הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

24 בפברואר 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

במאמר זה

סיכום

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תקציר

תוכנית התחדשות אנדוגני הוא שיזם גליה מולר של דג הזברה מבוגר (Danio rerio) הרשתית בעקבות נזקים עצביים ומוות. גליה מולר להזין מחדש את מחזור התא לייצר ובתאים עצביים העוברים סיבובים הבאים של חלוקות תא להתמיין לסוגי התאים העצביים האבודים. שתי גליה מולר ו תא אב עצבי גרעינים לשכפל DNA שלהם ועוברים מיטוזה ב מיקומים שונים של הרשתית, כלומר הם נודדים בין השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) ואת השכבה החיצונית הגרעינית (ONL), בהתאמה, בתהליך המתואר Interkinetic הגירה גרעינית (INM). INM נחקרה בעיקר ברשתית מתפתחת. כדי לבחון את הדינמיקה של INM ב מבוגר התחדשות רשתית דג זברה בפירוט, הדמית תא החי של גליה fluorescently שכותרתו מולר / ובתאים עצביים נדרשה. כאן, אנו מספקים את התנאים לבודדי רשתיות הגבו תרבותמ Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 שנחשפו אור חזק מתמיד במשך 35 שעות. כמו כן, אנו מראים כי בתרבויות רשתית אלה הם קיימא לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאים, רכישה ברציפות Z- מחסנית תמונות ברחבי העובי של explant הרשתית עד 8 שעות באמצעות מיקרוסקופ multiphoton לפקח על התנהגות הנדידה של GFAP: nGFP תאי -positive . בנוסף, אנו מתארים את הפרטים לבצע ניתוח הדמיה פוסט כדי לקבוע את המהירות של INM apical ואת הבסיס. לסיכום, הקמנו תנאים כדי ללמוד את הדינמיקה של INM במודל בוגרת ההתחדשות הנוירונים. זה יקדם את הבנתנו בתהליך הסלולר המכריע הזה ולאפשר לנו לקבוע את המנגנונים השולטים INM.

מבוא

בניגוד לבני האדם, דג זברה (Danio rerio) תערוכת תגובת התחדשות חזקה על מוות של תאים של נוירונים ברשתית 1, 2, 3, 4. Α גורם גידול הנימק, מולקולת איתות כי הוא שוחרר מהמוות נוירונים ברשתית גורמת גליה מולר המתגוררת השכבה הפנימית גרעין הבסיס (INL) של הרשתית, להתרבות 5 ולייצר ובתאים עצבים ממשיכים להתרבות לפני ההבחנה לתוך התאים העצביים סוגים כי מת 2, 3, 4. בשלב השגשוג של תגובת ההתחדשות, הגרעינים של גליה מולר ו ובתאים העצביים הנגזרות מהם לעבור דפוס נודד חוזר בשלב עם מחזור התא (ההגירה הגרעינית Interkinetic, INM) 6 >, 7. גרעינים מיקומו של INL הבזליים לשכפל DNA שלהם לפני המעבר לשכבה החיצונית גרעיני (ONL) שבו הם מחלקים לפני הגרעינים הנובעים לחזור basally אל INL. תהליך זה תואר לראשונה במהלך התפתחות neuroepithelial בשיטות היסטולוגית, תוך גישות הדמית תא חי מאוחר יותר אשרו את הפרשנות על ידי סואר 8, 9, 10, 11, 12. שתי הגישות הדמיה histochemical ולחיות תאים שימשו כדי לקבוע המנגנונים INM ותפקודו בפיתוח neuroepithelia כולל הרשתית 9, 11, 12, 13. עם זאת, המנגנונים השולטים INM ב המבוגר התחדשות הרשתית לא נחקרו בפירוט רבXref "> 6, 7. הדמיה של תא חי תהיה גישה לא יסולא בפז כדי לקדם את הידע שלנו של מסלולי איתות השולטים INM ברשתית התחדשות מבוגר.

