ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש במבחנה דגם של מחסום אנושי דם-מוח

סיכום

כאן, אנו מתארים מודל מחסום דם-מוח אנושי המאפשר לחקור גלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה.

תקציר

extravasation לימפוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי עבור מעקב חיסוני. מחלות הקשורות שינויים של extravasation הלימפוציטים עלול לגרום לשינויים פתופיזיולוגיים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, החקירה של הגירה לימפוציטים לתוך CNS חשוב להבין מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ועל מנת לפתח גישות טיפול חדשות. כאן אנו מציגים מודל במבחנה של מחסום דם-מוח האדם ללמוד extravasation הלימפוציטים. המוח כלי הדם אנוש תאי אנדותל (HBMEC) גדלים confluently על terephthalate פוליאתילן נקבובי Transwell להכניס לחקות האנדותל של מחסום הדם-מוח. תפקוד המחסום אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה occludens zonula, ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) מדידות כמו גם ניתוח של חלחול כחול אוונס. מודל זה מאפשר חקירה של diapedesis של תת הלימפוציטים נדירים כגון CD16 ^בהיר CD56 ^{לעמעם / -} תאי NK. Furthermעפרות, את ההשפעות של תאים אחרים, ציטוקינים chemokines, שינויים הקשורים למחלות, ועל משטרי טיפול מובחנים על יכולת הנדידה של לימפוציטים ניתן ללמוד. לבסוף, את ההשפעה של גירויים דלקתיים כמו גם משטרי טיפול שונים על מחסום אנדותל ניתן לנתח.

מבוא

הגירה לימפוציטים מהדם אל רקמות היא קריטית עבור מעקב חיסוני. רצף של אינטראקציות מולקולריות ספציפיות מבטיח extravasation באתר מסוים לתוך מעי דק, עור, בלוטות לימפה, מערכת העצבים המרכזית (CNS), ורקמות אחרות ^1. שינויים הגירה לימפוציטים מעורבים בפתופיזיולוגיה של מספר מחלות פרושות לרווחה ^2. הגירה אל החיסונית-חסוי CNS מוסדר בחוזקה ושינויים בהתאם התהליך הזה מעורבים במחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית כמו encephalomyelitis ^3, neuromyelitis אופטיקה, שבץ, טרשת נפוצה (MS) ^{2, 4, 5, 6, 7.} לכן, חשוב ללמוד extravasation הלימפוציטים להבין טוב יותר פתופיזיולוגיה המחלה ולפתח כלים עבור צמחים וטיוב של מחלה ^{8 ניטל, 9, 10, 11, 12.}

לימפוציטים להגר לתוך CNS באמצעות מסלולים נפרדים. Extravasation דרך venules postcapillary לחלל תת-עכבישי דרך מחסום נוזל המוח והשדרה-דם בתוך מקלעת דמית ולרוחב את מחסום הדם-מוח תוארו ^{1, 13, 14, 15.} הגירה דרך מחסום הדם-מוח מתבצעת על ידי האינטראקציה של לימפוציטים עם תאי אנדותל ^14. בניגוד לתאי אנדותל בפריפריה, תאי אנדותל של CNS לבטא כמויות גבוהות של מולקולות צומת חזק, ובכך בהחלט להגביל את כמות התאים והחלבונים מסוגל לחצות את מחסום הדם-מוחנַעֲרָה = "Xref"> 16. תוצאות דלקת התרופפות של צמתים הדוקים ומשרה את הביטוי של מולקולות הדבקה; ובכך, שיפור הגירה לימפוציטים לתוך CNS ^{1, 17, 18.}

