עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

Summary

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

Abstract

הבהרה של מאפייני האיגוד של פילוח כרומטין חלבונים יכולה להיות מאוד מאתגרת בשל האופי המורכב של כרומטין ואת הטבע הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. על מנת להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו הסתגלו assay הפקת מלח רציפים (SSE) להערכת את הזיקות איגוד היחסי של מתחמי מאוגד-כרומטין. זה קל ופשוט assay יכול לשמש על ידי שאינם מומחים כדי להעריך את ההפרש היחסי מחייבים זיקה של שני מתחמי קשורים, השינויים זיקה קומפלקס יחידת משנה אובד או תחום הפרט הוא מומת בשינוי זיקה מחייבת לאחר שינויים לנוף כרומטין. על ידי ברצף מחדש השעיית בצובר כרומטין להגדיל את כמויות מלח, אנחנו יכולים לעשות פרופיל • את תנאי של חלבון מסוים של כרומטין. באמצעות פרופילים אלה, אנו מסוגלים לקבוע כמה שינויים במתחם שינוי כרומטין או שינויים לסביבה כרומטין להשפיע על אינטראקציות מחייב. צימוד SSE עם אחרים מבחני חוץ גופית בתוך וויוו , אנו יכולים לקבוע את התפקידים של תחומים נפרדים, חלבונים על הפונקציונליות של תסביך במגוון סביבות כרומטין.

Introduction

תקנה DNA תאי האיקריוטים היא מערכת מורכב ומתוחכם מפוקחת על ידי מגוון של חלבונים לתאם תגובות לגירויים תאיים, חוץ-תאית. הדנ א הוא כרוך סביב היסטון octamers כדי נוקליאוזומים טופס, שניתן באופן רופף מפוזרים לאורך הדנ א או נדחס לתוך סלילי חזק¹. ההסדר המבני הזה של ה-DNA, שינויים היסטוניים המכונה כרומטין, אשר מווסת על ידי רשת של חלבונים לקרוא, לכתוב או למחוק שינויים translational פוסט (PTM) על שינויים היסטוניים². כמה היסטון PTMs, כגון acetylation, לשנות את המטען של חומצת אמינו ביותר הם מופקדים על, שינוי אינטראקציות בין שינויים היסטוניים דנ א². היסטון PTMs משמשים גם כדי לגייס הרגולטורים תעתיק, remodelers כרומטין, DNA נזק תיקון מכונות, מכונות שכפול ה-DNA אזורים ספציפיים של גנום³.

רוב שיטות לימוד אינטראקציות כרומטין או בדיקה אינטראקציות בקנה מידה קטן או לערב גדול ניתוחים הגנום כולו. במבחנה מחייב לימודי לנצל לעתים קרובות תחומים רקומביננטי בודדים עם פפטידים היסטון. או דנ א במבחני כגון מבחני shift ניידות אלקטרופורזה (EMSA), calorimetry איזותרמי טיטור, קרינה פלואורסצנטית קיטוב פפטיד pulldowns. כי אלה מבחני להתמקד בדרך כלל תחום חלבונים בודדים, הם להקל על ההבנה של חתיכה קטנה של הפאזל, אך אינם מאפשרים לנו להבין את טבעם קואופרטיב של תחום מרובת חלבונים, שלא לדבר על התפקיד שלהם חלבון רב מתחמי. שכבה נוספת של במאוד נוסף של הקומפוזיציה הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. הטרוגניות חלבון זה, בשילוב עם אופי הדינמי של הנוף כרומטין, הופך אותו מאתגר כדי לסכם את ויוו איגוד אינטראקציות של חלבונים כרומטין כרומטין בתוך חוץ גופית.

שיטות in vivo עשו התקדמות משמעותית; עם זאת, לעתים קרובות הם יקרים, זמן רב, ומאתגר טכנית. Immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף (צ'יפ-seq) הוא מאוד שימושי לקביעת הלוקליזציה של חלבונים ושינויים היסטון ברחבי הגנום, אולם זה דורש אופטימיזציה ניכר⁴. חלבונים הם לעיתים קרובות תפור כדי כרומטין כדי לשמר את האינטראקציות; עם זאת, זה יכול לייצר אינטראקציות מלאכותי, עלול לגרום epitope מיסוך⁵. יתר על כן, immunoprecipitations (IP) דורשים נוגדנים ספציפיים מאוד, ואופטימיזציה נרחב של ה-DNA הטיה ומצבים IP על ידי שבב-qPCR שימוש באתר איגוד ידוע, אשר לעתים קרובות אינם זמינים א-פריורי. לאחר אופטימיזציה של שבב תנאים, עיבוד הדגימות יקר ודורש מספר שבועות עד חודשים רצף ולנתח. על פי שיטה זו היא שלא יסולא בפז לזיהוי הלוקליזציה של כרומטין מאוגד חלבונים ברחבי הגנום, העלות ושזה זמן מחויבות אסורה לשימוש בשיטה זו ליצירת היפותזות על מה שינויים קטנים עלול להשפיע על מאפייני האיגוד העולמי .

