הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

20.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55372

⸱

14 באפריל 2017

 , 
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

במאמר זה

סיכום

מידול התפתחות המוח האנושי נפגע עקב המורכבות חסרת התקדים של רקמת האפיתל העצבית. כאן מתוארת שיטה לייצור חזק של אורגנואידים במוח כדי לתאר אירועים מוקדמים של התפתחות המוח האנושי ולדגמן מיקרוצפליה במבחנה.

תקציר

הזמינות המוגבלת של מודלים מתאימים במבחנה שיכולים לייצג באופן אמין התפתחות מוח אנושית מורכבת היא צוואר בקבוק משמעותי המגביל את התרגום של מחקר מוח בסיסי ליישום קליני. בעוד שתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) החליפו את תאי הגזע העובריים האנושיים המפוקפקים מבחינה אתית, מחקרי התמיינות עצבית מבוססי iPSC נותרו תיאוריים ברמה התאית אך אינם מספקים כראוי את הפרטים שניתן להפיק מרקמת מוח אנושית מורכבת ותלת מימדית.

הפער הזה מתמלא כעת באמצעות יישום של אורגנואידים תלת-ממדיים במוח שמקורם ב-iPSC, "מוחות בצלחת", שמדגימים מאפיינים רבים של התפתחות מוחית אנושית מורכבת. כאן מתוארת שיטה ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים במוח שמקורם ב-iPSC. האורגנואידים יכולים לסייע במידול מיקרוצפליה ראשונית אוטוזומלית רצסיבית (MCPH), הפרעה נוירו-התפתחותית אנושית נדירה. הסבר מקובל למום המוחי ב-MCPH הוא דלדול מאגר תאי הגזע העצביים בשלבים המוקדמים של התפתחות המוח האנושי, פגם התפתחותי שקשה לשחזר או להוכיח במבחנה.

כדי לחקור MCPH, יצרנו iPSCs מפיברובלסטים שמקורם בחולה הנושאים מוטציה בחלבון הצנטרוזומי CPAP. על ידי ניתוח אזור החדרים של אורגנואידים תלת-ממדיים במוח מיקרוצפליה, הראינו את ההתמיינות המוקדמת של אבות עצביים. אורגנואידים תלת-ממדיים אלה במוח הם מערכת מבחנה רבת עוצמה שתהיה חיונית במידול הפרעות מוח מולדות הנגרמות על ידי כימיקלים נוירוטוקסיים, זיהומים נגיפיים נוירוטרופיים או מוטציות גנטיות תורשתיות.

מבוא

פרעות התפתחותיות אדם, כגון ממיקרוצפלוס-, ניתן ללמוד בצורה גרועה רק במודלים של בעלי חיים בשל העובדה כי מוח האנושי יש משטח קליפת מוח מורחב, תכונה ייחודית ושונת חיות לא אנושיות.

היבט זה עושה התפתחות המוח האנושי תהליך מורכב כי לא ניתן ללמוד מספיק בתוך 2D, במערכת תרבית תאים במבחנה. מתעוררים טכניקות התרבות 3D לאפשר לדור של organoids דמויי רקמה מתאי גזע מושרים (iPSCs). במבחנת הבידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים בתרבות השעית 3D מאפשר ההיווצרות של סוגי תאים שונים במועד ובאזור ספציפי, והוליד רקמות מאורגנות, מרובדת 1, 2, 3. הודות מעבד כי חלוץ בטכנולוגיות תרבות 3D ו demystified המורכבת של היווצרות איברים, החלה מתאי גזע,פתחנו שיטה חזקה של יצירת organoids המוח להתוות אירועים מוקדמים של התפתחות מוח אנושית מודל ממיקרוצפלוס- במבחנה 1, 2, 3. ראוי לציין כי התאמנו בשיטה המקורית שפיתח לנקסטר ואח. 1 כדי ליצור organoids מוחין. שיטה זו שונתה על פי דרישות הניסוי שלנו.

