מאמר שיטה

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55364

⸱

13 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences & Iowa Center for Advanced Neurotoxicology, Iowa State University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

תקציר

Microglia הם המגיבים העיקריים עלבונות מערכת עצבים מרכזיים; עם זאת, הרבה נותר עלום על תפקידם בוויסות neuroinflammation. Microglia הם תאי mesodermal המתפקדים בדומה מקרופאגים מדידות מתח דלקתי. הקלסי (M1-type) ואלטרנטיבי (M2-type) ההפעלות של מקרופאגים גם שהורחבו microglia במאמץ להבין טוב יותר את יחסי הגומלין הבסיסיים פנוטיפים אלה יש בתנאי neuroinflammatory כגון פרקינסון, אלצהיימר, ומחלות הנטינגטון. בניסויים במבחנת ניצול microglia העיקרי מציעה תוצאות מהירות ואמינות כי ניתן להאריך את סביבת vivo ב. אמנם זה יתרון ברור על פני ניסויי in vivo, לבודד microglia תוך השגת תשואות נאות של טוהר אופטימלית כבר אתגר. שיטות נפוצות כיום בשימוש משני סובלות התאוששות נמוכה, טוהר נמוך, או שניהם. בזאת, אנו שייכים להםלהדגמת פרות עידון של שיטת ההפרדה המגנטית CD11b ללא עמודה משיגה התאוששות תא גבוהה וטוהר משופרים במחצית את כמות הזמן. אנו מציעים שיטת אופטימיזציה זו כמודל שימושי מאוד של בידוד microglial העיקרי לצורכי לימוד neuroinflammation ניוון מוחיים.

מבוא

Microglia הם מקרופאגים תושב Myb עצמאית ממוצא mesodermal, אשר להבדיל מן c-kit + / CD45- erythromyeloid אבות באיים הדם של שק חלמון 1, 2. לאחר microglia העוברית יש יישבה את מערכת העצבים המרכזית (CNS), כשהם עוברים מן אמבואידית לצורה מסועפת 3. Microglia הבוגר אלו מסווגים surveillant מאז ההשלכות הדינמיות שלהם לחקור את מוח parenchyma הבריא 4 עלבונות פוטנציאל. למרות microglia רק לתרום כ 10% מכלל אוכלוסיית תא CNS, יכל אריח בין זה לזה מבטיח סריקה מרבית של parenchyma 4, 5. Danger הקשורים דפוסים מולקולריים (damps), כגון α-synuclein 6, 7 ו עמילואיד-β 8, או pathogen הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) כגון lipopolysaccharide (LPS) 9, קלסיים להפעיל microglia לקדם תגובה דלקתית המאופיינת חזרה למצב הפעיל אמבואידית ואת הייצור של תחמוצת חנקנית, נימק גידול-α גורם (TNFα), 1β interleukin (IL-1β), IL-6, IL-12, והמוטיב CC chemokine ליגנד 2 9, 10, 11. בתנאי neuroinflammatory כגון מחלת פרקינסון, שבו-synuclein α פתוגניים צבר, מחזור ניווניות נוצר מן המוות של נוירונים דופאמינרגיים, אשר ישחררו-synuclein α מצטבר יותר, עוד יותר בקידום הפעלה קלסית של המיקרוגליה 7. בדומה מקרופאגים היקפי, microglia אולי גם יש את היכולת לחילופין להפעיל בנוכחות של ציטוקינים אנטי דלקתי IL-4 ו- IL-10, לתת להם את החזקיםial לקדם תיקון עצבי הפחתת דלקת 2, 11. מלבד התפקידים אימונולוגיים שלהם במערכת העצבים המרכזית, microglia תואר רגולטורים חיוניים של מעגלים עצביים על ידי גיזום סינפסות במהלך פיתוח. לדוגמה, עכברים KO Cx3cr1- יש פחות microglia צפופה וגיזום הסינפטי מופחת, אשר מוביל עודף של הקוצים הדנדריטים, סינפסות בשלה, ואת דפוסי אלקטרו של CNS מפותח 12. הבנת מורכבות הפיזיולוגיות אלה התפקידים התפקודיים המגוונים של המיקרוגליה של הומאוסטזיס של CNS היא קריטית בחיפוש אחר תרופות מיקוד הפרעות ניווניות.

