מאמר שיטה

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

DOI:

10.3791/55357

⸱

18 ביולי 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות היתרונות של תחולה קלה ויעילות עלות, מודלים עכברי תת עוריים יש מגבלות חמורות לא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר Orthotopic כבר הציג להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים אלה הם תובעניים מבחינה טכנית, במיוחד איברים חלולים כגון המעיים הגדולים. כדי לייצר גידולים אחידים אשר לגדול באופן אמין גרורות, טכניקות סטנדרטיות של הכנת תאים סרטניים הזרקה הם קריטיים.

פיתחנו מודל עכבר אורטוטופי של סרטן המעי הגס (CRC), אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. תאים סרטניים משני גידולים ראשוניים, תאים דו מימדיים (2D) או תאים תלת מימדיים (3D) מוזרקים לתוך cecum, בהתאם לפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים מוזרקים, יוצרים גידולים גרורתיים מאוד. בנוסף,CTCs ניתן למצוא באופן קבוע. אנו מתארים כאן את הטכניקה של הכנת תאים סרטניים משני שורות תאים דו-ממדיים ואורגנואידים תלת-ממדיים, כמו גם ברקמת הגידול הראשית, טכניקות ההזרקה וההזרקה, כמו גם בידוד של CTCs מן העכברים הנושאים גידולים, ומציעים עצות לפתרון בעיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות סרטן במדינות מערביות. 1 בעוד הגידול הראשוני יכול לעיתים קרובות להיות resected, את התרחשות גרורות רחוקות באופן דרמטי מחריף את הפרוגנוזה ולעתים קרובות מוביל למוות. 2 , 3 מתאם ביולוגי של גרורות הוא מחזורי תאים סרטניים, אשר לנתק מן הגידול, לשרוד במחזור, לצרף את אפיתל באיבר היעד, לפלוש לאיבר ובסופו של דבר להתגבר על נגעים חדשים. 4 למרות שמדובר בחומר CTC ידוע בעל רלוונטיות פרוגנוסטית, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 הביולוגיה שלהם מובנת חלקית רק כתוצאה מן הנדירות הקיצונית שלהם ב- CRC. 10

מודלים עכבר הם לא חזקOol ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של סרטן. מודלים קלאסיים, תת עוריים מיוצרים על ידי הזרקה תת עורית של תאים סרטניים לעכברים הנמענים, אשר יכול להיות גם immunocompetent (אם תאים סרטניים Murine syngeneic משמשים) או immunodeficient. מודלים גידול תת-עוריים הם זולים ומייצרים נתונים במהירות; צמיחת הגידול של נקודת הסיום שלהם יכולה להיות נמדדת בקלות ובלא פולשניות. עם זאת, 88% של תרכובות חדשות שהפגינו פעילות אנטי-סרטנית במודלים כאלה נכשלות בניסויים קליניים. 11 זה בחלקו בשל הבדלים בין בני-אדם בין עכברים לעכברים; עם זאת, חלק גדול של כישלון זה נובע ערך מנבא נמוך של מודלים עכבר תת עורית.

מודלים עכבר Orthotopic, שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך איבר המוצא ובכך לגדול microenvironment המקורי שלהם, ולכן משמשים יותר ויותר במחקר סרטן. 11 , 12 , 13 , 14 מודלים אורתופטיים לא רק לדמות את התנאים גידול הגידול המקומי; כתוצאה מהאתר האנטומי של גידול הגידול, מודלים של עכבר אורטוטופיים מאפשרים גם סימולציה מציאותית של גרורות, ולכן הם משתמשים כדי לחקור את הביולוגיה של CTC 8 , 15 , 16 או את תגובתם לטיפולים שונים ב- CRC. 13 , 17

