פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של Clostridium difficile בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Summary

יעילות האנטיביוטיקה נקבעת לרוב על ידי ביצוע מחקרים קינטיים להרג ומדידת יחידות יוצרות מושבה (CFUs). על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם שיטות סטנדרטיות אלה, אנו יכולים להבחין בין ההשפעות הפרמקולוגיות של הטיפול בין אנטיביוטיקות שונות.

Abstract

הערכה של פעילות אנטיביוטית עם פיתוח תרופות חדשות מכוונת נגד חיידקים אנאירוביים קשה ותובענית מבחינה טכנית. כדי לקבל תובנה אפשרי MOA, שינויים מורפולוגיים הקשורים לחשיפה אנטיביוטיקה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). שילוב הדמיה SEM עם עקומות להרוג מסורתיים עשוי לשפר את התובנה שלנו לתוך הפעולה סמים לקדם את תהליך הפיתוח של התרופה. כדי לבדוק את הנחת היסוד, להרוג עקומות ומחקרים SEM בוצעו באמצעות תרופות עם ידוע אך שונה MOA (vancomycin ו metronidazole). ג תאים difficile (R20291) גדלו עם או ללא נוכחות של אנטיביוטיקה עד 48 שעות. במהלך 48 שעות המרווח, תאים נאספו בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע יעילות אנטיביוטיקה עבור הדמיה על SEM. בהתאם לדו"חות קודמים, vancomycin ו- metronidazole היו בעלי פעילות חיידקית משמעותית לאחר 24 שעות של טיפול, כפי שנמדד על ידי היחידה להרכיב מושבות (CFU)טינג. באמצעות הדמיה SEM קבענו כי metronidazole היו השפעות משמעותיות על אורך התא (> ירידה של 50% באורך התא עבור כל אנטיביוטיקה, P <0.05) לעומת בקרים ו ונקומיצין. בעוד התגובה הפנוטיפית לטיפול תרופתי לא תועדה בעבר באופן זה, הם עולים בקנה אחד עם MOA של התרופה המדגימה את הרבגוניות והאמינות של ההדמיה והמדידות ואת היישום של טכניקה זו עבור תרכובות ניסיוניות אחרות.

Introduction

Clostridium difficile הוא חיידק החיידק החיידקי , הגורם לגרימת כ -500,000 זיהומים בשנה בארה"ב ונחשב לאיום פתולוגי דחוף לאיום על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), רמת הסיכון הגבוהה ביותר. ¹ בעשור האחרון חלה התפתחות משמעותית של תרופות במיקרוביאלים עם פעילות נגד C. difficile . ^{2 , 3} במבחנה הלימודים הם מרכיב הכרחי של תהליך הפיתוח של התרופה. ^{4 באופן} מסורתי, רגישות במבחנה והזמן להרוג מחקרים משמשים כדי לאמת בעתיד חיה ואחרים במחקר vivo .

בעוד ששיטות אלה משמשות תפקיד חשוב בהערכת פעולת הריגה, הן אינן קולטות את התגובה הפנוטיפית של התאים לטיפול תרופתי. על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם standarD הריגת מחקרים קינטיים, אפיון יסודי יותר של ההשפעות הישירות של אנטיביוטיקה אפשרי. ^{5 , 6 , 7} כאן, אנו מציגים שיטה שבה SEM משמש כאמצעי פרופיל פרופיל היעילות של טיפול אנטיביוטי.

Protocol

1. בידוד C. difficile ממקורות סביבתיים או קליניים שונים

1. בידוד סביבתי: שימוש במדד כותנה טרום מעוקרים (רטוב קלות עם 0.85% NaCl), ספוג את פני השטח של כל תחום עניין (קומה, דלת, ידית, מדף וכו ' ). ⁸ הקפד ללבוש כפפות סטריליות במקום ספוגית צינור מעוקר לאחר השלמת.
2. מבודד קליני (שרפרף): צלחת 10 עד 100 מ"ג של דגימות צואה קלינית על cefoxitin-cycloserine-fructose אגר (CCFA) באמצעות לולאה חיסון ו דגירה בתנאים אנאירוביים מחמירים עבור 48 - 72 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. ^{7 , 9 , 10}
3. להעשיר את דגימות ספוגית הסביבה במוח הלב עירוי (BHI) מרק עם 0.05% taurocholate נתרן מקום בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוסבמשך 5 ימים. צנטריפוגה 1 מ"ל של התרבות ב XG 10,000 ו resuspend גלולה μL 100 של אתנול.
4. פלייט התאים resuspended (50 μL) על cycloserinecefoxitin אגר fructose (CCFA) צלחות דגירה בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 - 48 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים.
5. מבחן חשודים מושבות C. difficile באמצעות מגיב לטקס לטקס או PCR.