בתחום neuroimmunology, ניסויים במבחנה ב הם רצויים מאוד בגלל הכדאיות יותר עבור מחקרים מכניסטית, עלויות התחזוקה הנמוכות, וכן בשל היותו פחות הזמן- ועבודה אינטנסיבית. Furthermoמחדש, היכולת לבודד אוכלוסיות תאים הוא קריטי כדי להתוות את הפונקציונליות של אלה תאי היעד בתנאים שנקבעו. רבי שיטות בידוד microglial קיימות, אבל הם מוגבלים על ידי היכולת שלהם להשיג מספרים גבוהים יחסית וטוהר לניסויים רחבים 13, 14, 15. לדוגמה, מקבץ של 11b בידול (CD11b) הוא סמן משטח משותף של מונוציטים, מקרופאגים, ו microglia 16. על ידי ניצול CD11b, שיטה של הפרדה מגנטי תוארה לראשונה כגישה מבוססי עמודה שהניבה ~ 99.5% טוהר ~ 1.6 x 10 6 microglia לכל המוח בילוד 17. במעבדה שלנו לאחרונה פיתחה שיטה הפרדה מגנטי CD11b ללא עמודה 15, אשר ביצענו ב צינור פוליסטירן ידי תיוג CD11b עם נוגדנים חד שבטיים מצומדות Phycoerythrin (PE). Seconda bispecificנוגדנים ר"י כדי PE ו מתחמי dextran עם PE. לאחר כבול, חלקיקים מגנטיים מצופה dextran מוצגים, אשר נקלטים על ידי תום dextran של הרכב הנוגדן. לבסוף, צינור הקלקר ממוקם מגנט עבור בידוד microglial. גישה זו הכפילה את התשואה ל ~ 3.2 x 10 6 microglia לכל המוח בילוד אך במחיר של צמצום טוהר אל ~ 97%.

בזאת, אנו מדגימים פרוטוקול הפרדה מגנטי מהיר ומעודן טור נטול CD11b (איור 1). שיטה משופרת נשארת כפי ריאלית כשיטת הטור ללא המקורי שלנו מאז המחיר של ערכת ההפרדה מגנטית CD11b זהה. שעת ההשלמה מצטמצמת בחצי, מה שיכול להיות מכריע כדי למקסם הישרדות תא תשואה. יש לציין, כי הטוהר שהושג שיטת אופטימיזציה זה ~> 99%, שיפור ניכר לעומת טוהר מושגת משיטת הטור-חינם המקורית שפותחה על ידי המעבדה שלנו 15. והכי חשוב, CD11b-PEלא מנוצל, ומבטל את הצורך לדגור הרחק אור ומאפשר את השימוש במסלול האדום עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, כמו בשיטת CD11b המקורית, שבר astrocytic של תשואה וטוהרת גבוהות מתקבל עם שיטה משופרת. האסטרוציטים הם תאי גליה הרבים ביותר במערכת העצבים המרכזית, שמובילים את הרעיון כי הפונקציות ההומיאוסטטית שלהם הן הכרחיות ביחס פתופיזיולוגיה 18. תאי גליה אלה ממלאים תפקיד פונקציות פיסיולוגיות מגוונות כגון להרכיב את מחסום דם-המוח, מתן תמיכה מזינה, שמירת הומאוסטזיס הנוירוטרנסמיטר, ויוצר צלקות גליה בתגובה לפציעה, neuroprotection, למידה וזיכרון, וכן neuroinflammation, הממחיש את פוטנציאל החקירה שלהם גליה ביולוגיה 19. מורפולוגיה ופונקציונליות של המיקרוגליה האסטרוציטים כבר הוברר באמצעות מיקרוסקופיה confocal, סופג המערבי, תגובת שרשרת Real-Time פולימראז כמותיים (qRT-PCR), Gassay ניטריט ריס, ואת assay ציטוקינים זמנית Luminex. החידוד שמספק פרוטוקול זה מציע מוגברת ביטחון נוגעים טוהר microglial או astrocytic, יישום רחב יותר של מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הזמינות של הערוץ האדום, חוסך זמן, שכולן חשוב ניסויים במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השימוש בחיות והנהלים פרוטוקול אושרו ובפיקוח טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת איווה סטייט (איימס, IA, ארה"ב)

