מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתרבית של המיוזה היא תהליך התפתחותי דינמי כי מתרחשת בתאי הנבט, ניתן ללמוד מאופיין. באמצעות שיטה כדי להפיץ את הגרעינים על פני השטח של שקופיות (ולא לזרוק אותם מגובה), נדגים שיטת אופטימיזציה על העכבר spermatocytes אשר תוארה לראשונה בשנת 1997. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב במעבדות ללמוד בתרבית של המיוזה כי זה מניב שפע של גרעינים איכותיים שעברו substages של prophase אני וכמה בקוריאנית ממוקמים תחילה בתמיסה היפוטוניק להתנפח spermatocytes. ואז spermatocytes משתחררים אל פתרון סוכרוז ליצירת השעיה תא, גרעינים פזורים על גבי מדרון זכוכית ספוג מקבע. בעקבות immunostaining, מגוון של חלבונים שהם נוגעים לתהליכים meiotic יכולים להיבדק. לדוגמה, חלבונים של המתחם synaptonemal, מבנה התלת-צדדי המחבר בין כרומוזום הצירים/הליבות של homologs יחד, ניתן בקלות לאבחן. רקומבינציה meiotic חלבונים, אשר מעורבים תיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, יכול להיות גם immunostained כדי להעריך את ההתקדמות של prophase אני. כאן אנחנו מתארים ומדגימים בפירוט טכניקה בשימוש נרחב ללמוד בתרבית של מיוזה ב spermatocytes של נער או מבוגר זכר עכברים.
מבוא
עכברים הם בשימוש נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מיוזה ביונקים. ניתן להעריך תהליכים התפתחותיים רגילים והן פגמים להתרחש במהלך המיוזה. ניתן לאפיין את ציר הזמן ואת ההתקדמות של תכונות בולטות להתרחש במהלך prophase ו- substages, כמו גם שפע של חלבונים ספציפיים המעורבים בתהליכים מכריע רגולציה של מיוזה פראי סוג ועכברים מוטנטים. מספר תהליכים מיוחדים המתרחשים במהלך המיוזה שניתן יהיה ללמוד בפירוט (נבדקה הנדל ו Schimenti1). אלה כוללות מערך כפול-strand break (DSB) ה-DNA ותיקון, רקומבינציה, היווצרות קומפלקס synaptonemal, ו כרומוזום סגרגציה.
היבט חשוב של הלומדים תהליכים meiotic הוא היכולת לבחון גרעינים המכילים כרומוזום הומולוגי הנפתרות חז....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל השיטות מעורבים עכברים מנוצל אתיות גבוהה וסטנדרטים רווחה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל.
1. הכנה של פתרונות וכלים הדרושים
- להכין היפוטוניק החילוץ מאגר לייצוגית ב 50 מ של מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית, pH 8.2-8.4 (טבלה 1). להפוך את הפתרון טרי כל הזמן, לשמור על הקרח, והשתמש בתוך 2 h הכנת כפולות; הדבר נחוץ למטב את הפחתת ואת פרוטאז עיכוב פעילות של DTT ושל PMSF, בהתאמה. השתמש 10 מ"ל של מצגת עבור כל זוג של העכבר האשכים.
- להכין פתרון סוכרוז 100 מ מ (טריים בכל פעם) על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז 10 מ"ל של הנדסה גנטית מעבדה כיתה מים. להתאים את ה-pH ל 8.2
- להכין פתר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
היכולת של שיטה זו לספק מספר רב של השטח להפיץ גרעינים המכילים homologs שלם תלוי בשלושה גורמים עיקריים: 1) זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה במאגר היפוטוניק (דהיינו האם) כדי להשיג שלמאחה מתנפח spermatocyte הגרעינים פרץ, אך לא מתפוררות מ ממושך דגירה של מצגת, 2) micropipetting טיפות סוכרוז של תאים כדי לקבל השעיה מופרדים של גרעינים זה לא מקובצים יחד ו- 3) הטיית כל מקבע מצופה לשקופיות בכיוון אחד בכל פעם לא אחורה וקדימה. לאחר התפשטות מוכן, משטח גרעינים יכול להיות immunostained עם נוגדנים fluor.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כדי לקבל מספר גבוה של איכות להפיץ. ובכן, טוב spermatocyte גרעינים, השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה לכלול זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה מצגת, המתאימה הא של וכמה בקוריאנית, והעסיק הטכניקה כדי התפזר התליה תא סוכרוז השקופיות מצופה מקבע. אנחנו דגירה בקוריאנית וכמה מן האשכים של הזכרים פראי סוג החל היום לאחר הלידה 15 לבגרות במצגת למשך 45 דקות, תוך האשכים מ וזהובה בגילאי Chtf18-עכברים null מודגרת למשך 30 דקות בלבד כי האשכים בגודל חצי ומכילים באופן משמעותי פחות בתאי הנבט8. מניסיוננו, דג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים להכיר את הסיוע הטכני של אביגיל האריס. הם גם מכירים כהן פאולה, קים הולוויי שעזרת כדי למטב את הפרוטוקול של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes. המחברים גם מעריך קריאה ביקורתית של כתב היד על-ידי קארן שינדלר.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM106262 כדי K.M.B.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פוטו-פלו 200 | קודאק | 1464510 | |
| 16% פרפורמלדהיד (תמיסה מימית פורמלדהיד) | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | לדלל תמיסה של 16% ל-4% מלאי עבודה עם 1X PBS ולהקפיא את הכמות ב-20 מעלות; C |
| טפלון מודפס 3 שקופיות טבעת | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 63418-11 | |
| שקופיות זכוכית חלבית פרימיום לא טעונות | מספר מותגים | מסחריים נקו שקופיות באלכוהול אתילי או איזופרופיל והניחו לטפטף להתייבש לפני השימוש; שקופיות תווית על קצה חלבי עם טוש או עיפרון קבוע בהתאם לשימוש לאחר מכן בשקופיות | |
| מספריים כירורגיות (טיפים חדים ובוטים) | כלי | מדע עדינים14001-12 | מותג שונה מסוג דומה יעבוד |
| מספריים כירורגיות עם קצה דק (טיפים חדים) | Fine Science | Tools 14058-11 | מותג שונה מסוג דומה יעבוד |
| מלקחיים ישרים עם קצה עדין | Fine Science Tools | 11050-10 | מותג אחר מסוג דומה יעבוד |
| מלקחיים מעוקלים עם קצה בינוני | פישר | 16100110 | מותג אחר מסוג דומה יעבוד |
| ידית אזמל | Fine Science Tools | 10003-12 | מותג שונה מסוג דומה יעבוד |
| עכבר אנטי-SYCP3 | Abcam | ab97672 | השתמש בשעה 1:300 |
| חלבון אנטי צנטרומר (נגזר מסרום מטופל CREST אנושי) | נוגדנים משולבים | 15-234-0001 | השתמש בשעה 1:50 |
| תא | אנו משתמשים בכלי תרבות מרובעים Nunc 500 ס"מ / באר עם נייר לח מגבות | ||
| מיקרוסקופ שדה רחב עם מיקרו-מערכות אפיפלואורסצנטיות | Leica | כל דגם סטנדרטי | |
מקורות
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