החיסרון העיקרי של מודלים עכבר אורתוטופיים היא המורכבות הטכנית שלהם. בהתאם האיבר שבו תאים להיות מוזרק, עקומת למידה עד הנסיין הוא מסוגל לגדל גידולים לשחזור הוא ארוך למדי. זה במיוחד חל על מודלים של סרטן המעי הגס, כמו תאים סרטניים צריך להיות מוזרק לתוך דופן המעיים, אשר לעתים קרובות התוצאות ניקוב, דליפת תא הגידול או הפסד endoluminal תא הגידול. זהRticle מיועד לתאר את השיטה של ​​הכנת תאים דגימות רקמה ראשונית, שורות תאים 2D ותרבות אורגנואידית 3D הזרקתם לתוך cecum של עכברים. הטכניקה המתוארת כאן מוביל לגידולים אחידים מאוד, בהתאם לביולוגיה הגידול של קו התא המשמש להזרקת, היווצרות של גרורות מרוחקות ו CTCs בעכברים הנמען. 15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בבעלי חיים שהוצגו כאן נבדקו באופן עצמאי והותר על ידי מוסד וועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ונערכו על פי הנחיות הפדרציה של המעבדה למדעי בעלי חיים (FELASA). כל האמצעים האפשריים נלקחו כדי למזער את הסבל כולל הרדמה ומשכך כאבים או, אם יש צורך, המתת חסד מוקדמת.

1. הכנת תאים ואורגנואידים

הערה: השתמש בנפח של 20 μL עם 100,000 תאים עבור כל זריקה. השתמש במטריצה ​​קרום במרתף (BMM) על מנת למנוע דליפה ו להבטיח הזרקת סטנדרטי. על מנת להבטיח תוצאות לשחזור, לנהל מבחני אימות קו התא ( למשל , באמצעות פרופיל STR) במרווחי זמן קבועים.

  1. הכנת השעיות תא ראשוני מ רקמות טריות
    הערה: תמיד לעבוד בתנאים סטריליים. העברה מיידית של טרירקמות resected מחדר הניתוח למעבדה על הקרח נדרש כדי להבטיח את הכדאיות של התאים.
    רווחת המטופל והטיפול המיטבי חייבים להיות תמיד העדיפות הראשונה. לכן, דגימות רקמות למחקר חייב להתקבל באופן שאינו מפריע לעבודת הפתולוגי שלאחר מכן ובימוי של הגידול resected. ברוב המקרים, לכן סביר לקבל את דגימות למחקר שהושג על ידי הפתולוג מאומן על מנת להבטיח אי-הפרעה עם האבחון הפתולוגי.
    1. מיד לאחר הסרת סטרילית מן הדגימה resected (אידיאלי ~ 1 ס"מ 3 ), במקום מדגם רקמות בצינור 50 מ"ל מראש מלא עם 20-30 מ"ל של מלוחים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). חנות הצינור על הקרח ולהעביר את המעבדה מיד.
    2. שים את הרקמה בצלחת פטרי לשטוף אותו פעמיים עם הרבה PBS כדי להסיר את הדם הנותר.
    3. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (~ 2-4 מ"מ) עם scaLpel ( לדוגמה , עם להב מס '20 או # 36).
    4. השתמש דיסוציאטור על פי הוראות היצרן על מנת לנתק עוד את רקמת הגידול אל ההשעיה תא בודד. לחלופין, להשתמש בפרוטוקולים אחרים של עיכול הגידול האנזימטי.
    5. ספירת התאים של ההשעיה תא בודד וכתוצאה מכך ( למשל , בדלפק coulter או hemocytometer).
    6. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    7. Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.