1. גידול של תרבויות מעורבות גליה

  1. לערוף 1- 2 גורים בני יומם במהירות עם 5.5 מספריים ההפעלה אינץ, להציב את הראשים מיד בתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח. שים לב העריפה זהו המצב של המתת חסד.
  2. במנדף זרימת אוויר למינרית, לעשות חתך קטן בגולגולת קרומי המוח באמצעות 4.5 מספריים לנתח מיקרו ישר אינץ. בגין חיתוך מסוף הזנב סוף המקורי (האף). קבל מתחת לעור באמצעות הפתיחה שהוקמה על ידי עריפת הראש.
    1. לאחר החתך, לקלף אחד ההמיספרות לצד. ואז להשתמש פינצטה מעוקל או מכור להסיר את המוח כולו.
  3. לטבול את המוח (ים) בצינור חדש 50 מ"ל המכיל 0.25% טריפסין-ethylenediaminetetraacetאכלו חומצה (EDTA) עבור 15 דקות באמבט מים C 37 °. השתמשו 2 מ"ל של טריפסין-EDTA לכל המוח.
  4. שטוף את המוח (ים) עם מדיה צמיחה טריה (FBS 10%, DMEM / F12, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 1% L- גלוטמין, 1% פירובט נתרן, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות) על ידי הוספה וההסרה כְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. חזור על 4x זה.
  5. עבור כל מוח, צלחת שתי T-75 צלוחיות המכילות מדיה צמיחה. לכן, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת צמיחה לכל מוח הצינור. לכן, זה יהיה שווה ערך של 1 מ"ל של המוח הומוגני עם 8-9 מ"ל של התקשורת צמיחה לכל בקבוק T-75.
  6. Homogenize ידי triturating המוח (ים) עם טפטפות בגדלי צמצם שונים, במטרה מן גדול לקטן. כאשר הוא גלוי כי רקמת המוח אינה מקבל קטנה, מעבר פיפטה הבא. בסוף הטחינה הדקה, ההשעיה צריכה להיות ברורה, ללא גושים גלויים.
    1. השתמש פיפטה 25 מ"ל, 5 מ"ל פיפטה, ולאחר מכן ברצף פיפטה 10 מ"ל.
  7. להעביר בכל homogהשעית מוח enous דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להפוך אותו לתוך תרבות תא בודדת.
  8. עבור כל המוח הומוגני, צלחת שתי צלוחיות T-75 המכילות מדיה צמיחה, כפי שמתואר בשלב 1.5 (1 מ"ל של המוח הומוגני עם 8-9 מ"ל של התקשורת צמיחה לכל בקבוק T-75).
  9. שינוי בתקשורת צמיחה לאחר 6 ד ולגדול עד הבידוד על 16 ביום ה.