עד לאחרונה, הדמית תא החי של INM ברשתית הוגבלה או עוברי דג זברה לחיות או חומוס עוברי או עכבר לאחר לידת explants רשתית 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16. בעוד explants רשתית מחיות בוגרת מגוון של מינים, כוללים עכבר, חולדת דג זברה כבר נוצל עבור תאים שונים גישות ביולוגיות 17, 18, 19, 20, ניסויי הדמיה לחיות תאים באמצעות חה explants הרשתיתve הוגבלה לתדרך את פרקי הזמן בהם ולא הוצאו להורג באופן רציף ולאורך כמה שעות 21, 22. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט כדי רשתית דג זברה מבוגרת אור פגוע התרבות לבצע ניסויי הדמיה לחיות תאי INM ניטור באמצעות מיקרוסקופ רב פוטון 6. גישות הדמיה תאים חיים הם יתרון על פני שיטות immunohistochemical כאשר חוקרים את מנגנוני השליטה INM, הדינמיקה של INM, למשל, מהירויות עלול להיפגע במקום המיקום של מיטוזה, אשר באופן פוטנציאלי לא יהיה מזוהה באמצעות immunocytochemistry.

בעתיד, בשיטה זו יש גם פוטנציאל להיות שונה כדי לחקור תהליכים דינמיים אחרים במהלך רגנרציה רשתית, כגון phagocytosis למות קולטני האור על ידי גליה מולר או התנהגות של שריר כלשהו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: דג הזברה הועלו ומתוחזק במתקן דג הזברה נוטרדאם במרכז מדעי החיים פריימן. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מאושרים על ידי האוניברסיטה של ​​טיפול בבעלי חיים נוטרדאם ועדת שימוש ונמצאים עמידה הצהרה לשימוש בבעלי חיים למחקר חזון ידי האגודה לחקר חזון עיניים.

1. פתרונות

  1. כן אתנול 70% לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה וכל ציוד / חומרים כימיים המועברים לתוך מכסה המנוע בתרבית הרקמה.
  2. הוסף 2 מ"ל של 2-phenoxyethanol עד 1 ליטר של מים מערכת (1: 500 2-phenoxyethanol).
  3. הכן 0.1 מ"מ NaHCO 3, pH 8.0. השתמש מזרק 10 מ"ל ומסנן מזרק 0.2 מיקרומטר נקבוביות בגודל כדי לעקר את הפתרון במנדף בתרבית רקמה מעוקרים.
    הערה: 3 NaHCO משמש להפיץ את דבק תאים ורקמות ביעילות על פני השטח coverslip של fluorodishes (ראהצעד 3.2).
  4. כן 1.0 M CaCl 2 ו 1.0 M MgCl 2. לעקר עם מזרק 10 מיליליטר ו 0.2 מיקרומטר מסנן מזרק נקבובי בגודל במנדף בתרבית רקמה מעוקר.
  5. כדי להכין Hank's מאוזן מלח פתרון (HBSS), להוסיף סטרילי CaCl 2 וסטרילי MgCl 2 עד 1x HBSS ללא Ca 2 + / Mg 2+, ללא פנול אדום בריכוז סופי של 1 מ"מ כל אחד. עבודה בסביבה סטרילית.
  6. כדי להכין מדיום תרבות, לערבב 50% 1x המינימום ההכרחי בינוני (MEM) ללא פנול אדום, 25% HBSS המכיל CaCl 2 ו MgCl 2 (ראה סעיף 1.4), 25% סוס סרום (HS), 10 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -10 סטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל. עבודה בסביבה סטרילית.
    הערה: הימנע בינוני המכיל פנול אדום כפי שהוא autofluoresces, ובכך להשפיע אות יחס רעש. 23
  7. הכן 10 מ"ל של נקודת התכה נמוכה agarose 1% ב 1x MEM ללא פנול אדום. ממיסים agarose / 1x MEM באמצעות למיקרוגליםave. כן בנפחים קטנים של agarose (למשל, 10 מיליליטר) כמו reheating החוזרת ישתנה ריכוזי יון עקב התאדות נוזלת.
  8. לפני culturing, לעקר צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ידי מעוקר.

פרדיגמה אור-נזק 2.

  1. הסתגלות כהה
    1. מניחים 2 - 3 Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 (או דג הזברה מהונדס אחרים בעלי עניין) בשעה 6 - 14 חודשים של גיל לתוך סביבה נטולת אור במשך 14 ד. לפרטים נוספים ראה התייחסות 2, 6, 24, 25.
  2. מקם את המכל המכיל 2 - 3 דג זברה מהונדסת מותאם כהה במי מערכת בין שתי מנורות פלורסנט אשר פולטות אור של 2,800 לוקס 2, 6, 24, 25.
  3. לחשוף דג זברה לאור מתמיד אינטנסיבי במשך 35 שעות. במהלך החשיפה לאור, להבטיח כי טמפרטורת המים נשמרת בין 31 - 33 ° C.