מטרת מחקר מ ואח 'גבריאל. היה לנתח את המנגנונים התאיים ומולקולריים של תחזוקת תאי גזע עצבית במהלך התפתחות המוח. על מנת לעשות זאת, מחקר המכניסטי בוצע באמצעות ניתוח ובתאים עצביים (NPCs) ב organoids מוח 3D נגזר חולה ממיקרוצפלוס- 4. החולה הזה נשא מוטציה CPAP, חלבון centrosomal נשמר הנדרשים biogenesis centrosome 5. היפו מקובלהתזה היא כי ממיקרוצפלוס- הוא התוצאה של דלדול של ברכת NPC, זה עלול לנבוע גם למוות של תאים או בידול מוקדם 1, 6, 7, 8, 9.

על ידי ניתוח אזורי חדרית (VZs) של organoids המוח ממיקרוצפלוס-, הודגם כי מספר משמעותי של NPCs לעבור חלוקת התא סימטרית, בניגוד organoids המוח נגזר מתורם בריא 4. ניתוחים מיקרוסקופים וביוכימיים נרחבים של organoids מוח microcephalic חשפו תפקיד לא צפוי עבור CPAP מבולגן ריסים בזמן 4. באופן ספציפי, CPAP מוטציה מזוהה עם פירוק cilium מפגר מחדש כניסת מחזור התא מתעכבת, מה שמוביל את הבידול המוקדם של NPCs 4. תוצאות אלו מצביעות על תפקיד עבור ריסים ב ממיקרוצפלוס- ו המעורבות EIR במהלך מלא הנוירוגנזה גודל המוח 10.

חלקו הראשון של פרוטוקול זה הוא תיאור של שיטת שלושת השלבים ליצירת organoids המוח הומוגנית. כפי שהוזכר קודם לכן, הפרוטוקול לנקסטר המקורי הותאם ו שונה שמתאים למטרות שלנו 1. ראשית, iPSCs אדם מתורבת מצב מזין ללא מוגדר על Engelbreth-הולם-הנחיל (EHS) מטריקס. צעד זה ימנע את הווריאציות של תרביות תאי גזע פלוריפוטנטיים מזין תלוי. בפרוטוקול זה, בדומה להשפעת בידול העצבי להקים אפיתל עצבית מתחילה ישירות iPSCs. אם תדלג גוף embryoid (EB) צעד ההיווצרות, את ההתמיינות העצבית בצורה מבוקרת יותר וביים. גישה זו מגבילה את ההיווצרות הספונטנית undirected של שכבות תאי ניבט אחרות, כגון המזודרם ו endoderm. על ידי יישום פרוטוקול זה, neurospheres המכיל רוזטות עצבית ניתן לקצור ביום 5 עבור EHS הטבעת מטריקס ותרבות השעיה נייחת. מדיום organoid המשמש את הצעד השלישי של הפרוטוקול שלנו הוא השלים עם dorsomorphin ו SB431542. Dorsomorphin הוא מעכב מולקולות קטנות של חלבון העצם morphogenic (BMP), וכן SB431542 מעכב את TGFβ / Activin / מסלול איתות קטרים. השילוב של גורמים אלה יכול לקדם בידול עצבי בצורה יעילה יותר מאשר חומצה רטינואית לבד 11, 12, 13, 14.

בסך הכל, שינויים אלה מאפשרים לדור לשחזור של organoids המוח, עם וריאציות מינימאליות ברחבי organoids. חשוב לציין, שיטה זו יושמה כדי ליצור organoids המוח microcephalic וחסונה מן iPSCs החולה, הנושאות מוטציות בגנים המשפיעים centrosomes והדינמיקה מחזור התא.