בנייר זה, אנו מתארים איך וזמינותו הפקת מלח רציפים (SSE) יכול לשמש כדי לבחון פרופילים האיגוד העולמי של חלבוני כרומטין מכורך ולהבחין איך שינויים בפרופיל חלבון, מורכבים, או גלובלי PTM יכול לשנות אינטראקציות. למרות עקירות מלח הם טכניקה בשימוש נפוץ, בהרחבה, נדגים כיצד רציפים בשיטה זו הוא מאוד תכליתי הדירים. SSE מאפשר לנו לאפיין כמה יחידת משנה יחיד של מתחם או אפילו מחשבים בודדת תורמת אהדה גורפת כרומטין הכולל של המתחם. SSE יכול לשמש גם כדי לקבוע אם הכריכה של חלבון מושפע משינויים בנוף כרומטין, מתן השערות מעניין עבור מיקוד מארק היסטון זה יכול להיות מאושרות באמצעות שבב-seq ומחקרים רחב נוספים הגנום.

במקור התאמנו בשיטה זו מ וו ואח ', לבחון את הפונקציה של Polybromo1 (PBRM1) באיגוד של^6,7פורטל כרומטין PBAF. בעזרת טכניקה זו, אנחנו נקבע את התפקיד של PBRM1 עבור איגוד כרומטין בתוך כרומטין PBAF שיפוץ מורכב, ואז קבעו את התרומה היחסית של שישה bromodomains בודדים זו פונקציה⁷.

כאן נתאר כיצד לייעל בשיטה זו כדי לחקור את איגוד כרומטין סוגי תאים שונים, כדי להעריך את זיקה מחייבת היחסי של כרומטין דומה שינוי מכלולי כדי לבחון העקירה של חלבון מכרומטין על ידי מעכב כימי, ו כדי לקבוע את ההשפעות של כרומטין מחייב לאחר שינויים לנוף כרומטין.

Protocol

1. ההכנות

1. להכין 100 מ"ל של פתרון היפוטוניק מאגר ת 0.3 M סוכרוז, 60 מ מ אשלגן כלורי, 60 מ מ טריס pH 8.0, 2 מ מ EDTA, ו- 0.5% NP-40. החנות 4 ºC.
   הערה: כמה שורות תאים, כגון HEK293T, לדרוש תנאים מחמירים פחות lysing. אם גרעינים lyse בקלות, השתמש שונה מאגר ת 25 מ מ HEPES pH 7.6, 25 מ מ של אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl ₂, מ מ 0.05 EDTA, גליצרול NP-40, ו- 10% 0.1%-
2. להכין פתרון מניות 250 מ של פתרון x mRIPA 2: 100 מ מ טריס pH 8.0, 2% NP-40 0.5% נתרן deoxycholate.
3. להכין פתרון מניות 100 מ של 5 M NaCl.
4. שימוש x mRIPA 2 ו- 5 מ' NaCl פתרונות, להכין 50 מ של 1 x mRIPA פתרון עבור כל אחד ריכוזי מלח 6: 0 מ מ 100 מ מ, מ מ 200, 300 מ מ, 400 מ, 500 מ מ NaCl. לפני תחילת הניסוי, מגניב כל הפתרונות על קרח
5. לגדול תא קווים בתנאים הרצויים.
   הערה: בעת החלטה על ההשפעות של הורסים חלבון, SSE עבור שורת תמונות ציפורים יש להשוות לתאים wildtype. אלה SSE יש לבצע על הצד. לקבלת דוגמאות בעזרת מעכבי כימי או גירויים, פנה לסעיפים 3-5-