3. הכנה עבור Culturing (ביום של בידוד רשתית)

  1. באמצעות אתנול 70%, לעקר את מכסה המנוע בתרבית רקמה ואת הרכיבים / כלים מועברים לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה (למשל, צלוחיות המכילות MEM ו HBSS, טפטפות, טיפים פיפטה סטרילית, וכו.).
  2. הכנת fluorodishes
    1. Fluorodish המעייל אחד לכל רשתית עם תא דבק רקמות (ראה טבלה של חומרים).
    2. לדלל את הדבק תאים ורקמות של 0.1 מ"מ NaHCO 3 לריכוז סופי של 70 מיקרוגרם / מ"ל, להוסיף 50 μL לכל fluorodish ולהפיץ את הפתרון על פני במרכז fluorodish עם קצה פיפטה 200 μL (כ 1 - 1.2 ס"מ קוטר ).
    3. דגירה fluorodishes מצופה 1 - 3 שעות ב RT; (לחילופין, דגירה O / N ב 4 ° C).
    4. הסר את הפתרון ולשטוף 3x עם 500 μL של 1x MEM עבור כל שטיפה. כדי למנוע את fluorodishes מצופה מהתייבשות, לשמור אותם MEM עד explants הרשתית הם רכובים.
  3. כן בינוני תרבות כמתואר בשלב 1.6. בינוני התרבות ניתן לאחסן עד 1 שבוע ב 4 ° C.

בידוד 4. Culturing של Explants רשתית

הערה: פרוטוקול המפורטים להלן עבור בידוד של הרשתית הגבי, שבו הוא האזור ברשתית כי הוא lesioned בעיקר על ידי הפרדיגמה אור הנזק המתואר. לכן, התפשטות-induced נזק והאירוע הקשורים ההגירה גרעיני interkinetic להתרחש ברשתית הגב. עם זאת, הליך הבידוד ניתן להתאים להניב אזורים ברשתית בהתאם לדרישות הספציפיות של השאלה החוקרת / מחקר.

  1. להרדים אחד דג זברה מהונדס אור פגוםזמן ת"א 1: 500 2-phenoxyethanol.
  2. הסר MEM מ fluorodish אחד עם טפטפת 1,000 μL כך שכבה דקה בלבד של שרידי נוזל.
  3. מעביר את דג הזברה על מגבת נייר יבשה, להסיר את העין עם זוג מעוגל של מלקחי דומון (מלקחיים # 5, 45 ° זווית) ולהעביר אותו על fluorodish.
  4. שימוש סטראו, כוון את העין עם התלמיד על להחליק את המכסה של fluorodish כך שהחלק האחורי של העין עם עצב הראייה גלוי (איור 1D).
  5. עם זוג מספריים מקפרסון-Vannas להסיר את עצב הראייה, חיתוך קרוב לחלק האחורי של העין. בנוסף, להסיר רקמת חיבור רירי החיצונית של העין.
  6. החזק את העין בין האף שלה ואת הצד זמני עם זוג # 5 מלקחיים תוך ביצוע חתך בבית הגבעול האופטי על ידי פירסינג עם להב מספריים אחד דרך cribrosa lamina והחיתוך לאורך שני אף צדדים זמניים של העין (ראה האיור 1E , li מפולחיםne).
  7. באמצעות שני זוגות # 5 מלקחיים, אחד מחזיק את הצד הגבי של הרשתית ואת הזוג השני להפריד את הגחון מהרשתית הגבה, למשוך את הרקמות.
    הערה: רצוי לכוון את הרשתית הגבה כך שהעדשה ואת שכבת תא גנגליון להתמודד עם coverslip בעוד בלובן העין פונה מעלה.
  8. הסר את בלובן העין מהרשתית הגב עם זוג אחד של # 5 מלקחיים, תוך כדי לחיצה על עדשה מחוברת הרשתית עם זוג נוסף של # 5 מלקחיים (איור 1H, I).
  9. כדי להסיר את העדשה, להשתמש במספרי מקפרסון-Vannas לחתוך מאחורי העדשה ללא פגיעה ברשתית (איור 1 ט, י). לפעמים, העדשה מפרידה בשלב 4.7. במקרה זה, הסר את בלובן העין בזהירות עם מלקחיים על ידי החזקת הרשתית בכל קצה לחתוך עם זוג נוסף של מלקחיים 5 #.
  10. הסר את הזגוגית תוך הסרת העדשה ללא פגיעה ברשתית. שטחו את הרשתית עם שכבת תא גנגליון מול להחליק את המכסה של fluorodish (איור 1 ליטר, ז).
  11. הקף הרשתית עם 10 μL של נקודת התכה נמוכה agarose 1% ולתת לחזק את agarose.
  12. Watch כי agarose הנוזל אינו להרים את הרשתית כמו גם מעלה קל עלול להשפיע על היכולת להתמקד עמוק לתוך הרקמה. אם הרמת הוא ציין, להשתמש פיפטה להסיר agarose. תן סט agarose שיורית לפני שתנסה להוסיף יותר.
  13. 4.12 כמה פעמים חזור על שלב לפני הוספת 1% התכה נמוכה נקודות agarose לכיסוי fluorodish כולו. לאחר agarose יש הקרושה, להוסיף 1.5 מדיום תרבות מ"ל.
  14. שמירה על תרבות explant הרשתית בסביבת 5% CO 2 / אוויר הקבוע ל 32 מעלות צלזיוס למשך כ 12 שעות כדי לאפשר הרשתית להתאושש מן הלחץ שנגרם הליך הבידוד. כוונו את הטמפרטורה ל -32 מעלות צלזיוס לשמור הרשתיות באותה טמפרטורה כמו דג הזברה אור שטופלו (ראה שלב 2.3).