Extravasation דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. לימפוציטים לקשור את תאי האנדותל ואז לגלגל לאורך האנדותל בתהליך בתיווך בעיקר על ידי selectins ^{1, 15.} לאחר מכן, אינטראקציות בין וכמוקינים מופרשים על ידי האנדותל ואת קולטני chemokine בהתאמה הביעו על לימפוציטים לגרום לשינויים קונפורמציה של integrins, ובכך לקדם הדבקת חברת אל תאי אנדותל ^1. לבסוף, לימפוציטים או זחילה לאורך המכשול אנדותל נגד זרימת הדם לפני transmigrating לחלל perivascular, או לעכב באופן מיידי וישיר Transmigrate באתר של הדבקת חברת ^{1, 19, 20.} כל הצעדים הללו של extravasation הלימפוציטים ניתן לנתח במבחנה באמצעות טכניקות ברורות ^21. זמן לשגות מיקרוסקופ וידאו משמש ללמוד את הקשירה הראשונית מתגלגל ^15. מבחני הדבקה לספק מידע מפורט על מעצרו משרד אנדותל מחסומים ^22. מבחני גלגול נשמות, כפי שהודגם כאן מאפשרים ניתוח של גלגול חיסוני תאים ^{21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.}

שימוש האנושי במודל מחסום דם המוח במבחנה, אנו לאחרונה יכולים להראות כי migr גבוהקיבולת atory של CD16 ^הבהיר CD56 ^{לעמעם / -} תאי NK לעומת CD56 שלהם ^עמום CD16 ⁺ עמיתיהם שהתבטאו דומיננטיות של תת תא זה NK בתא intrathecal ^21. לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו נראה מתאים לחקות את המצב vivo.

פרוטוקול

1. Cell תרבות לתאי אנדותל כלי הדם המוח האנושי (HBMEC)

1. ציפוי של צלוחיות תרבית תאים
   1. כדי להכין את הפתרון פיברונקטין, להוסיף 10 מ"ל PBS כדי צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. הוספת 150 μL פיברונקטין ומערבבים היטב.
   2. כדי לכסות את תחתית בקבוק תרבות תא T-25 להוסיף 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין. דגירת בקבוק תרבות תאים עבור 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. ניתן לאחסן צלוחיות מצופות פיברונקטין עבור 2 שבועות ב 37 ° C / 5% CO _2.
2. זריעת תרבית תאים של HBMEC
   1. פתרון פיברונקטין לשאוב מן החלק התחתון של בקבוק תרבית תאים. להוסיף 7.2 x 10 ⁴ HBMEC / cm² מושעה 6 בינוני מ"ל ECM-B (= ECM-B בתוספת 5% בסרום שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ואת תוספת צמיחת תאים 1% אנדותל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO _2. בדוק צמיחת תאים יומי באמצעות מיקרוסקופ.
   2. שינוי המדיום כל 3 ימים.קציר או פיצול תאים, כאשר HBMEC להגיע לכ 80% המפגש. HBMEC אמור לשמש בין קטע 1 ו 15 כדי למנוע אובדן של מאפיינים פיסיולוגיים.
3. קציר HBMEC.
   1. כן Accutase פתרון על ידי ערבוב Accutase (1x) עם PBS ביחס של 1: 1. שמור Accutase פתרון ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד לשימוש נוסף.
   2. העבר בינוני ECM-b מבקבוק תרבות תא צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לשטוף HBMEC על ידי הוספת 5 מ"ל PBS לתחתית הבקבוק תרבית תאים. לשאוב PBS וחוזר על שלב הכביסה פעמים נוספות.
   3. להוסיף מ"ל 2 מחומם מראש Accutase פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, HBMEC מחדש תלוי בחוזקה על ידי קשה על בקבוק תרבית תאים מספר פעמים. ניתוק תא נשלט באמצעות מיקרוסקופ
   4. ECM-ב-בינוני נשמרו קודם צינור 15 מ"ל מתווסף בחזרה את הבקבוק תרבית תאים בהקדם HBMEC להתחיל לנתק. יש לשטוף את החלק התחתון של הבקבוק שוב ושוב עד ביותר HBMEC הםמושעה מחדש.
   5. מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגה 15 מ"ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant מחדש להשעות תאים 1 מ"ל בינוני ECM-B. ספירת תאים לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג ריכוז סופי של 3 x 10 ⁵ HBMEC לכל מדיום ECM-b מ"ל.