2. הפקת מלח רציפים בסיסי

1. הקציר 8 מיליון תאים של כל תנאי ולשטוף פעמיים עם 5 מ של PBS קר קרח.
   הערה: זה חשוב וקריטי. שיהיה מספר שווה של תאים יש ריכוז החלבון המקביל. המספר המדויק של תאים, ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים בודדים או חלבונים מסוימים. זה חשוב שלא יהיו רבים מדי, כמו עליית ריכוז חלבון תמנע התצפית של העקומה • תנאי, אשר תלויה מחייב שיווי משקל. עם זאת, עם תאים מעט מדי אולי לא יהיה מספיק חלבונים כדי לזהות את העקומה, בגדר כרומטין קשה לבודד, עלול ללכת לאיבוד בין שברים.
2. מושהה מחדש תאים 1 מ"ל של מאגר A + מעכבי פרוטאז, להעביר לתוך צינורות צנטריפוגה מיקרו 1.5 mL, ו- top סיבוב מעל תחתית ב 4 ºC במשך 10 דקות
3. לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 6000 x g למשך 5 דקות ב- 4 ºC.
   הערה: לאחר שלב זה מעטפת הגרעין עדיין אמורים להישאר שלמים. אם המעטפה גרעיני שלם, בגדר מחדש נשעה באופן מלא; עם זאת, כאשר המעטפה הוא lysed כרומטין הוא שוחרר, בגדר לא מחדש נשעה. אם המעטפה גרעיני אינו שלם לאחר דגירה מאגר A, השתמש שונה מאגר א
מעכבי
4. להוסיף 200 µL mRIPA 0 מ"מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה גרעינים לפני מחדש השעיית גלולה. Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם פיפטה 1 מ"ל. בגדר מחדש צריכים להשעות בקלות, לעומת זאת, הגרעינים lyse זה הוא pipetted, המדגם יהפוך סמיך, דביק וקשה פיפטה.
   1. על מנת להכין את צניפה לתוך הקצה, הקש על הסוף של קצה פיפטה בתחתית הצינורית צנטריפוגה. בגדר לא יימס לחלוטין ברגע ה-DNA הוא שוחרר מן האטומים, אך pipetting ישבור למעלה
5. כאשר כל הדגימות יש כבר הומוגני, דגירה כל הדגימות על קרח דק 3
   הערה: זמן הדגירה ייתכן שיהיה צורך ניתן למטב בהתאם החלבון עניין.
6. צנפה כרומטין ולבודד על ידי צריך שתוציאו את הדגימות למשך 3 דקות ב 6500 g x-4 ºC.
צינור
7. תגובת שיקוע העברה כדי צנטריפוגה mL 1.5 נקי. זה יהיה השבר 0 מ מ. הפתרון mRIPA 0 מ מ יכול לשמש צעד שטיפת פירוק הגרעינים ולהסיר כל החלבונים רופף לא משויך כרומטין.
מעכבי
8. להוסיף 200 µL mRIPA 100 מ מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה כרומטין לפני מחדש השעיית גלולה. להיפרד בגדר כרומטין מאת pipetting בגדר לאורך 15 פעמים.
   הערה: זה קריטי להיות עקבי עם מספר פעמים בגדר ב pipetted.
9. Incubate על קרח למשך 3 דקות. שלב הדגירה זה מאפשר כל דוגמאות להגיע למצב של שיווי משקל, אשר חשוב במיוחד, כאשר ישנם מספר דגימות.
10. צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-
11. חזור על 2.6-2.10 ריכוז מלח שנותרו.
    הערה: לאחר 400 מ NaCl, mRIPA בגדר צריך להיות ברור, ואילו, לא יישאר בתחתית הצינורית. ניתן למקם את צניפה במכסה של הצינור צנטריפוגה בזמן תגובת שיקוע מבודד.
12. 70 להוסיף µL של 4 x חלבון הטעינה לצבוע את כל השבר ולטעון 30 µL של כל שבר על ג'ל אקרילאמיד מרחביות לניתוח תספיג.
    הערה: כדי לקבוע את פרופיל איגוד של החלבון, זה קריטי כדי לטעון כרכים המקבילה של חלבון שווה lysate, במקום טעינת ריכוזים.
13. לבצע תספיג רגיל על ידי העברת על גבי קרום ולהשתמש נוגדנים העיקרי חלבונים עניין.
14. כדי quantitate החלבון eluted מ כרומטין, דגירה את האבן החשופה של זריחה אינפרא-אדום IRDye נוגדנים משניים, חשופה תמונה עם imager. אמנם ניתן להשתמש בשיטות אחרות של פיתוח, אנו ממליצים זריחה או הדמיית אינפרה-אדום, כפי שהוא יותר כמותיים בטבע.
15. שימוש ImageJ או תוכנה דומה כדי לחשב את העוצמה של החלבון eluted-כל ריכוז המלחים. על ידי יצירת גרפים עוצמת הלהקה נגד ריכוזי המלח, התבנית • תנאי את החלבון עניין יכול להיקבע.