5. מיקרוסקופיה multiphoton

s = "jove_content"> הערה: הניסויים שבוצעו בכתב היד הזה היו אופטימיזציה עבור מיקרוסקופ multiphoton מצויד לייזר אינפרא אדום (ראו טבלה של חומרים), טבילה אובייקטיבי מים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15), סורק גלונומטר ו בתא סביבתי המכיל אינסרט במשך ארבע 35 מ"מ צלחות פטרי. התמונות נרכשו עם גלאים הלא descanned (R-NDD).

  1. לפני הדמיה, לאזן את בתא סביבתי להשיג אווירה 5% CO 2 / אוויר. ודא כי כלים ריקים פטרי מוכנסים לתוך מחזיק כדי למנוע דליפה של גז אל תוך החדר.
  2. הפעל את מערכת מיקרוסקופיה.
  3. לאחר בתא הסביבתי הוא equilibrated, להוסיף נוזל מקדם שבירה על מטרת טבילה במים למרחקים ארוכים 40X Apo (NA 1.15).
    הערה: הנוזל מקדם השבירה עם תכונות אופטיות דומה למים משמש כדי למנוע אידוי של מים במהלך ההדמיה לטווח ארוך.
  4. שפעת מקוםorodishes עם explants רשתית לתוך התא. באמצעות אור brightfield, מקם את הדגימה לתוך נתיב האור ולהביא את midregion של הרשתית הגבה לתוך המטוס של מוקד.
  5. השתמש אור GFP epifluorescent להתמקד GFAP: nGFP -positive גרעינים גליה מולר (איור 2 א, ג).
    הערה: אם explants הם לא מקובעים שטוח או שנצברו agarose תחת explant, זה יהיה קשה להתמקד על GFAP: nGFP -positive גרעינים או שהם יהיו לזרוח באור עמום.
    1. בדקו אם לעבור לאזור אחר בתוך אותו explant הרשתית תצליח להתגבר על בעית ההתמקדות. אחרת לעבור explant רשתית שונה.
  6. בתוכנה רכישת התמונה, פתח את 'GUI MP A1', את 'TiPad', את 'GUI קומפקט A1' והחלונות 'ND הרכישה ". עבור הדמיה multiphoton, ודא שהאפשרות 'IR NDD "נבחר ב" GUI קומפקט A1.
  7. בשנות ה settinשדה 'ז, בחר IR-DM עבור המראה dichroic -1 ולבחור את מסנן מעביר פס 525/50 לרכוש GFP הקרינה.
  8. הפעילו את לייזר IR בחלון שכותרתו 'A1MP GUI'. זה ייקח כמה דקות עבור לייזר כדי להיות מוכנים. קבע את אורך הגל עד 910 ננומטר לרגש GFP הקרינה וליישר את הלייזר על ידי לחיצה על כפתור "Auto יישור 'בחלון' A1 MP GUI '.
  9. ודא כי אורות בחדר וציוד כבויים או מכוסים לפני פתיחת התריס ב 'GUI MP A1 "כדי להימנע מחשיפת יתר של הצינור המכפיל. כדי להפחית את רמות הרעש, לשכן המיקרוסקופ בסביבה חשוכה.
  10. לרכוש תמונות של שדה הראייה של 300 x 300 פיקסלים, בכל הזום של שני, ועת הדירה פיקסל של 4.8 מיקרו-שניות / פיקסל. בערך להגדיר את כוח לייזר על ידי שינוי 'באזור רכישת' ב 'GUI A1MP' ורווח בחלון 'GUI קומפקט A1.
  11. הגדרת Z- מחסנית
    1. דגש על שכבת תא גנגליון להגדיר את מישור המוקד העליון של מחסנית z ב 'z'-subwindow בתוך "חלון ND הרכישה". חלק GFAP: תאי -positive nGFP בדרך כלל ממוקמים בשכבת תא גנגליון, אשר מסייעת לזהות את מגבלת הבסיס של הרשתית (איור 2 א, ד).
