsequent צריכה להתבצע בסביבה סטרילית.

3. בידוד וטיפול של תאים

  1. בתוך מכסה מנוע תרבית תאים, להעביר את הכבד מתקשורת העיכול המכילה צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מיליליטר לתוך צלחת רקמת סטרילית תרבות.
  2. בעזרת מלקחיים סטריליות, לקרוע את אונות הארבע בעדינות של הכבד. אם ביצע כראוי, בינוני העיכול צריך להיות עכורים בשל לבודד hepatocytes מהכבד.
  3. בעזרת קצה פיפטה סטרילית 25 מיליליטר, לסנן מדיום העיכול העכור דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר פוליפרופילן חדש כדי להסיר חלקיקי רקמות מעוכלים ופסולת תא.
  4. חזור על שלבי 3.2 ו -3.3 עם פוספט שנאגר מלוח סטרילית (PBS). זה מסייע בהסרת hepatocytes שיורית כל מהכבד.
  5. צנטריפוגה ב 50 XG במשך 2 דקות ב 4 °. לשאוב supernatant המכיל פסולת התא עודף מחדש להשעות התאים בעדינות 25 1x מ"ל קרהבינונית 'וויליאמס E.
  6. בעזרת קצה פיפטה סטרילית 25 מ"ל, לסנן מחדש ההשעיה דרך מסננת תא ניילון חדש 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל להשיג השעיה מנקה.
  7. חזור על שלבי 3.5 ו -3.6 עבור שלושה שוטף נוסף באמצעות 'הקר וויליאמס הבינוני E 1x לקבל השעית תא ברורה.
  8. לאחר שלב הכביסה הסופי, לשאוב supernatant כדי להסיר שאריות תאים עודפות. Re- להשעות ותאי מסנן 25 מ"ל חם 1x E מדיה 'וויליאמס המכיל הפשרת hepatocyte העיקרי ותוספי ציפוי דרך מסננת תא ניילון חדש 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי פוליפרופילן 50 מ"ל.
  9. ספירת תאים בתוך 25 ההשעיה תא מ"ל באמצעות hemocytometer. צופים בממוצע 15 - 20 מיליון תאים לכל כבד מבוגר. לקבוע כדאיות התא באמצעות מכתים trypan כחול.
  10. פלייט תאים 2 מ"ל של וויליאמס 'מדיה E 1x המכיל הפשרת hepatocyte העיקרי ותוספי ציפוי על קולגן מצופה ce 6 בארll אשכול תרבות (9 x 10 5 תאים לכל טוב).
  11. לאחר 4 שעות, לשנות התקשורת 1x E מדיה 'וויליאמס המכיל תוספי תחזוקה hepatocyte העיקרי.
  12. לאחר 24 שעות, סרום להרעיב תאים עם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תקשורת 1x במשך 6 שעות.
  13. פנקו את התאים עם PBS כמו רכב, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 מיקרוגרם / מ"ל) או IL-6 (50 ng / mL) במדיום סרום ללא דגירה במשך 24 שעות.

בידוד 4. של RNA

  1. כן RNA באמצעות ערכת טור הספין מסחרית על פי הוראות היצרן.

5. יצירת cDNA מ- RNA מבודד על ידי שעתוק לאחור

  1. הוספת 200 ננוגרם של מדגם RNA בודד לצינור PCR.
  2. להוסיף 14 μL של endonuclease ללא H 2 O PCR צינור משלב 5.1.
  3. הוסף 4 μL של transcriptase הפוך צינור PCR משלב 5.1.
  4. Re- להשעות תוכן בעדינות לעשות תערובת הומוגנית; צנטריפוגות בעדינות.
  5. מניחים צינור PCR המכיל את התערובת לתוך thermocycler. thermocycler לרוץ שעתוק לאחור: 1 מחזור של 25 מעלות צלזיוס (5 דקות), 42 ° C (30 דק '), 85 ° C (5 דקות) ולאחר מכן החזק על 4 מעלות צלזיוס. התוצר הסופי יהיה cDNA הרצוי.