3. הפקת מלח רציפים רכוש " קורא " מעכב

1. הקציר שתי קבוצות של תאים (4 מיליון) ובידוד הגרעינים כמו SSE רגיל.
2. מחדש להשעות שתי קבוצות ב- 200 µL של mRIPA 0 מ"מ NaCl, תקופת דגירה של 3 דקות. זה יאפשר להסרת כל חלבון ללא הגרעינים.
3. MRIPA µL להוסיף 200 0 מ"מ NaCl עד כל גלולה. להוסיף את המדכא (2 µL של 1 מ מ (+) JQ1) אחד מדגם של דימתיל סולפוקסיד לקבוצת הבקרה.
4. על ידי pipetting 15 פעמים ואז וולדהיין חזר בגדר דגירה על קרח במשך 5 דק.
5. צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-
6. חזור על 3.3-4 עבור כל ריכוז מלח ולבצע תספיג סטנדרטי של.

4. הפקת מלח רציפים רכוש " סופר " מעכב

1. יטפל בתאים עם החומר המדכא (10 מיקרומטר סאהה) או דימתיל סולפוקסיד עבור ה 3
2. הקציר 4 מיליון תאים עבור כל טיפול.
3. לבצע SSE סטנדרטי של הדגימות עם החומר המדכא נוספו כל המאגרים.

5. רציפים מלח החילוץ הבאים נזק לדנ א

1. יטפל בתאים עם דוקסורוביצין 1 מיקרומטר עבור ה 1
2. לשנות את התקשורת על התאים ולאפשר להם להתאושש במשך ה 3
3. הקציר 8 מיליון תאים ולבצע בסיסית דר.

6. הפקת מלח שאינם רציפים

1. הקציר 12 מיליון תאים ולשטוף עם PBS.
2. חלוקת תאים כך שיהיו 2 מיליון תאים למחזור צנטריפוגה מיקרו-
3. להשעות מחדש ב- 500 µL מאגר A ואת תקופת דגירה של 10 דקות
4. לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה-6000 x ג
5. מחדש להשעות. גללים ב µL 200 של כל מאגרי mRIPA + NaCl.
6. Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם טיפ פיפטה 1 מ"ל.
7. Incubate על קרח דק 3
8. לבודד את כרומטין על ידי צנטריפוגה ב 6500 x g ולהעביר את תגובת שיקוע לנקות צינורות. להוסיף µL 70 של טעינת לצבוע ולהפעיל 30 µL ג'ל מרחביות-דף לניתוח תספיג.

Results

בנייר זה, נדגים את היתרונות והיישומים של השיטה הנפוצה הפקת מלח רציפים (SSE) יש שינינו ספרות⁶. איור 1, נוכל להשוות את הפארמצבטית של SSE חילוץ חלבונים שאינם ברצף על ידי גילוי דפוסי • תנאי ARID1a ו- PBRM1. אנו מבחינים באופן עקבי כי ARID1a, יחידת משנה BAF, elutes בעיקר ב-200 מ"מ NaCl ו- PBRM1, יחידת משנה בלעדי PBAF, elutes בעיקר ב 300 מ"מ NaCl. איור 1a מציג משכפל עצמאית שלושה של SSE עם 8 מיליון תאים OVCA429. <...