    2. הזז את המטוס מוקד דרך הרמה של ONL (איור 2 א ', ב'), אשר מאופיין על ידי הנוכחות של GFAP שכותרתו במעומעם: תאי -positive nGFP כי ביחס עגול מוגדל כדי עמיתיהם INL (איור 2 א, ג) .
    3. הגדר את המטוס הזה כמו החלק התחתון של Z- מחסנית. ודא כי ONL כולו יהיה צלם (איור 2 א ', ב').
    4. כאשר חווים מוקדי משמרות המטוס שדורשים מחדש התאמת בתקופת הדמיה, לחץ פעמיים על המיקום הבינוני subwindow 'z' כדי להקצות אותו כעמדה "הביתה". שינוי ל 'במצב סימטרי מוגדר'ולחץ "יחסים".
    5. הגדרת גודל z-צעד בין 0.7 כדי 1 מיקרומטר.
  12. תיקון Z בעצימות:
    1. החל תיקונים z בעצימות כדי לפצות על אובדן של עוצמת פיקסל בשל פיזור אור כאשר הדמיה בשכבות העמוקות של רקמות.
    2. כדי להגדיר את התיקון, לפתוח את החלון 'Z-עוצמת תיקון'. כדי להגדיר את 'טווח Z- מחסנית', בחר 'מאת ND'.
    3. הקישו על המטוס התחתון מוקדי בחלון 'Z-עוצמת התיקון "(במקרה זה, תואמת את שכבת תא גנגליון) ולהגדיר את עוצמת הלייזר (" אזור הרכישה' ב 'GUI A1MP') ורווח (GUI קומפקט A1 ).
    4. לחץ על החץ שליד 'ערכי z-' בחלון 'Z-עוצמת התיקון "כדי לאשר את ההגדרות לאחר מכן מוצגות תחת' הגדרות מכשיר 'בחלון' Z-עוצמת התיקון" עבור המטוס שנבחר המוקדים.
    5. חזור על התהליך עבור האמצעמטוסים העליון nd, הגדלת כוח ורווח לייזר. ניתן להוסיף מטוסים מוקד נוסף במידת הצורך. ראה טבלה מס '1 עבור הגדרות לייזר ורווח ספציפיים לניסויים איורים 2 - 4.
    6. הגדר את 'אזור הרכישה' בחלון 'GUI MP A1. הימנע בחירת שטח רכישה גדול מ -15 ונרשם רווח גבוה יותר מאשר 126 בתחילת ההדמיה לעקוף photobleaching וגדילת רמות רעש.
      הערה: ככל לייזרי צינורות מכפילים שונים בין מערכות מיקרוסקופיה, ליזר מבחן והגדרות רווח כדי להשיג תנאי הדמיה אופטימליים עבור מיקרוסקופ להגדיר תוך הימנעות photobleaching.
    7. בחר 'תיקון עצמה יחסי' בחלון 'Z-עוצמת התיקון'.
  13. בשנות ה subwindow 'סדרות עתיות' בחלון 'ND רכישת', לקביעת משך 8 שעות ואת המרווח ל 'ללא דיחוי'. לאחר מכן, הקפד ללחוץ על 'Z-תיקון הפעל' ב t"Z- מחסנית" הוא חלון משנה על הכפתור בחלון 'ND רכישת' לרכוש את סדרות עתיות 3-D.
  14. שמור explants רשתית בטמפרטורה של 27 - 29 מעלות צלזיוס לאורך כל תקופת רכישה של תמונה.
  15. במשך כל תקופת רכישת התמונה, במידת הצורך, להתאים מחדש את רמת כוח ורווח על מנת לשמור על איכות תמונה לניתוח שלאחר הדמיה. לקבלת התאמות לבצע שלבים 5.11.2 - 5.11.4.
  16. אם משמרות מישור המוקד, להשהות או להפסיק את הריצה ולבצע צעד 5.11 שוב.
    הערה: אם 'ביחס z-תיקון' נבחר בשלב 5.12.7 ו 5.11.4 צעד בוצע זה לא אמור להיות צורך להתאים מחדש רמות כוח והרווח, אלא אם photobleaching הנרחב התרחש.