  2. הכנת שורות תאים להזרקה
    1. לגדל את כל שורות תאים סרטניים המעי הגס תחת תנאים קולטורינג סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) ולהכין אותם ביום הניתוח.
    2. קציר התאים על פי תקן פרוטוקולים תרבות התא, לספור את התאים ( למשל , ב coulter הדלפק או hemocytometer) ולחשב את reqUired כמות עבור כל זריקות בהתאם למספר בעלי חיים להיות מוזרק.
    3. הכן 3-5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה.
    4. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 גרם) לשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    5. Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.
  3. הכנה אורגנואידית
    הערה: כל התרבויות האורגנואידים 3D גדלים בתנאים רגילים culturing (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). פרוטוקולים מפורטים לתרבות אורגנואידית פורסמו לפני כן. 18 , 19 , 20 בדומה שורות תאים קונבנציונאלי, אנו ממליצים נפח של 20 BMM μL עם 100,000 תאים לכל הזרקת. האורגנואידים מוכנים ביום הניתוח כדלקמן:
    1. הכן את המדיום הבא (בהפניה הבאהכדי DMEM / F12 + +): מתקדם Dulbecco השתנה בינוני של הנשר (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% גלוטמין (200 מ"מ) + 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
    2. טרום מילוי צינורות 15 מ"ל עם 1 מ"ל DMEM / F12 + +.
    3. בזהירות לשאוב את האורגנואים מפני השטח של צלחת התרבות ולהעביר את התוכן של 3 עד 5 בארות לתוך צינור 15 מ"ל אחד.
    4. בזהירות לשבור את organoids לתוך חתיכות קטנות יותר על ידי pipetting אותם למעלה ולמטה עם פיפטה זכוכית ממושכת.
    5. הוסף 5 מ"ל DMEM / F12 + + אל הצינור, ואחריו צנטריפוגה ב XG 1000 במשך 5 דקות.
    6. לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, resuspend גלולה ב 600 μL חיץ דיסוציאציה μL ולהעביר את ההשעיה היטב אחד של צלחת 6-היטב.
    7. דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות ולאחר מכן בזהירות pipet ההשעיה מעלה ומטה על מנת להמיס את האורגנואידים.
      הערה: בדוק את העיכול באמצעות מיקרוסקופ; הוא שלם כאשר כל אשכולות התא היו לנתקד לתאים בודדים.
    8. עם אכול מוצלח, להוסיף 1.4 מ"ל של DMEM / F12 + + כדי לעצור את העיכול. ואז להעביר את כל הבארות של אורגנואידים מתעכל צינור 50 מ"ל.
    9. לספור את התאים ולחשב את הסכום הנדרש עבור כל הזריקות.
    10. הכן 3 - 5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה
    11. צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS.
    12. Resuspended התאים BMM לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ"ל ​​ולשמור אותם על הקרח.