החלק השני של פרוטוקול זה נותן הוראות להכנת brAin organoids לניתוח ופרשנות של ליקויים הסלולר ממיקרוצפלוס-. זה כולל קיבוע, cryosectioning, מכתים immunofluorescent, ואת ניתוח מיקרוסקופי confocal. פרוטוקול זה יספק את הקורא עם תיאור מפורט של תוצאות צפויות ובליווי לפרשנות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דור 1. של המוח Organoids (23 ימים)

  1. ייזום של neuroectoderm (5 ימים)
    הערה: לשים לב לנקודות הבאות יש לשקול לפני תחילת הבידול. שיטת תכנות מחדש (lentiviral-, Sendai-virus-, episomal-, או microRNA מבוסס וכו ') כדי להשיג iPSCs האנושי באופן אידיאלי צריכה להיות זהה עבור כל המטופל ולשלוט קווי iPSC. ערכות והוראות התכנות מחדש שונים המבוססים על פרוטוקולים שפורסמו זמינים 15, 16, 17, 18. איכות קווי iPSC האנושי הוא המפתח להגשמת בידול אופטימלי. נטר מורפולוגיה המושבה ואת התא עם מיקרוסקופ ולאמת מגוונת" ידי בדיקת הביטוי של סמנים כגון Oct3 / 4, Nanog, או TRA-1-60.
    1. האדם תרבות iPSCs בתנאים מזין ללא במדיום על צלחת מצופה Engelbreth-הולם-נחילמטריקס (EHS).
      הערה: Grow iPSCs אדם מזין חופשי סרום ללא לשמור על מצב התרבות מוגדר להימנע צעד נוסף להסרת תאי מזין עכבר עוברי (MEFs) לפני תחילת הבידול. מספר המעבר האופטימלי עבור iPSCs האדם להתחיל טווחי בידול מפסוק 15 על תכנות מחדש למעבר 70 בסך הכל. כאשר passaging, לנתק מושבות hiPSC כתאי המצרפי באמצעות פתרון ניתוק התא מתאים עם לחץ מכאני נמוך טפטף סרולוגיות 2-מיליליטר להעביר אגרגטים תבשיל חדש. הימנע ניתוק תאים בודדים, כמו זה עלול להשרות התמיינות אפופטוזיס ברוב קווי iPSC. עוד נמסר כי לטווח ארוך, passaging מתא בודד יכול להגדיל שינויים הגנומי האנושי iPSCs 19, 20. הימנע נהלי תא ריחוק, אשר דורשים צעד צנטריפוגה להסיר פתרון ריחוק, כמו זה מקטין את הכדאיות הכללית של iPSCs. מִבְחָןכל התרבויות עבור זיהומים מיקרוביאליים, במיוחד mycoplasma, על בסיס קבוע, כי זה עלולה לשנות את איכות iPSCs ויכולת הבידול שלהם.
      1. מעיל צלחת תרבות 60 מ"מ רקמת עם מטריקס EHS לפי הוראות היצרן.
      2. להפשיר aliquot של 1 x 10 6 iPSCs האנושי. זרעים iPSCs בצלחת בתרבית רקמה 60 מ"מ מצופה מטריצה EHS ו המכיל 5 מ"ל של מדיום (ראה טבלה חומרים). שינוי המדיום יומי המעבר לאחר 5 עד 7 ימים כאשר מגיעים תאים ~ 80% confluency.