6. ניתוח של מהירות

  1. חלץ את הזמן, הגדרת "אזור של אינטרס 'על התמונה. השתמש בכלי 'זמן המדידה' ולייצא את ערכי הזמן לגיליון אלקטרוני.
  2. חיתוך באזור המכיל dividing GFAP: גרעין -positive nGFP.
  3. בחר את האזור החתוך כך שהוא מכיל לפחות גרעין אחד אינו עובר INM כדי להגדיר נקודת התייחסות לאחר מכן למדוד את המרחקים כי הגרעין המפריד הגר ביחס INL הבזליים. הערה: כדי לבחור הגרעין שנשאר INL בסיס, הוא עוזר להכין שחזור 3-D של סדרות עתיות.
  4. לחלופין, אם GFAP: תא -positive nGFP הוא ציין ONL לאורך כל תקופת הרכישה, להשתמש בקו אנכי באורך קבוע פורש מהגרעין ONL אל INL הבסיס כדי לזהות נקודת התייחסות.
  5. באמצעות הפונקציה "להראות פרוסות נוף ', ליצור תחזיות מאונכות. בהמשך לכך, לשנות את מצב מ 'פרוסה' ל 'הקרנת העוצמה המקסימלית.
  6. להשבית את תצוגת 'XY' של הקרנת מקסימלית המאונכת. בהתאם לכיוון שבו גרעין הנודדות / חלוקת גלוי טוב,הסימפונית לכבות גם את 'xz'- או' yz'-נוף.
  7. לחץ על התמונה הנותרים עם הכפתור הימני של העכבר ולחלץ את סדרת דימוי yz' עם '' XZ 'או מסמך חדש צור מעין זו'. במידת הצורך, לסובב את התמונה.
  8. שימוש בפונקציה 'המדידה ידנית', למתוח קו אופקי על פני התמונה ברמה התחתונה של הגרעין שנשאר INL הבסיס, ואינו עובר INM (= נקודת התייחסות; איור 4 א - E, קו אופקי אדום).
  9. למדוד את המרחק בין קו ההפניה ואת נקודת הבסיס של הגרעין הנודד עבור הסדרות עתיות שימוש באפשרות 'קו המדידה' בתוכנת הניתוח (ראה איור 4 א - ה).
  10. לאחר מעטפת הגרעין מתפרקת, למדוד את מיקום הבסיס של סומה אם הוא בא, המאפשר זיהוי דיפוזיה של GFP לתוך התא כולו.
  11. באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני, העלילה מרחוק נוcleus היגרו נגד הזמן חלף (איור 4F).
    1. כדי לקבוע את מהירות העברת הפסגה (נ א), גרף המרחקים נסעו לתקופה לפני התמוטטות מעטפת הגרעין מתרחשת (איור 4G).
    2. בחר בסדרת הנתונים בתוך התרשים, לחץ לחיצה ימנית על העכבר וכנס עקום רגרסיה ליניארית כולל 'y = mx + ג' הפונקציה המתאימה. השיפוע 'm' בפונקציה מייצג את המהירות, נ א (איור 4G).
    3. חזור על שלבי 6.11.1 ו 6.11.2 עבור השלב הראשון של גירת הבזליים מהירה כדי לקבוע את מהירות העברת הבסיס, ב נ (איור 4H).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבידוד של הרשתית על פי ההליך המתואר ב סכמטית באיור 1 מאפשר culturing של הרשתית הגבי בברוטליות ממבוגר אור פגועי Tg [GFAP: nGFP] דג הזברה mi2004 על פני תקופה של 24 שעות לפחות ב 5% CO סביבת 2 / אוויר. שטוח הרכוב אלה explants הרשתית ניתן להשתמש כדי מטוסי מוקדי תמונה ברמות רקמות עמוקות. דוגמה לכך היא גליה מולר / גרעיני תאים ובתאים עצביים שכותרתו עם GFP מן GFAP אמרגן גליה ספציפית מולר (גלי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מחקרים חוקרים את המנגנונים השולטים התחדשות של המבוגר הפגום רשתית דג זברה בעיקר שיטות immunocytochemical משומשות 5, 25, 26, 27, 28, 29, 30. קביעת תנאים כדי explants תרבות ברשתית לבצע הדמיה תא חי על תופעות, כגון INM, לספק לנו טכניקה להשיג לעומק מרחבית מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