2. דגם עכבר Orthotopic

  1. הכנת חיות הנמען לניתוח
    הערה: השתמש 6-8 שבועות בן NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD גמא SCID, NSG) עכברים כמקבל. 21 NSG הם בין עכברים immunocompromised ביותר, חסר בוגרים, T ו- NK תאים יחד עם מספר רב של חיסון אחר De. 21 הם לגדול באופן אמין גידולים גם אם מספר תאים נמוך מוזרקים והם נוטים מאוד גרורות רחוקות. עכברי NSG הם מגדלים מעולה יכול להישמר קונבנציונאלי ספציפי פתוגן חינם (SPF) יחידות.
    1. לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ"ג / ק"ג של בופרנורפין תת עורי.
    2. השתמש sevoflurane ב 3-3.5 כרך% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן מעיד על הרדמה מספקת.
    3. מכסים את העיניים של עכברים הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית.
    4. לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן.
    5. לגלח את הבטן עם מכונת גילוח חשמלית (קרם דפילציה ניתן להשתמש לחילופין) לחטא עם לפחות 3 פעמים clorhexidine / יוד ו 70% אלכוהול לחילופין.
    6. לכסות את שדה כירורגי עם וילונות סטריליים.
      הערה: השימוש באנטיביוטיקה perioperative הוא אופציונלי ובכפוף להנחיות מוסדיות.
  2. Midline laparotomy וחשיפה של cecum
    1. השתמש במספריים (אזמלים ניתן להשתמש לחילופין) לעשות חתך קו האמצע קטן (3 - 5 מ"מ) של העור על הבטן התחתונה. להרים את שרירי דופן דופן הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו במספריים, ובכך לפתוח את חלל הבטן.
    2. לזהות בזהירות exteriorize את cecum עם מלקחיים atraumatic. מקם את העטיפה הסופית העיוורת של cecum על הבטן הצביע cranially.
    3. לאחר exteriorized, לשמור על cecum לחות באמצעות מלוחים חמים מלוחים בכל עת.
  3. זריקה אורתופטית, סגירת הבטן והחלמה לאחר הניתוח
    1. להזרקת intracecal, להשתמש מזרק 1 מ"ל רגיל עם צינורית 30 G. הר זה מזרק על משאבת microinjection, אשר בתורו רכוב על micromanipulator.
    2. בזהירות לתפוס את קצה cecum עם מלקחיים atraumatic בעדינות להחליק אותו על ידי stroking אותו למטהד עם קבוצה שנייה של מלקחיים מולחמים עם מלוחים חמים.
    3. מקם את הצינור ישירות מעל cecum.
    4. בצע את השלבים הבאים תחת שליטה חזותית עם מיקרוסקופ כירורגי בינוקולרי.
    5. בזהירות לתפוס את cecum עם שני מלקחיים atraumatic בשני הקצוות של החלק exteriorized של cecum, מעט למתוח אותו ואז לאט למשוך אותו על צינורית אשר ממוקם מקביל ומעל ישירות. זה חיוני לא לנקב את כל דופן המעי (ובכך להזריק את התאים לתוך לומן), כמו גם לא לחורר את serosa מעבר לנקודת החדירה הראשונית, כמו זה יוביל דליפה והפצה הצפק.
      1. להזיז את המעיים לכיוון הצינורית, לא את הצינורית לכיוון המעיים. החזק ו למתוח את המעיים בין שני מלקחיים. הידיים של המנתח חייב להיות מונח על משטח כדי להפחית את הרעד.
    6. להזריק את התאים בין serosa (כפי שנראה דק מאוד, בטנה שקוף מעל thE כלי הדם intramural) ואת השרירים. צינורית ולכן יש להציב ויזואלית מעל כלי הדם מתחת מתחת לממברנה שקוף שקוף.
    7. השתמש במתג רגל כדי להתחיל את הזריקה כדי להפחית את הרעידות בזמן צינורית היא בתוך דופן המעיים.
    8. לאחר צינורית נמצאת בעמדה, להתחיל את הזריקה. השתמש משך של 20 s, וכתוצאה מכך 1 μL / s הגדרה על יחידת הבקרה של המשאבה.
      הערה: הזריקה לתוך או ליד כלי דם פגום מוביל להפצה intravascular ישיר גרורות רחוק ולכן יש להימנע.
    9. לאחר השלמת הזריקה, להסיר בזהירות את הצינור על ידי משיכת אותו לאחור.
    10. מניחים ספוגית יבשה מתחת cecum, ולאחר מכן לשטוף היטב את cecum עם מים מזוקקים על מנת lyse leaked תאים ובכך למנוע הפצה מלאכותית הצפק.
  4. סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח
    1. אחרי רמזיזים בעדינות את הצואה לחלל הבטן.
    2. סגור את דופן הבטן עם 6-0 התפרים פועל במהירות absorbable.
    3. סגור את העור עם קליפ הפצע כירורגי.
    4. מניחים את העכבר על המפה חימום להגדיר 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה.
    5. בקפידה להתבונן במצב שלאחר הניתוח של העכברים במשך 48 שעות הבאות. במקרה של מצוקה, לטפל עם 0.05 מ"ג / ק"ג buprenorphine כל 12 שעות.
    6. לפקח על העכברים לפחות פעם אחת ביום עבור סימנים של מצוקה בשל הגידול בגידול.

3. בידוד של תאים סרטניים במחזור מ דוגמאות דם מלא

הערה: השגת דם על ידי לנקב קרדיאלי עור על עכברים מורדמים, ואחריו המתת חסד. באופן אידיאלי, 1000 μL של דם נמשכים לתוך מזרק prefilled עם μL 100 של נוגדי קרישה (חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או הפרין). השתמש אנטי אנושי, EpCAM (דלקת תא אפיתלמולקולה) נוגדן כדי לזהות את CTCs. זה עובד טוב מאוד אם אנושיים שורות תא אפיתל משמשים את המודל העכבר. עבור מכשירים אחרים, נוגדנים שונים עשויים להיות נדרשים.