        הערה: פרוזדור, iPSCs מופשר ב 80% confluency באמצעות שיטות סטנדרטיות, כגון ניתוק האנזים ללא מושבות 21, לפחות פעם אחת לפני תחילת הבידול. בקיצור, להסיר את מדיום iPSC, לשטוף את התאים פעם עם 37 מחומם מראש ° של בינוני נשר Modified של C Dulbecco: F12 מזין תערובת (DMEM / F12), דגירת iPSCs הבאה היצרןהוראות שימוש ריאגנט (ראו טבלת חומרים). אין לעבור את זמן דגירה המומלצת כדי למנוע ניתוק תאים בודדים. iPSCs אדם צריך להיות מנותק צף כמו אגרגטים, לא תאים בודדים כמו. הם יכולים להיות מועברים לאחר מכן מנות מצופות מטריקס חדשים EHS; למשל, iPSC אגרגטים מן המנה 60 מ"מ אחד יכולה להיות מופצת 4 מנות 60 מ"מ חדשים.
      3. בדוק mycoplasma עם ערכת גילוי mycoplasma על פי הוראות היצרן. השתמש רק iPSCs mycoplasma-חופשי, כמו mycoplasma יכול לשנות את יכולת הבידול של iPSCs.
    2. לנתק iPSCs (80% ומחוברות) ולהכין השעית תא בודד באמצעות B. ריאגנט
      1. שטפו את iPSCs פעם עם מחומם מראש (37 ° C) DMEM / F12.
      2. להוסיף B מגיב מחומם מראש (למשל, 1 מ"ל בצלחת 60 מ"מ) דגירה iPSCs עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
      3. פליק 20 פעמים עם אצבע על הצד התחתון שלהמנה לנתק את iPSCs. בדקו את ניתוק התאים תחת מיקרוסקופ.
      4. פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה בצלחת 5 פעמים עם micropipette 1 מ"ל.
      5. להוסיף 3 מ"ל של מדיום לדלל 1 מ"ל של B מגיב ולאסוף את ההשעיה תא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
      6. בעדינות לסובב את iPSCs (500 XG) במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. Resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של B בינוני לספור את מספר הסלולרי עם hemocytometer.
        הערה: שימו לב באמצעות B בינוני בלבד עבור resuspension. המנעו משימוש בינוני, מכיוון שהיא מכילה ריכוז גבוה מדי של bFGF, אשר עלול לעכב את הבידול.
    3. לדלל את ההשעיה התא 4.5 x 10 5 תאים לכל מ"ל ב B בינוני בתוספת 10 מיקרומטר Rho-מזוהה מעכב חלבון קינאז (Y-27,632).
    4. הוספת 100 μL לכל היטב צלחת לא חסיד, נ-תחתונה, 96-היטב.
      הערה: ודא התאים מופצים באופן שווה susפנסיה ידי ניעור הצינור בכל פעם לפני להוציא 100 חלקים μL. חשוב שכל היטב צריך להכיל מספר תאים שווה ערך על מנת לקבל neurospheres הומוגנית בגודל ובצורה (עגול, משטחים מוגדרים).
    5. בעדינות לסובב את הצלחת עם התאים ב 500 טמפרטורת XG ואת מקום 3 דקות לדגור 37 ° C ו 5% CO 2.
    6. שינוי המדיום יומי על ידי הסרת 50 μL והוסיף 50 μL של B הבינוני הטרי לתוך זה גם עבור 5 ימים הקרובים.