6. ניתוח של תאים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)

  1. מכין את צלחת 96-היטב.
    1. מניחים את כל מרכיבי התגובה qPCR על הקרח: 1 μL cDNA, .25 פריימר קדימה מיקרומטר, .25 פריימר הפוכה מיקרומטר, 5 μL SYBR גרין, 3.5 מים כיתה μL PCR כדי בהיקף כולל של 10 μL. באמצעות SYBR הירוק, להכין תערובת הורים כדי להפעיל את כל דגימות בשלושה עותקים.
    2. לאחר לערבב מאסטר יושלם, מערבולת לעשות הומוגנית. Aliquot 9 μL של qPCR תערובת אמן לבאר כל צלחת 96-WLL. לאחר, בזהירות להוסיף 1 μL של cDNA לבאר כל אחד. עוצמת התגובה סך הכל יהפוך 10 μL.
    3. לאחר הטעינה הושלמה, לאטום צלחת 96-היטב עם אופטיסרט דבק צלחת 96-היטב בקצרה צנטריפוגות (50 XG דקות 1).
  2. דגימות מפעילים מכשיר Real Time-PCR. מניחים צלחת 96-היטב אטום לתוך מכשיר Real Time-PCR ודוגמאות לרוץ לפי המלצות היצרן המכשיר. דוגמאות של מחזורי רגיל ומהיר כלולות להלן.
    1. עבור הפרמטרים רכיבה רגיל, השתמש בנוסחה הבאה: denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 120 שניות, ואז 40 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ולאחר מכן החזק אופציונלי על 4 מעלות צלזיוס.
    2. עבור הפרמטרים רכיבה מהירה: השתמש בנוסחה הבאה: denaturation הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ואז 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 58 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, ולאחר מכן 72 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות.
  3. עיין במדריך מכשיר להדרכה כיצד לנתח נתונים.

ניתוח 7. Supernatants Cell ידי ELISA

הערה: כל הצעדים מבוצעים על פי הפרוטוקול של היצרן.

  1. לדוגמא הכנה
    1. לוותר 398 μL של diluent לתוך צינורות נפרדים. פיפטה 2 μL של המדגם supernatant התא לתוך הצינור diluent 398 μL. זה יספק קפל דילול של 200.
    2. חזור על שלב 7.1.1 עבור כל דגימה להיבדק.
  2. תהליך
    1. פיפטה 100 μL של פי 200 מדגם בדילול ורמה לתוך הבארות של צלחת 96-היטב.
    2. דגירת צלחת 96-היטב של 25 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על שייקר microplate ב 150 סל"ד.
    3. שטפו את בארות 5 פעמים עם פתרון חיץ לשטוף 1x. לאחר לשטוף האחרון הושלם, להסיר את כל הפתרון לשטוף שיורית עם נייר סופג.
    4. הוספת 500 μL של מגיב HRP-המצומד לבאר כל אחד.
    5. חזור על שלבי 7.2.2 - 7.2.3.
    6. פיפטה 100 μL של tetramethylbenzidine (TMB) מגיב לבאר כל צלחת 96-היטב.
    7. בעדינות מערבבים בצלחת 96-גם על 25 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על microplateשייקר ב 150 סל"ד. עצור את התגובה על ידי הוספת ישירות 100 μL של פתרון להפסיק היטב כל ומערבבים בעדינות. לאחר הפתרון להפסיק מתווסף הצבע צריך להפוך צהוב. זה מודיע כי הפתרון להפסיק כבר מעורבב כהלכה.
    8. באמצעות קורא צלחת microtiter, לקבוע את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר בתוך 5 הדקות הראשונות.
  3. חישוב התוצאות
    1. חישוב טבלת ערכים ספיגת הממוצע (450) עבור כל דגימה כל תקן.
    2. להרכיב עקומת סטנדרט ידי התוויית מתכוון 450 של כל תקן נגד ריכוז הסטנדרטי שלה ב ng / mL על גרף ליניארי. אפשר ציר x לייצג את הריכוז ואת ציר y לייצג 450 ערכים.
    3. ניצול מתכוון 450 מכל מדגם בדילול מלא, לקבוע את הריכוז של החלבון הרצוי ב ng / mL מעקום סטנדרטי.
    4. הכפל את הריכוז מדגם על ידי הדילול פקטוr. זה יאפשר לקביעת ריכוז בפועל של החלבון הרצוי במדגם supernatant התא.
    5. מגרש השולחן בנוי דגימות לתוך גרף קו. אם ערכי OD 450 ליפול מחוץ עקומת סטנדרט, דגימות צריך להיות מדולל כראוי ו-נבדק מחדש.
    6. נרמל תוצאות 500,000 תאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היסטולוגיה