2. הכנת התא מוסיף תרבות

1. ציפוי של מוסיף תרבית תאים
   הערה חשובה: אל תיגע הממברנה של מוסיף תרבית תאים.
   1. הוספת 100 μL פתרון פיברונקטין (ראה 1.1.1) לכל כנס תרבית תאים (איור 1 א) ו אחד טובה של צלחת 96-היטב שטוחה תחתונה (שליטה אופטית היטב). דגירה של 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר פתרון פיברונקטין הדגירה לשאוב.
   2. הוספת 100 μL HBMEC השעיה לבית מוסיף תרבית תאי השליטה האופטית היטב. להוסיף 600 μl בינוני ECM-B לתא התחתון של התאמוסיף תרבות. הדגירה של 3 - 4 ימים 37 ° C / 5% CO ₂ עד שלמות מחסום (1B איור) הוא הגיע, לבדוק צמיחת תאים על ידי הערכה מיקרוסקופית של HBMEC בבקרה האופטית היטב. הערה: צמיחת תאים מעבר ארבעה ימים אינה מומלצת.
   3. אופציונלי: כדי לחקות את התנאים דלקתיות לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ולהחליפו בינוני ECM-B בתוספת 500 U / mL IFN-γ / TNF-α 24 שעות לפני assay את ההגירה.

3. בקרת איכות עם כחול אוונס ביום של Assay גלגול נשמות

1. הכנת פתרון כחול אוונס
   1. כדי להכין PBS / B27 פתרון תערובת 10 מ"ל PBS עם 200 μl תוסף B27 באמצעות צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. לדלל פתרון מניות כחול אוונס (20 מ"ג / מ"ל ​​PBS) 1: 1000 עם PBS / B27.
2. assay חדירות הכחולה אוונס
   1. לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ואחריו התא העליוןשל כנס תרבות תא אחד המכיל בשכבת HBMEC ומחוברת. להוסיף 100 פתרון כחול μL אוונס אל הכנס תרבית תאים.
   2. הוספת 600 μL PBS / B27 לתא התחתון דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C / 5% CO _2. מוציאים בזהירות את הכנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים.
3. מדידה כחולה אוונס
   1. הסר PBS / B27 מן המגירה התחתונה ולהעביר 100 μL בכל לשתי בארות של polystyrol שחור 96-גם צלחת תחתית שטוחה. הכנס צלחת בקורא צלחת פרו טקאן Infinite M200 ולקבוע z-מיקום אופטימלי.
   2. עירור מדוד של הגדרות בהתאמה באמצעות כחול אוונס (למשל: עירור: 620 ננומטר, פליטת: 680 ננומטר, רוחב פס עירור: 9 ננומטר, רוחב פס הפליטה: 20 ננומטר, שיפור 175x, 25 הבזקים, זמן של אינטגרציה: 20 מיקרו-שניות).
   3. כדי לקבוע פונקציות מחסום HBMEC להשוות רכשה נתונים כדי עקומת סטנדרט המתאר חלחול כחול אוונס ברחבי HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר זרעתאי ing (1B איור, מימין).