  1. העשרת CTC:
    1. לפני מילוי צינורות 15 מ"ל עם 5 מ"ל צפיפות בינוני שיפוע בזהירות להעביר את הדם לתוך צינור 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה (30 דקות ב 300 xg ללא בלימה) בזהירות להסיר את supernatant העליון.
    3. יוצקים את השאר לתוך צינור חדש 15 מ"ל ו צנטריפוגה (15 דקות, 300 XG עם הבלם).
    4. לשחזר את interfase המכיל את התאים mononuclear (להשליך את שאר) ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
    5. Resuspend גלולה 200 μL PBS / 1% EDTA ולהוסיף 4 μL של נוגדן EpCAM. דגירה 20 דקות על הקרח בחושך.
  2. הקרנה וקטיף
    1. הכן את המאגר הבא (הנקרא להלן חיץ לקטוף): PBS + 10% עגל בסרום בסרום (FCS) + 1% פניצילין / Sטרפטומיצין (1%) + 0.8% EDTA.
    2. השתמש בעט PAP לצייר מעגל ~ 1 ס"מ בצלחת פטרי 6 ס"מ סטרילי (מונע את הנוזל מפיזור בצלחת), ו 700 μL pipet של לקטוף למאגר לתוך מעגל זה.
    3. הוסף 50 μL ההשעיה התא למאגר 700 μL לקטוף בתוך המעגל. בדוק את צפיפות התאים עם המיקרוסקופ. פיצול המדגם לתוך מנות שונות אם הוא צפוף מדי.
    4. המתן לתאים להתיישב (~ 5 דקות).
    5. מסך טיפת ההשעיה התא עבור מוכתם (= EpCAM חיובי) תאים.
    6. לאחר התא נמצא, לבחור את התא עם micromanipulator ולשים אותו חיץ 50 μL בהתאם ניתוח במורד המיועד ( למשל , חיץ RNA החילוץ או בינוני culturing).
    7. בהתאם לנתונים במורד הזרם המיועד, לבודד תאים שליליים של EpCAM ו / או בינוני כבקרות שליליות.
    8. המשך ניתוח במורד הזרם ( למשל , תרבות התא, PCR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצלח לשעתקו של גידולים המעי הגס במודל זה באופן ביקורתי תלוי הזרקת מדויק של תאים ללא דליפה או דליפה. אם זה הושג, מודל זה הוא אמין מאוד ורק לעתים רחוקות תוצאות ההפצה הצפק מלאכותית. קינטיקה הצמיחה של גידולים כמו גם דפוסי ההפצה שלהם תלויים בביולוגיה של אורגנואידים בשימוש ותאים. 15 בעוד HCT116 תאים גרורות באופן אמין לכבד במודל זה, SW620 תאים טופס גידולים אורטוטופיים, אבל לא גרורות. 15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות הפעילות המוכחת שלהם במודלים עכבריים תת-עוריים, הרוב הגדול של המרכיבים החדשים נכשל בניסויים קליניים ומעולם לא הגיע למרפאה. 11 זה חוסר ברור של מודלים עכבר תת עוריים כדי לדמות במדויק את הביולוגיה ואת דפוסי הצמיחה של גידולים הובילה לפיתוח מודלים עכבר orthotopic מבוסס על הזרקה של תאים סרטניים ישירות לתוך האיבר המקורי.