2. Culturing C. difficile והרג תהליכים קינטיים

1. לגדול מטוהרים סביבתיים או קליניים C. זנים difficile על צלחות אגר דם בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
2. קח מושבה בודדת אחת עם לולאה חיסון, להעביר אותו 5 בינוני מ"ל BHI בצינור 15 מ"ל, ולגדול במשך 24 שעות בתא אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס.
3. לדלל את תרבויות מראש 1: 100 עד כ 10 ⁶ מושבה להרכיב יחידהS (CFU) / מ"ל ​​ב BHIS טריים מופחת מראש (BHI בתוספת 5 גרם / L תמצית שמרים 1% L- ציסטאין) בתוספת 0.1% נתרן taurocholate ואת הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה (T0).
4. איסוף מדגם 1 מ"ל עם פיפטה בכל נקודת זמן (T0, T6, T24, T48) ו צלחת / להפיץ aliquot קטן (100 μL בדילול סדרתי) על צלחת אגר דם. בואו התאים לגדול על צלחת אגר דם במשך 48 שעות בתא אנאירובית ב 37 ° C ולספור את מספר המתקבל של מושבות לקבוע CFU.

הכנת דוגמאות עבור סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים

1. איסוף 1 מ"ל של תאים מנקודת זמן בכל צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 10 דקות. מחק את supernatant תאים לשטוף PBS.
2. צנטריפוגה דגימות ב XG 10,000 במשך 10 דקות שוב להשליך supernatant. מחדש לדלל תאים 1 מ"ל של paraformaldehyde 4% ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
3. צנטריפוגה דגימות שוב 10 דקות ב 10,000 xg וזורקים supernatant. לשטוף תאים פעמיים עם מים מזוקקים ו redillute ב 100 μL של מים מזוקקים. התאם את עוצמת הקול בהתאם עכירות של הפתרון.
   הערה: ביצוע דילולים סדרתי מרובים הוא רעיון טוב.
4. תווית coverslips ולהוסיף 40 μL של המדגם על זה. לדגור במשך 15 דקות במנוע הזרימה להתאדות הנוזל ולאפשר לתאים לדבוק coverslip. אם הנוזל עדיין קיים, השתמשו במפוח כדי להסיר את הנוזל.
5. מקום coverslips שכותרתו עם תאים בשולחן מכונת המקרטעת ואת הקלטת למטה. זהב טהור מאובטח במכונה המקרטעת. הפעל את המכונה והתחל לדהור בלחץ נמוך (50 mTorr). תאים מעיל עבור 30 s ב 80 mA, אשר מתרגמת 20 ננומטר של ציפוי זהב.
6. העברת תאים מצופים אל מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

4. הדמיה ג תאים difficile על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

1. הפעל את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כראוי על ידי יחסי ציבורEssing את לחצן הפתיחה על תוכנת המחשב.
2. באמצעות קלטת פחמן, מאובטח coverslips מצופה על במת מתכת. לאחר SEM הוא פרקו, הדלת צריכה לפתוח בקלות. נעל את הבמה המתכת לתוך תא SEM ידי דופק אותו.
3. לחץ על לחצן PUMP בתוכנת המחשב. SEM יהיה שמיש כאשר המערכת קוראת "אישור OK".
4. לחץ על גלאי SE תחת הכרטיסייה גלאים. הפעל את הקורה על ידי לחיצה על הלחצן המציג את המתח. התחל הדמיה במתח נמוך (5 קילו וולט) לפני המתח הגובר (עד 15 קילו וולט). תמונה תופיע לאחר שהקורה מופעלת.
5. באמצעות פונקציית המעקב, למצוא שטח על coverslips מצופה לתמונה. זום לתוך האזור ולמצוא מבנים בצורת מוט; אלה הם clustridium difficile .
6. התקרב והתמקד בתמונה כדי לכייל את המערכת. זה צריך להיעשות במרחקים עבודה מרובות: 15, 9 ו - 5 מ"מ. תמונה במרחק עבודה של 5 מ"מ.
7. הפעל את ULtra מצב הדמיה ברזולוציה גבוהה ולהתחיל להתמקד לייעל אסטיגמציה.
8. התחל להתמקד בהגדלה גבוהה. השתמש להתמקד גס עדין עבור זה. התאם אסטיגמציה גם כדי לקבל תמונה ברורה יותר.
   1. התאם אסטיגמציה בהגדלה גבוהה. כדי לעשות זאת, להתאים את אסטיגמטיזם מחליף (הם נראים דומים קנס / להתמקד מחוספס להתמקד) ולבדוק את התמונה לבהירות דיגיטלית על ידי התקרבות על תוכנת המחשב.
9. Se את פונקציית סריקה איטית לאסוף תמונה באיכות גבוהה. שמור את התמונה שנאספה כקובץ TIFF, שישמש לניתוח. ודא את שורת הנתונים נבחרה אם המדידות ייעשה במהלך הניתוח.
10. איסוף תמונות בזוויות שונות (עד 52 ° על ידי הפיכת באופן ידני את הזווית ישירות על SEM. תמונות זווית נוטים לחשוף מידע עומק יותר.
11. שינוי מתח קרן בהתאם לתאים כי הם הדמיה. שמור את זה בעיקר בין 5-15 kV לכל הניסויים.
12. לאחר ההדמיה הושלמה, להפוך את קרן ולהעלות את המרחק עובד 20 מ"מ. החדר יכול אז להיות vented ואת הבמה ניתן להסיר. להעתיק את כל התמונות על הכונן לניתוח נוסף.