4. Assay הגירה

1. הכנת תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC).
   1. להוסיף 10 מ"ל RPMI לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה ולהוסיף 200 תוספת μL B27. ספירת תאי PBMC צנטריפוגות ב XG 300 5 דק '. Re- להשעות PBMC לריכוז סופי של 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל RPMI / B27.
2. הגדרה של assay ההגירה
   1. לשאוב בינוני מהתא הנמוך ואחריו התא העליון של מוסיף תרבית תאים המכילים monolayers HBMEC ומחוברות (איור 1 א). לפי התורם להוסיף 100 ההשעיה μL PBMC כל אל מוסיף תרבית תאים וגם אחד טוב של צלחת 24-היטב לכל (בשליטה במבחנה).
   2. הוספת 600 μL RPMI / B27 לתא התחתון של מוסיף תרבית תאים 500 μL אל PBMC הבקרה במבחנה דגירה 6 שעות ב 37 ° C / 5% CO _2.
3. קציר שהועבר PBMC
   1. קח את כנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים ובזהירות לשטוף תחתון עם 400 μL PBS בלי לגעת הממברנה. מחק את כנס תרבית תאים.
   2. להוסיף 20 μL זרימת ספירת fluorospheres (כ 1000 חרוזים / μL) אל המגירה התחתונה של תרבית תאים להכניס כמו גם לשליטה במבחנה ומערבבים היטב. העברת 1 מ"ל של וכתוצאה ההשעיה PBMC לזרום cytometry צינורות.

5. Cytometry זרימה

1. הכנת דוגמאות
   1. צנטריפוגה PBMC XG 300 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. כן פתרון נוגדן ידי הוספת נוגדני מצומדות fluorochrome כדי 100 μL cytometry זרימת החיץ (PBS / 1% BSA / 2 מ"מ EDTA) לדגימה. לקבלת התוצאות המוצגות להלן 1 μL CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700, ו 1 μL CD16-A750 שימשו לדגימה.
   3. Re-להשעות PBMC ב 100 μL של פתרון נוגדן דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C.
   4. הוספת 250 μL cytometry זרימה חיץ צנטריפוגות XG 300 5 דק '.
2. רכישת המדגם
   1. Re- להשעות PBMC בכמות הנדרשת (משתנה בהתאם cytometer זרימה בשימוש) של זרימת cytometry חיץ.
   2. רוכשת PBMC צבעונית באמצעות cytometer זרימה עם גלאי אקטיבי בין 525 ו 700 ננומטר אורך גל לזהות fluorospheres זרימת הספירה (עירור 488 ננומטר, פליטת 525 - 700 ננומטר).
      (השלבים הבאים הם דוגמא אם זרימת Gallios cytometer המופעל באמצעות תוכנת Kaluza G משמשת:. (1) הפעל את המחשב (2) כאשר מערכת ההפעלה נטענת במלואו, להתחיל cytometer הזרים על ידי לחיצה על "cytometer על" כפתור . (3) טען את פרוטוקול רכישת בהתאמה ידי לחיצה על כפתור "פרוטוקול פתוח". (4) בחר את הפרוטוקול נדרש ובחר "לפתוח". (5) שכפל את הפרוטוקול עבור כל דגימה על ידי לחיצה עם ימיןעכבר כפתור על הפרוטוקול גלוי הקרוסלה הווירטואלית בלחיצה שמאלה על המגרש "כפול". (6) סמן כל דגימה ברשימה המדגמת. (7) העביר דגימות העמדות המצוינות של הקרוסלה ולהתחיל הרכישה.)
3. ניתוח מדגם
   1. זרם פתוח וכתוצאה cytometry נתונים באמצעות התוכנה המתאימה. קביעת מספר תת-האוכלוסיות של ריבית transmigrated PBMC כמו גם תאי מבארות מלאות במבחנה ב וזרימת fluorospheres לספור באמצעות תוכנת ניתוח בהתאמה.
      (דוגמה לאסטרטגיה gating ניתנת בחלק התוצאות (איור 1 C: כדי לנתח גלגול תת NK תאים, בחר תחילה הלימפוציטים ערוץ פיזור ולצדדים (SSC) מול העלילה ערוץ פיזור קדימה (FSC) לימפוציטים הם. אז מוצג CD3 לעומת העלילה CD56 ו CD56 ⁺ CD3 ^-. תאי NK נבחרים כדי להבחין בין תת-תאי NK, תאי NK מוצגיםעלילה לעומת CD16 CD56 ו CD16 ^בהיר CD56 ^{לעמעם / -} כמו גם CD16 ^עמום CD56 ⁺ תאי NK נבחרים. בנוסף, fluorospheres ספירת זרימה נבחרו מתוך חלקת FSC מול SSC ובהמשך יוצג חלקת ערוץ עם פליטה בין 525 ו 700 ננומטר לעומת הזמן כדי לקבוע את מספרם.)
   2. כדי לחשב את מספר התאים הכולל של כל דגימה, לנרמל למספר המזוהה של תאים באמצעות fluorospheres ספירת זרימה:
      