בידוד 2. תאי microglial

  1. לאחר 16 ימים, להסיר את המדיה הצמיחה מהבקבוק ולמקם אותו צינור 50 מ"ל טרי. להוסיף 3 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לכל בקבוק T-75. Shake צלוחיות במשך 5 דקות ב RT על שייקר מסלולית.
    1. צנטריפוגה תקשורת הצמיחה הוסרה ב 0.4 XG במשך 5 דקות ולהשתמש כדי לעצור את תגובת EDTA-טריפסין בשלב שלאחר מכן.
  2. אחרי שלחצתי על 5 דקות, להוסיף מינימום של 4 מיליליטר של תקשורת צמיחה (טריה או בתקשורת בשימוש מ 2.1.1) כדי לעצור את תגובת EDTA-טריפסין.
  3. Triturate כדי להבטיח כי כל גאמות שהופרדו.
  4. לאחר הטחינה דקה, להעביר את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר כדי להפוך אותו לתוך תרבות תא בודדת, לבצע ספירת תאים, ולאחר מכן לסובב את התאים ב 0.4 XG במשך 5 דקות.
  5. עבור כל 100 x 10 6 תאים (בערך 15 x T-75 צלוחיות), להשתמש 1 מ"ל של מדיה מומלץ (2% FBS, DPBS (סידן ומגנזיום כלורי-חינם), 1 mM EDTA) כדי להשעות את התא גלולה.
    הערה: כל השלבים הבאים מותאמים פרדת 1 מיליליטר.
  6. קח צינור פוליסטירן 5 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של מדיה מומלץ, ולסמן את המניסקוס. להוסיף מומלצת מדיה עד 2.5 מיליליטר ולסמן זה גם כן. מחק את מדיה המומלצת ולהעביר את התאים-מושעה מחדש אל צינור קלקר 5 המ"ל.
  7. להוסיף 50 μL של בסרום עכברוש לכל 1 מ"ל של תאים מושעה. דגירה של 5 דקות ב RT.
  8. הכן קוקטייל לבחירה על ידי ערבוב 25 μL של רכיב ו 25 μL של B. מרכיב רכיבים אלה הם קנייניים.
  9. להוסיף 501; L של קוקטייל הבחירה לתאים. דגירה של 5 דקות ב RT.
    הערה: עבור תרבויות טהורות, חזור על שלב 2.9 (מומלץ אבל לא חובה).
  10. מיקרוספרות וורטקס עבור 45 s. להוסיף 80 μL של מיקרוספרות לכל 1 מ"ל של מדגם. דגירה של 3 דקות ב RT.
  11. תביא את הנפח ל 2.5 מיליליטר בצינור פוליסטירן ידי הוספת מדיה המומלצת.
  12. שים את הצינורית שואבת 3 דקות בטמפרטורת החדר. התאם את הדגירה להגדיל טוהר. לאט לאט לשפוך את מדיה המומלצת לתוך צינור 15 מיליליטר עם המגנט עדיין בצינור פוליסטירן.
  13. חזור על שלב 2.12 שלוש פעמים נוספות. incubations מגנטי נוסף עשוי להתבצע כדי להגדיל טוהר.
  14. להוסיף 3 מיליליטר של תקשורת צמיחה ולספור את מספר התאים באמצעות מונה תא.
  15. תאי פלייט בהתאם ב Poly-D- ליזין (PDL) צלחות מצופות עבור טיפולים. פנק את התאים 48 שעות לאחר זריעת צלחות מצופות inPDL. זה מאפשר לתאים להתאושש מן הלחץ של פרדה.
    הערה: צ'הCK הטוהר של התרבות באמצעות immunocytochemistry כפי שתואר לעיל 15.
  16. פלייט השבר השלילי (נאסף בתוך שפופרת 15 מיליליטר), אשר ברובו מכיל האסטרוציטים, צלוחיות T-75 של מדיום הגידול.
  17. לאחר לפחות 6 שעות של אינקובציה ב 37 ° C חממה, לשנות את המדיום ולתת לו לגדול O / N. פיצול האסטרוציטים למחרת לטיפולים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

Microglia מבודד באמצעות ערכת הסלקציה החיובית CD11b יש שנייה טוהרת גבוהה

microglia העכבר הראשי בודד באמצעות הפרוטוקול הנ"ל, מצופה על coverslips מצופה פולי- D- ליזין לבדוק את הטוהר של בידוד. עשרת אלפים תאים היו מצופה בכל טוב וניתוח immunocytochemical בוצע באמצעות מולקולת מתאם מיונן מחייב-סידן 1 (Iba1) כסמן של המיקרוגליה חלבון גליה fibrillary חומצי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מבוגרי שיטות בידוד microglial מחלים מוגבל שאינם מתאימים עבור חלבון שונה מנתח ידי כתם מערבי RNA מנתח ידי qRT-PCR. הקפדת ההפרש ושיטות trypsinization מתונות שתי גישות נפוצות עם תשואות microglial נמוכות 13, 14, 15. גישת CD11b מבוסס העמודה יש גם התאוששות נמוכה, אך משיגה טוהר יותר מאשר דבקות דיפרנציאלי trypsinization המתון 13, 14,<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים: NS088206 ו ES026892. 'בוש יוג'ין ולינדה לויד נתרם היו"ר אל AGK ו דיקני Professorship כדי AK הוא גם הודה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת הפרדה EasySep CD11b IIStemCell Technologies18970
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
DMEM/F12 (1:1) (1x)Life Technologies11330057
נתרן פירובטטכנולוגיות חיים11360070-MEM
חומצות אמינו לא חיוניות (100x)Life Technologies11140050
L-גלוטמין (100x)Life Technologies25030081
EDTAFisher ScientificAM9260G
סרום בקר עוברי (FBS)Sigma13H469
0.25% טריפסין-EDTAGibco מבית Life Technologies25200
PBS של Dulbecco (DPBS)Gibco מבית Life Technologies14190250

מקורות

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84(2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western Blot

מאמרים קשורים