2. והטבעה Neurospheres במטריקס EHS (4 ימים)

  1. הכן בינוני neurosphere ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C בינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 ללא (w / o) ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ שאינם חיוניים חומצות אמינו (MEM), 100 U / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ ל אינסולין, ו 0.05 מ"מ β-mercaptoethanol.
  2. אסוף את השנינות neurospheresחה 200 micropipette μL באמצעות קצה ~ 2 מ"מ לחתוך בעבר עם מספריים סטרילי.
  3. מניחים את neurospheres כ 5 מ"מ אחד מהשני על הסרט פרפין (3 x 3 ס"מ 2) בצלחת 100 מ"מ ריק ולהסיר בזהירות כמה שיותר המדיום הנותרים ככל האפשר.
  4. להוסיף טיפה (7 μL) של מטריקס EHS על כל neurosphere יחיד.
  5. דגירת מטריקס EHS יורד עם neurospheres עבור 15 דקות באינקובטור.
  6. שטפו את neurospheres בקפידה מתוך הסרט פרפין ידי שטיפה אותם עם המדיום neurosphere. כדי לשטוף, להשתמש micropipette 1 מ"ל ו צלחת פטרי חדש 100 מ"מ המכיל 10 מ"ל של מדיום neurosphere.
  7. דגירה neurospheres עבור 4 הימים הבאים ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום neurosphere טריים ביום 2.
    הערה: ודא כי המדפים בחממה הם שטוחים כך neurospheres מטריקס-מוטבע EHS לא יהיה גוש יחד בצד אחד של הצלחת.