   3. קביעת אחוז התאים נדדו כמו יחס בין תאים הכולל יועברו, תאים הכוללים בבקרה חוץ הגופייה.

תוצאות

תוצאות נציג מראה גלגול NK-התא תת T תאים בעזרת מודל מחסום הדם-מוח אנושי (איור 1 א) מוצגים. היושרה של monolayer HBMEC תוקף של הכתמה של המולקולה בצומת דוק ZO-1, התנגדות חשמלית Transendothelial (TEER) מדידות, וכן חלחול הכחול אוונס (איור 1B). בעקבות 3 - 4 ימי התרבות HBMEC הביע מולקולת הצומת ההדוקה ZO-1 (איור 1B, משמאל). יתר על כן, HBMEC גדל ב monolayers מפגין התנגדות חשמלית Transendothelial (באמצע

דיון

כאן אנו מציגים טכניקה לחקור גלגול לימפוציטים פני מחסום דם-המוח האנושי. בניתוח חוץ גופית של הגירה לימפוציטים אל CNS חשוב ללמוד תהליכים בסיסיים של extravasation הלימפוציטים, שינויים מחלות הקשורות פוטנציאל, גישות טיפוליות חדשות.

שינויים אחדים של המודל מחסום הדם-מוח אפשריים. לדוגמא, תאים מהתא העליון יכולים להיות מנותחים לחקור את ההרכב של אוכלוסיית התאים שאינם שהועברה. יתר על כן, הטיפול בשכבה HBMEC עם IFN-γ ו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PBS	Gibco	14190-094	ללא CaCl2 או MgCl2
Fibronectin 1 מ"ג/מ"ל	Sigma	F1141-5MG	מפלזמת בקר
T-25 בקבוק תרבית תאים	Greiner BioOne	690160
HBMEC	ScienCell	1000
	Pelobiotech	PB-H-6023
Accutase	Sigma	A6964-100ML
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
פניצילין/סטרפטומיצין	ScienCell	1001-b
תוסף צמיחת תאי אנדותל	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	שקוף, קוטר 6.5 מ"מ, 3.0 & מיקרו; m גודל נקבוביות
96 באר צלחת תחתונה שטוחה	קורנינג	3596
אוונס כחול	סיגמא	E2129-10G	פתרון מלאי: 1 גרם/50 מ"ל PBS
B27	Gibco	17504-044	50x מרוכז
אינסופי M200Pro	Tecan
96 בארות צלחת תחתונה שטוחה	שחורה גריינר BioOne	675086
צלחת 48 בארות	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
ספירת זרימה פלואורוספירות	בקמן קולטר	7547053
EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
Gallios ציטומטר זרימה 10 צבעים	בקמן קולטר
1.5a	בקמן קולטר
TNF ואלפא;	פפרוטק	300-01A
IFN-γ	Peprotech	300-02
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolegend	300430	שיבוט UCHT1
CD56-PC7	בקמן קולטר	A21692	שיבוט N901
CD16-A750	בקמן קולטר	A66330	שיבוט 3G8
CD4-FITC	Biolegend	300506	שיבוט RPA-T4
CD8-A700	בקמן קולטר	A66332	שיבוט B9.11