מודלים עכבר Orthutic מסוגלים לדמות את הביולוגיה והפצה של גידולים מוצקים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (WE 3548 / 4-1) ו- Roland-Ernst-Stiftung for Gesundheitswesen (1/14).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>תרבית תאים מדיה ורכיבים
מתקדם DMEM F12Invitrogen12634010DMEM/ F12 +++ HEPES בינוני
(1 מ')Life Technologies GmbH15630056DMEM/ F12 +++ תוסף
גלוטמקס-I בינוני (200 מ"מ)Life Technologies GmbH35050038DMEM/ F12 +++
בינוני פניצילין/ סטרפטומיצין (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM/ F12 +++ מדיום
DMEMLife Technologies GmbH61965026מדיום בסיסי של קווי תאים דו-ממדיים (DMEM/10% FCS)
סרום עגל עוברי (FCS)BIOCHROM AGS 0115מדיום בסיסי של קווי תאים דו-ממדיים (DMEM/10% FCS)
TrypLE Express מאגר דיסוציאציה אנזימטיLife Technologies GmbH12604021
מטריצת ממברנת הבסיס של מטריג'ל (BMM, ללא פנול אדום)CORNING B.V. Life Sciences356231
Dulbecco's Phosphate BufferedSaline Life Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0.25%, פנול-אדום)Life Technologies GmbH25200072
צלחות 6/48 בארות עם מכסהCORNING3516/3548
בקבוק תרבית תאים 75 ס"מ², 250 מ"לVWR International GmbH734-2066
בקבוק תרבית תאים 150 ס"מ&, 600 מ"לצינורות קורנינג 355001 מדעי
1,5 מ"ל / 2 מ"לSarstedt AG & Co.72.706.400/ 72.695.400
15 מ"ל, 50 מ"ל צינורות צנטריפוגהGreiner-Bio-One GmbH188271/227270
TC10 שקופיות ספירה (למכונת ספירה TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
פיפטות פסטר (זכוכית, 150 מ"מ)Fisher Scientific GmbH11546963/ FB50251נמשכות דק באמצעות מבער בונסן
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235להכנת רקמת גידול ראשונית
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753להכנת רקמת גידול ראשונית
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237להכנת רקמת גידול ראשונית
ערכת דיסוציאציה של גידול אנושיMiltenyi Biotec130-095-929להכנת רקמת
גידול ראשוניתפלקון 70 ומיקרו; m מסננת תאיםCorning B.V. מדעי החיים352350להכנת רקמת גידול ראשונית
שםחברהCatalog NumberComments
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & Co. KG-Medical
oxygenAir Liquide Medical GmbH-Buprenorphine
Temgesic-Bepanthen
- משחה אופטיתBayer Vital GmbH10047757
תמיסת מלח רגילה 0.9% (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad InjectabiliaBraun235144
מזרק 1 מ"ל (ללא נפח מת) - Injekt-F SOLOBraun/neoLab194291661
מחט הזרקה 30GBECTON DICKINSON304000
ספוגיות תאיתLohmann & Rauscher Deutschland13356
מיקרו-אדסון מלקחייםFST - כלים מדעיים עדינים11018-12
מספריים איריס - ToughCutFST - Fine Science Tools14058-11
מחזיק מחט Olsen-HegarFST - Fine Science Tools12002-12
AutoClip KitFST - Fine Science Tools12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (כירורגי תפר)ג'ונסון & ג'ונסון רפואי GmbHZ1012H
מכונת הרדמה מחקר שולחני עם שטיפה O2 ומכשיר אידוי SevofluraneParkland ScientificV3000PS/PK
משאבת UltraMicro עם בקר Micro4דיוק עולמייםUMP3-4להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד
מתג רגליים עבור בקר SYS-Micro4דיוק עולמיים15867ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד
מיקרומניפולטור ידני תלת צירימכשירי דיוק עולמייםM325ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד
מעמד מגנטי למיקרומניפולטורמכשירי דיוק עולמייםM10ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד
לוחית בסיס פלדה למעמד מגנטי M10מכשירי דיוק עולמיים5479ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת במיוחד
פלטה חמה 062Labotect13854
Isis - מכונת גילוחלשיער AESCULAP -
Parkland ScientificVS-2Z
שםCompanyCatalog NumberComments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
צפיפות שיפוע בינוני – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 אנטי אנושי CD326 (EpCAM) שיבוט נוגדנים 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 Anti-mouse CD326 (EpCAM) שיבוט נוגדנים G8.8BioLegend118210
צלחת פטרי, ø 60 x 15 מ"מ, 21 ס"מ², VentGreiner bio-one628102
מיקרוסקופ תרבית תאים פלואורסצנטייםLeica
Transferman 4r MicromanipulatorEppendorf
CellTram AirEppendorfמשאבת שאיבה המחוברת למיקרומניפולטור
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationהנדרשת לייצור מיקרו נימים לשאיבת תא בודד
נימי זכוכית פריזמהתאגיד דגן
עט PAPAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate BufferedSaline Life Technologies GmbHמאגר איסוף14190169
סרום עגל עוברי (FCS)BIOCHROM AGS 0115מאגר איסוף
פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)Life Technologies GmbHמאגר איסוף 15140122
EDTARoth8040.1מאגר פיקינג
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
<חזק>אימונוהיסטוכימיה
שיבוט נוגדנים אנטי-אנושי מטוהר CD326 (EpCAM) 9C4BioLegend324201EpCAM אימונוהיסטוכימיה (ראה, איור 2C)
HRP ארנב אנטי עכבר IgGAbcamab97046EpCAM אימונוהיסטוכימיה (cf, איור 2C)
החיים ציוד מכשירי מכשירי מיקרוסקופ כירורגי משקפת בראון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

s CTC

מאמרים קשורים