3. Organoids ב השעיה רוטריתרבות (14 ימים)

  1. כן בינוני מוח organoid ידי ערבוב את הדברים הבאים: 1: תערובת 1 של DMEM / F12 ו- C הבינוני (נ / V), 1: 200 (נ / נ) תוספת 1, 1: 100 (נ / נ) תוספת 2 w / o ויטמין A, 1: 100 L- גלוטמין, 0.05 מ"מ MEM, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ"ל, 1.6 גר '/ אינסולין L, 0.5 מיקרומטר dorsomorphin, 5 מיקרומטר SB431542, ו 0.05 β-mercaptoethanol מ"מ.
  2. מוסיפים 100 מ"ל של המוח organoid בינוני בקבוק אחד טווה באמצעות זרועות הצד שלה ולמקם אותם באינקובטור במשך מחמם מראש עבור דקות 20 לפחות.
  3. הגדרת תוכנית ערבוב ב 25 סל"ד, בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: לפני העברת neurospheres EHS-מוטבע מטריצה ​​לתוך צלוחיות טווה, לוודא כי הם כל מופרדים. אם שניים או יותר מחוברים באמצעות מטריצת EHS, להפריד אותם על ידי חיתוך המטריצה ​​חיבור עם אזמל.
  4. להעביר בזהירות את neurospheres EHS-מוטבע מטריצה ​​לתוך צלוחיות טווה המכיל 100 מ"ל של מדיום organoid לנוing פיפטה סרולוגיות 2 מ"ל. השתמש בנשק הצד של הבקבוק הטווה להעביר את neurospheres לתוך הבקבוק.
  5. מניח את הצלוחיות טווים על פלטפורמת בחישה מגנטית באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO 2; זהו יום 0 של תרבות organoid.
  6. שינוי המדיום פעם בשבוע (או בתדירות גבוהה יותר כאשר יש שינוי צבע) על ידי הסרת המחצית הבינונית ומוסיף אותה הכמות של מדיום חדש.
    הערה: כאשר לוקחים את צלוחיות טווה מתוך האינקובטור, להמתין 3-5 דקות כדי לתת organoids לשקוע לתחתית של הבקבוק. הסר את המדיום ידי הצבת קצה פיפטה זכוכית (מחוברת משאבה) על פני השטח של הנוזל; לשאוב את המדיום בזהירות באמצעות פתיחת צד אחד / זרוע של הבקבוק. מניפולציות אלה חייבים להיעשות מתחת למכסת המנוע למינרית.

ניתוח 4. של המוח Organoids

  1. קיבוע של organoids
    1. אסוף את organoids ביום 14 של Wi תרבות הבקבוק טווהth micropipette מ"ל קיצוץ 1 (חתך ~ 5 מ"מ). שים את כל אותם בצלחת 60 מ"מ ו לשטוף אותם פעם אחת עם 5 מ"ל של DMEM / F12 חם עבור 3 דקות.
    2. הכן צינור 1.5 מ"ל עם 500 μL של paraformaldehyde 4% חם (PFA).
      זהירות: ילבש עור ומשקפי מגן ולעבוד מתחת למכסת מנוע בטיחות בעת הטיפול מקבע PFA.
    3. מניחים כל organoid בנפרד בכל צינור ולתקן אותם למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. אין לתקן את organoids יותר מ 60 דקות. כדי להזיז את organoids, להשתמש בלולאת חיסון או כל לתכנן אחרים כי הוא נוח.
    4. הסר את PFA לשטוף את organoids קבוע פעמיים עבור 10 דקות כל אחד עם 1 מ"ל של PBS.
    5. אחסן את organoids ב 1 מ"ל של PBS על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 7 ימים, עד לשימוש נוסף.
  2. המטעת organoids עבור Cryosectioning
    1. הסר את PBS ולהוסיף 1 מ"ל של סוכרוז 30% בפתרון מים מזוקקים לכל צינור כדי ליבש את organoids לפני cryofreezing אותם; לאחר הוספת sucrose פתרון, organoids יש צף על פני השטח. אחסן את organoids לילה פתרון סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס; על ידי למחרת organoids צריך שקע לתחתית של התחתית.
      הערה: ניתן לאחסן Organoids עד 3-5 ימים בבית 4 ° C בתמיסה סוכרוז, במידת הצורך.
    2. ממלאי תבנית ויניל דגימה עם 400 μL של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) ולהשתמש לולאת חיסון למקם organoid במרכז התבנית. סמן שפת התבנית עם שם המדגם.
    3. להקפיא את התבנית organoid המכילים בבית -80 ° C עד Cryosectioning.
    4. cryoslides זכוכית מעיל עם 0.1% פתרון פולי- L- ליזין (PLL) ב PBS עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולתת את השקופיות להתייבש במשך 3 h. אחסן את השקופיות ב 4 ° C ו לחמם אותם לחדר ממוזג לפני השימוש.
      הערה: PLL ציפוי הוא צעד חשוב, כפי שהוא ימנע את פרוסות organoid מן צפתי משם. אוספים ושומרים פתרון PLL ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3חודשים. לפני שימוש חוזר, לסנן אותו עם מזרק 0.22 מיקרומטר ולתת לו חם לטמפרטורת החדר.
    5. סעיף cryofrozen organoids לתוך 20-50 פרוסות מיקרומטר בעובי על זכוכית מצופה PLL cryoslides 22. תנו שקופיות עם חלקים להתייבש במשך 1 שעות בטמפרטורת החדר. אחסן את הסעיפים ב -80 ° C עד עיבוד נוסף.