אנו מעריכים את התמיכה שמספקת ויליאם ארצ'ר ואת מתקן ההדמיה המשולבת נוטרדאם. תודה מיוחדת מופנים הטכנאים מדעי החיים פריימן לעזרה רציפה שלהם וטיפול בבעלי שלהם של דג הזברה. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין של NIH כדי DRH (R01-EY018417, R01-EY024519) והמרכז דג הזברה מחקר, אוניברסיטת נוטרה דאם, נוטרה דאם, IN.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מלקחיים של Dumont #5מכשירי דיוק עולמיים14098
מלקחיים של Dumont #5, 45° זוויתמכשירי דיוק עולמיים14101
מספריים McPherson-Vannasמכשירי דיוק עולמיים501233
מכשירידיוק עולמייםFD35-100
סטריאומיקרוסקופNikon SMZ-1Bסוג דומה של סטריאומיקרוסקופ דיסקציה יעבוד
ארון בטיחות ביולוגי סוג A2Labconcoסוג שווה ערך יעבוד
חממת תרבית רקמותתרמו-מדעיתHEPA-class 100סוג שווה ערך יעבוד
מנורות פלורסנט סילבניה OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 ומיקרו; מסנן מזרק Acrodisc בגודל נקבוביותm VWR4192
10 מ"ל מזרק Luer-lokVWRBD309604
60 מ"ל מזרק Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3FischerScientificS233-500
CaCl2ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS w/o Ca2+/Mg2+, ללא פנול אדום, GibcoThermoScientific14175-095
MEM עם פנול אדום, GibcoThermoScientific5100-038
סרום סוסים,ThermoScientific26050-070
פניצילין/סטרפטומיציןVWR16777-164
נקודת התכה נמוכה אולטרה-טהורה agaroseThermoScientific16520-100
אתנול, מוחלטThermoScientificBP2818-4
2-פנוקסיאתנולסיגמא77699
תאי קורנינג Cell-Tak ודבק רקמות VWR354240
נוזל מדד שבירה Cargille Lab1803Y
מיקרוסקופ מולטיפוטון Nikon A1 המצויד בלייזרמערכת מקבילה לניקון תעבוד
40X Apo מטרת טבילה במים למרחקים ארוכים (NA 1.15)
תא סביבתי מצויד בתוספת ל-35 מ"מ פטריצ'ישיםמערכת שווה ערךOkolab
תוכנתניתוח NISניקון
אינפרא אדום MaiTai תעבוד

מקורות

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

נדידה גרעינית בין-קינטיתתרבית של נתחי רשתיתרשתית דגי zebrafishסימון GFAP:nGFPרכישת Z-stackקיבוע ב-FluoroDishהטמעה באגרוזמדידת מהירות
תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.