נציג תמונות מיקרוסקופ האור של תאים מבודדים בתרבית ראשוניים מתוארות באיור 1A. ניתוח Immunocytochemical מוכיח כי hepatocytes מבודד מאוד להביע אלבומין (אדום) כמו גם הקולטן לגורם הצמיחה פיברובלסטים 4 (FGFR4) (ירוק). גרעינים מגואלים 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). (איור 1 ב).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בידוד hepatocytes העיקרי מעכברים הוא כלי מהיר, זול ואמין ללמוד תגובות דלקתיות vivo לשעבר. אם מבוצע כהלכה, יכול להיווצר תוצאות בקלות לשכפל מבעוד מועד וחסכוניים. הנקודות הבאות יש לבחון בזהירות כדי להבטיח בידוד מוצלח.

החתך כירורגית ואת cannulation של IVC צריכה להתבצע תחת הרדמה כללית ולא אחרי המתת חסד. חוקר צעיר, חסר ניסיון צריך יותר זמן בהתחלה כדי להכיר את התכונות אנטומיות של הבטן בעכברים ולבצע cannulation ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין מחברי ניגוד העניינים להכריז.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי NIH (R01HL128714 כדי CF) ו- (F31DK10236101 כדי KS) ואת איגוד הלב האמריקני (CF ו AG).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מסננת <חזקה>מתכלה
תאים מסננת 70 μ m מסננת תא ניילוןFalcon352350
BD Insyte AutoguardBD381412
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןFalcon352098
100 אפליקטורים עם קצה כותנה בגודל 6 אינץ' מזרק אינסולין פוריטני806-WC
1cc U-100 28 גרם 1/2בקטון דיקינסון329420
צלחת תרבית רקמות 100 x 20 מ"מ סגנוןקורנינג353003
6 בארות אשכול תרבית תאיםCostar3516
5/0 משי כירורגי קלוע שחור (100 יארד)LOOKSP115
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>ציוד
מיניפולס 3 משאבת זלוףגילסוןF155007
ערכות המציטומטר, פרופרVWR48300-474
משקפי כיסוי המציטומטר, פרופרVWR48300-470
מספריים כירורגיים - חד/קההFST14001-12
מספריים איריס-ToughCut ישרFST14058-11
דומונט SS-45 מלקחייםFST11203-25
מלקחיים לרקמות סטודנטיםFST991121-12
שםחברהמספר קטלוגיComments
Reagents חומצה אצטית חזקה>
חזקה, 2.0 Nסיגמא      A8976-100 מ"ל
איזופלורן, USP 250 מ"לPiramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1,000 מ"ג/10 מ"ל (100 מ"ג/מ"ל)VEDCO      50989-161-06
קסילזין 100 מ"ג/מ"להזרקת AnaSed139-236
Willams' Medium E (1x)gibco12551-032
Liver Perfusion Medium (1x)gibco17701-038
Liver Digest Medium (1x)Life Technologies17703034
תוספי הפשרה וציפוי ראשוניים של הפטוציטיםחייםCM3000
תוספי תחזוקה ראשוניים של הפטוציטיםטכנולוגיות חייםCM4000
מאגר פוספט מלח (PBS) pH 7.4ThermoFisher Scientific10010031
קולגן סוג 1קורנינג354236
תמיסה כחולה טריפןVWR45000-717
טכנולוגיות

מקורות

  1. Silverstein, D. M. Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease. Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).
  2. Isakova, T., et al. Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease. Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).
  3. Faul, C., et al. FGF23 induces left ventricular hypertrophy. J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).
  4. Gutiérrez, O. M., et al. Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis. N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).
  5. Munoz Mendoza, J., et al. Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD. Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).
  6. Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults. PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).
  7. Singh, S., et al. Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease. Kidney Int. , 1-12 (2016).
  8. Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).
  9. Moshage, H. J., et al. The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes. Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).
  10. Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. In vitro models for liver toxicity testing. Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).
  11. Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure. J Vis Exp. (79), (2013).
  12. Kegel, V., et al. Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells. J Vis Exp. (109), (2016).
  13. Moshage, H., et al. Cytokines and the hepatic acute phase response. J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).
  14. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  15. Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. LPS/TLR4 signal transduction pathway. Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).
  16. Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy. J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).
  17. Grabner, A., et al. Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy. Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).
  18. Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. Methods Mol Biol. 945, 287-302 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ELISAPCRLPSFGF23IL6CRP

מאמרים קשורים