5. עיבוד תמונה וניתוח

1. הורד והתקן את התוכנה הזמינה באופן חופשי, FIJI (http://fiji.sc), אל המחשב.
2. פתח את קובץ התמונה ב- FIJI.
3. בעזרת פונקציית הקו, עקוב בדיוק אחר סרגל הסולם.
4. לחץ על הכרטיסייה ניתוח בתוכנית FIJI ולבסוף לבחור את הפונקציה בחר סולם. יופיע חלון שיידרש את הגדרת המרחק הידוע בהתבסס על סרגל הסולם. לשנות את יחידת אורך גם כן ולחץ על אישור.
5. עכשיו כי התוכנית מכויל למרחק, להשתמש בפונקציה הקו למדוד אורך התא. כדי להשיג את אורך, להשתמש בפונקציה הקו כדי לעקוב אחר התא בשלמותו. בחר שוב בכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן לחץ על מדידה. אורך צריך Appהאוזן ביחידות שצוין קודם לכן.

Results

Clostridium difficile הוא חיידק להרכיב נבג ולכן חשוב לקבוע את ההבדלים מורפולוגיה בין תאים צמחיים ו נבג לפני ניתוח פונקציונלי. איור 1 מציג תמונות מייצגות של תאים צמחיים שנתפסו במהלך השלב המעריכי של עקומת הצמיחה ותאי נבג. כפי שמתואר, תאים צמחיים הם מבנים ארוכים, חלקה, בצורת מוט, ואילו נבגים הם מבנים קטנים, סגלגל בעל החיצוני מחוספס. מבחינה תפקודית, תאים צמחיים לגדול ולהתחלק במהירות אחראים על ארסיות של זיהומים C.<...

Discussion

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת תפוקה גבוהה לבידוד C. difficile ובדיקת רגישות אנטיביוטית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כאמצעי לאפיון יסודי יותר של הפעולה הפרמקולוגית של האנטיביוטיקה. באמצעות הפרוטוקולים המפורטים כאן, הוכחנו כי הדמיה התגובה הפנוטיפית של התא לטיפול אנטיביוטי יכול לחשוף תובנה הפעולה הפרמקולוגית של התרופה. בסך הכל, החלק הדמיה של פרוטוקול זה לוקח בערך 2 שעות משך לאחר איסוף התאים, אבל יכול להיות הרבה יותר מפלה מאשר הרג טיפוסי מחקרים קינטיים לבד. בעו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
גזה כותנה	טיפול	PRM21408C
NaCl	Macron	7532
שפופרות 50 מ"ל	Falcon	352098
עירוי לב למוח (BHI)	קריטריון	C5141
L-ציסטאין	אלפא Aesar	A10389
תמצית שמרים	קריטריון	C741
נתרן טאורוכולט	אלפא Aesar	A18346
תא אנאירובי	קוי		ויניל תא אנאירובי
ציקלוסרינצפוקסיטין פרוקטוז אגר (CCFA) לוחות	אנאירוב מערכות אנאירוביות	AS-213
צלחות אגר דם	אבחון הארדי	A-10
מגיב לטקס אגלוטינציה	אוקסואיד	DR1107A	C. diff ערכת בדיקה
צינורות מיקרוצנטריפוגה	Eppendorf	222363204
PBS	Gibco	10010-031
4% פרפורמלדהיד	פישר סיינטיפיק	50-259-98
שקופיות מיקרוסקופ	ג'יי מלווין משוחרר מותג	7525M	75 x 25 מ"מ
מכסה זרימה	Labconco	Class II סוג A2	ארון בטיחות ביולוגית
מכונת מקרטע שולחן	דנטון ואקום	שולחן II
קלטת	פלסטיק ליבת	05072-AB	SPI דבק דו צדדי סרט פחמן
זהב	דנטון ואקום	TAR001-0158	2.375 אינץ' קוטר x 0.002 אינץ' רדיד זהב עבה
סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים	FEI	XL-30