Discussion

אפיון של אינטראקציות חלבון וכרומטין באמצעות עקירות מלח היא שיטה נפוצה זה כבר מועסקים במשך עשרות שנים^14,15; עם זאת, זה לא באופן שיטתי מוטבה לפני כדי לחשוף את השירות המלא שלה. נדגים כיצד רציפים בשיטה זו מספק דרך מהירה וזולה כדי להבחין בין שינויים באיגוד כרומטין כאשר החלבון או הסביבה היא שונה. SSE ממוטב וניתנת להתאמה במיוחד, חשוב, היא טכנית פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד. היבטים מרכזיים שצריך להיות מותאם לפני הפעלת הם: החל מספר הטלפון הנייד, מאגר היפוטוניק תנאים, זמן הד...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סודיום כלוריד, קריסטל 2.5 ק"ג AR (ACS)	Avantor/Macron	7581-06
סוכרוז, קריסטל 500 גרם AR¨ (ACS)	Avantor/Macron	8360-04
אשלגן כלורי, גרגירי 500 גרם AR¨ (ACS)	בסיס Avantor/Macron	6858-04
Trizma(R), תקן ראשוני וחוצץ, >=99.9% (טיטרציה),	גבישית Sigma-Aldrich	T1503-1 ק"ג
EDTA, מלח דיסודיום, דיהידראט 125 גרם AR (ACS)	Avantor/Macron	4931-02
NONIDET P-40 מצע, 100 מ"ל UN3082	Amresco	E109-100ML
HEPES Buffer תמיסה (1M)	Gibco	15630-080
מגנזיום כלוריד, 6-הידרט, קריסטל 500 גרם AR¨ (ACS)	אוונטור/מקרון	5958-04
גליצרול, 1 ליטר	אמרסקו	0854-1 ליטר
מלח נתרן חומצה דאוקסיקולית, 100 גרם	אמרסקו	0613-100 גרם
אפנדורף מחקר פלוס פיפטה	פישר סיינטיפיק	13-690-032
אפנדורף 5424 R מיקרוצנטריפוגה מקוררת	אפנדורף	5424 R
עכבר משני IgG HRP מקושר	איתות תאים	7076
ארנב משני IgG HRP מקושר	איתות תאים	7074
BMI-1 נוגדן	Millipore
PBRM1 נוגדן	Bethyl	A301-591A
ARID1a נוגדן	Santa Cruz	sc-32761
BRD4 נוגדן	Bethyl	A301-9852a
(+) JQ1	חברת קיימן כימיקלים	11187
SAHA	חברת קיימן כימיקלים	10009929
דוקסורוביצין	AK Scientific	25316-40-9
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	מקרון	4948-02
מיני תא טרנס-כתם	BioRad	1703930
מיני מיכל ג'ל	ThermoFisher	A25977
אלבומין, בקר (BSA)	אמרסקו	0332-100 גרם	משמש כפתרון של 5% ב- PBS-T כפתרון חוסם לכתמים מערביים
Bolt MOPS SDS מאגר ריצה (20x)	Life Technologies	B0001
Bolt LDS מאגר דגימה (4x)	Life Technologies	B0007
PageRuler Plus סולם חלבון מוכתם מראש, 10 עד 250 kDa	ThermoFisher	26619
מתיל אלכוהול,	מקרון	3041-10
טריפסין kEDTA, 1X	Cellgro	25-053-CI
נתרן אזיד, 250 גרם UN1687	אמרסקו	0639-250 גרם
נתרן דודציל סולפט (SDS) 500 גרם UN1325	אמרסקו	0227-500 גרם
גליצין, לאלקטרופורזה, > = 99%	סיגמא-אולדריץ'	G8898-1 ק"ג
BigTop צינורות מיקרוצנטריפוגה, פוליפרופילן	VWR	20170-333
1000 ומיקרו; L טיפים לפיפט	VWR	83007-382
NuPAGE Bis-Tris ג'לים טרומיים 4-12%	Invitrogen	NW04125BOX
לופפטין המיסולפט, 5 מ"ג	מוצרי מחקר RPI	22035-0.005	המשמשים לתמיסת מעכב פרוטאז.
אפרוטינין, 10 מ"ג	מוצרי מחקר RPI	20550-0.01	משמש לתמיסת מעכב פרוטאז.
פפסטאטין A, 5 מ"ג	מוצרי מחקר RPI	30100-0.005	משמש לתמיסת מעכב פרוטאז.
OVCA429 תאים	מתנה מקארן קאודן דאל. Ph.D.
HEK293T	ATCC	CRL-3216
תאי HeLa	ATCC	CCL-2
McCoy's 5A מדיה	Corning Mediatech	10-050-CV
DMEM	Corning Mediatech	10-013-CV
מדיום חיוני מינימלי (MEM), אבקת	קורנינג Mediatech	50-011-PC
MEM NEAA (100X) חומצת אמינו לא חיונית	Gibco	11140-050
FB-11: סרום בקר עוברי, מקור ארה	Omega Scientific	FB-11
Penicillin-Streptomycin Solution	Life Technologies	15140-122
Glutamax	Life Technologies	35050-061
נתרן פירובט	Life Technologies	11360070
VWR Power מקור:	VWR	13-690-032