5. Immunofluorescent מכתים סעיפים Organoid

הערה: האפיון הכללי של organoids, צביעה עם nestin, סמן ובתאים עצבי, ו Tuj1, סמן הפאן עצבי, מומלץ. כדוגמאות נוספות, מכתים immunofluorescent עם phospho-vimentin (p-Vim), אשר תוויות בתאי גליה רדיאלי המיטוטי הפסגה, ואת Arl13b, עבור cilium, מתוארים. כדי לבדוק אפופטוזיס, להשתמש במסוף deoxynucleotidyl transferase (TDT) dUTP ניק-End תיוג (TUNEL) assay. מניחים את השקופיות קופסת פלסטיק במהלך incubations כדי להגן עליהם מפני אבק, אור,וייבוש.

  1. להפשיר את השקופיות עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. שטפו את השקופיות פעמיים עם 200 μL של גליצין PBS (0.225 גרם של גליצין ב PBS) עבור 3 דקות כדי להרוות את autofluorescence המושרה PFA.
  3. Permeabilize הסעיפים עם 200 μL של 0.5% טריטון X100 / 0.1 Tween% בתמיסה PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לשטוף אותם פעמיים עם 200 μL של פתרון PBS-גליצין עבור 3 דקות.
  5. דגירה אותם עם 200 μL של ג'לטין דגים 0.5% / 0.1% טריטון X100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C לחסום מחייב אנטיגן ספציפי.
    הערה: אם assay TUNEL נדרש, לבצע את assay לפי הפרוטוקול של היצרן. התחל עם assay TUNEL לפני ביצוע immunostaining, כיוון שהוא עלול להפריע נוגדנים משני להרוות fluorophores כאשר נעשה שימוש לאחר מכן.
  6. לדלל את הנוגדנים בחסימת פתרון בריכוזים הבאים: nestin, 1: 200; p-Vim, 1: 500; Tuj1, 1: 200;Arl13b, 01:20; ונוגדנים משניים, 1: 1000.
  7. דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הראשון (למשל, nestin) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C..
  8. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
  9. לדלל את נוגדן 1 משני הראשון (אנטי העכבר 488): 1000 בחסימת פתרון דגירה השקופית 200 μL במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר. מעכשיו, תמיד להגן על שקופיות אור.
  10. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
  11. דגירה עם 200 μL של הנוגדן הראשוני הבא (למשל, Tuj1) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
  12. לשטוף דק '3 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
  13. הוספת 200 μL של נוגדנים משני הבא (נגד ארנב 647) במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר.
  14. לשטוף 3 x 3 דקות. עם 200 μL של פתרון לחסימה.
  15. הוספת 200 μL של 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בכל קונצרט כלשהו 30 ננומטרentration ב PBS עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר מכתים גרעיני.
  16. לשטוף דק 2 x 3 עם 200 μL של פתרון לחסימה.
  17. לשטוף דק 1 x 1 עם 200 μL של מים מזוקקים ולתת החלקים להתייבש במשך 10-20 דקות, עד שאין טיפת מים ברורה גלויה יותר.
  18. הר קטעים עם הטבעה בינוני. לאחסן אותם מפני אור ב 4 ° C עד מספר שבועות.
  19. המשך עם ניתוח מיקרוסקופי לתמונה סקירה של אזור organoid, חדרית, צלחת קליפת המוח הפרימיטיבי, ותחומי עניין אחרים.
  20. שימוש במיקרוסקופ confocal עם שמן 63X מסננים אובייקטיביים פלורסנט, נבחר על פי הנוגדנים משני הניאון מתויג צבע השמש 1, 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הדור של organoids המוח דורש לפחות שלושה שבועות של culturing רציפה (איור 1A). כדי להשיג תוצאות לשחזור, אנו ממליצים כי החוקר מתעד כל צעד, חשוב, ימנע שינויים כלשהם לגבי רכיבים בינוניים, בנקודות זמן, וטיפול תא. הנה, אנחנו נותנים תמצית כיצד להעריך אם אבני דרך קריטיות מתקבלות על מנת לקבל organoids באיכות מספקת בסוף הניסוי. היווצרות neurospheres בתוך צלחת 96-היטב צריכה להיות בבירור מיום 4. Neurospheres יכול להיות מוכר מוגדרים היטב בתחומים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MCPH היא הפרעה נוירו-התפתחותיות מורכבות אנושית שלא ניתן לסכם במודלים של בעלי חיים in vivo או תרבית תאים אנושיים פשוטים גישות במבחנה. הביטוי הקליני של MCPH מתחיל להופיע במהלך הטרימסטר הראשון, כאשר בתחילת נוירוגנסיס מתחיל. לפיכך, organoids מוח 3D מייצג מערכת ניסיונית אמינה מודל פיתוח MCPH. בנוסף, organoids המוח האנושי 3D הוא גישה אידיאלית מאז i) הם מאפשרים ההתאמה של ספקטרום של דגימות חולות עם רקע גנטי שונה, ii) הם מציגים רקמות מאורגנות המכילות סוגי תאים עצביים שוני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פריץ תיסן קרן (Az.10.14.2.152). אנו מודים למתקן הטבעת רקמות ואת מתקן גרעין מיקרוסקופ של CMMC. אנו מודים על הדיונים ותמיכה טכנית מסופק על ידי חברי המעבדה לביולוגיה centrosome ו נוגדנים. אנו מודים לי מינג Gooi להגהה את כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן משני נגד עכבר 488InvitrogenA-11001נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L), אלקסה פלואור 488
נגד ארנב 647InvitrogenA-21245נוגדן משני נגד ארנב עיזים IgG (H+L), אלקסה פלואור 647
Arl13bפרוטאינטק17711-1-APARL13B נוגדן רב-שבטי ארנב 
מערכת CELLSPINIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; ספקים מרובים
DMEM/F-12Gibco, US31331093מדיום הנשר השונה של Dulbecco: תערובת נוטריאנטים F-12 
דורסומורפיןסיגמא-אולדריץ', ארה"בP5499תרכובת C; ספקים מרובים
הטמעת מדיוםAppliChemA9011, 0100Mowiol; מדיום הטבעה; ספקים מרובים
מטריצת Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)Corning354277Matrigel מטריצה מוסמכת hESC; חשוב: ג'לטין דגים מוסמך hESC
 סיגמא-אולדריץ', ארה"G7765-250 מ"לג'לטין מעור דגי מים קרים; ספקים מרובים; חיטוי לאחר הוספה ל-PBS להמסה ועיקור, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
גליציןAppliChemA1067,1000גליצין לביולוגיה מולקולרית; ספקים מרובים 
לולאת חיסון עם מחט, חד פעמית (1 ומיקרו; L)סיגמא אולדריץ', ארה"בBR452201-1000EAספקים מרובים 
אינסוליןסיגמא-אולדריץ', ארה"בI3536-100MGספקים מרובים
L-גלוטמיןגיבקו, ארה"ב25030081L-גלוטמין (200 מ"מ)
טכנולוגיות תאי גזעבינוניות A#05850mTeSR1 (מדיום hiPSC)
טכנולוגיות תאי גזעבינוניות B#05835מדיום אינדוקציה עצבית (NIM); מדיום התמיינות עצבית
בינוני CGibco, ארה"ב21103049עצבי בזאלי בינוני
MEMGibco, ארה"ב11140035 תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM (100x)
ערכת זיהוי מיקופלזמה MycoAlertלונזה, שוויץ#LT07-218ערכת זיהוי מיקופלזמה; ספקים מרובים
NestinNovus biologicalsNBP1-92717נוגדן חד שבטי של עכבר נסטין (4D11)
פרפורמלדהיד (PFA)AppliChemA3813, 05004% ב-PBS, פתרון אחסון ב-20 מעלות; C; זהירות: יש ללבוש מגן עור ועיניים ולעבוד מתחת למכסה המנוע 
טבליות PBSGibco, ארה"ב18912014ראה יצרן&חריף; הוראות; ספקים מרובים
פניצילין-סטרפטומיצין (10.000 יח'/מ"ל)גיבקו, ארה"ב15140122ספקים מרובים
תמיסת פולי-L-ליזין (PLL)סיגמא-אולדריץ', ארה"בP8920-100MLספקים מרובים
pVimMBLD076-3Sפוספו-וימנטין (Ser55)
מגיב A טכנולוגיות תאי גזע# 05872הערה לפרוטוקול 1.1.1.2; ReLSR (מגיב לבחירת תאי ES ו-iPS אנושיים ללא אנזימים); אנא עקוב אחר manufactorer´ פרוטוקול s; מוצרים חלופיים מספקי muliple זמינים
Reagent B סיגמא-אולדריץ', ארה"בA6964-100MLפתרון Accutase הוא פתרון אנזימטי לדיסוציאציה של תא בודד; ספקים מרובים; פרוטוקול 1.1.2 "פתרון דיסוציאציה של תאים אנזימטיים"  
מחקר Cryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 Sמספר ספקים
SB431542Selleckchem.comS1067ספקים מרובים
בקבוק ספינר 250 מ"לIBS Integra Bioscience182026
SucroseAppliChemA4734, 1000ספקים מרובים
Superfrost אולטרה פלוס מיקרוסקופ שקופיותתרמו מדעי, ארה"בJ3800AMNZיש לסמן את השקופיות עם "+" וטעון חיובית
תוסף 1Gibco, US17502048תוסף N-2 (100x)
תוסף 2 w/o ויטמין AGibco, US12587010תוסף B-27 (50x), מינוס ויטמין A; ספקים מרובים
Tissue-Tek CryomoldSakura, NL4565ספקים מרובים
Tissue-Tek O.C.T. תרכובתSakura, NL4583ספקים מרובים
Triton X-100AppliChemA1388,0500ספקים מרובים
TUJ1Sigma-Aldrich, ארה"בT2200& beta;-טובולין III (ארנב פוליקלונלי)
בדיקת TUNEL Promega, ארה"בG3250DeadEnd פלואורומטרי מערכת TUNEL; ספקים מרובים
Tween 20 לביולוגיה מולקולריתAppliChemA4974,0500ספקים מרובים
גיליון עמיד למיםחברת BEMIS, בע"מ.PM996Parafilm " M”; ספקים מרובים
Y-27632 Selleckchem.comS1049מעכב רוק (Y-27632 2HCL); ספקים מרובים
&-מרקפטואתנולGibco, ארה"313500102-מרקפטואתנול (50 מ"מ); ספקים מרובים
ב ב

מקורות

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307(2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646(2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759(2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

iPSCiPSCs
הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.