הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

12.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55396

⸱

15 בפברואר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The MARCS Institute, Western Sydney University, 2School of Medicine, Western Sydney University

במאמר זה

סיכום

הוסר לאחר מהגוף, רקמה עצבית היא השפיעה מאוד על ידי תנאים סביבתיים, המוביל השפלה הסופי של רקמות לאחר 6 - 8 שעות. באמצעות שיטת דגירה ייחודית, אשר מקיימים מעקב קפדני אחרת ומסדירה את הסביבה התאית של הרקמות, כדאיויות רקמות ניתן להאריך באופן משמעותי עבור> 24 שעות.

תקציר

חריפת הכנות רקמות עצביות, פרוסות מוח wholemount רשתית, בדרך כלל יכול להישמר רק 6 - 8 שעות לאחר ניתוח. עובדה זו מגבילה את זמן הניסוי, ומגדיל את מספר בעלי החיים בהם נעשה שימוש לכל מחקר. מגבלה זו משפיעה באופן ספציפי פרוטוקולים כגון הדמית סידן הדורשים דגירה מראש ממושך עם צבעים להחיל אמבטיה. גידול מעריכי חיידקים תוך 3 - 4 שעות לאחר החיתוך מתואם היטב עם ירידת בריאות רקמות. מחקר זה מתאר שיטה להגביל את ההתפשטות של חיידקים בהכנות חריפות לשמור רקמות עצביות קיימא עבור פרק הזמן ממושך (> 24 ח) ללא הצורך באנטיביוטיקה, נהלים סטרילית, או תקשורת ותרבות רקמה המכילה גורמי גדילה. ידי רכיבה על אופני נוזל החוץ-התאים באמצעות קרינת UV ו לשמור על שלמות הרקמה בתא חזק מותאם אישית ב 15 - 16 מעלות צלזיוס, הרקמה מראה שום הבדל תכונות אלקטרו, או סי סידןgnaling באמצעות צבעים סידן תאיים ב> 24 שעות postdissection. שיטות אלה לא רק להרחיב את זמן הניסוי עבור אלה באמצעות רקמה עצבית חריפה, אך תפחית את מספר בעלי החיים הנדרשים כדי להשלים מטרות הניסוי, ותציב סטנדרט הזהב הדגירה רקמה עצבית חריפה.

מבוא

Electrophysiology והדמיה תפקודית (סידן, מתח צבעים רגישים) הם שתיים ניסיונותיי בטכניקות הנפוצות ביותר במדעי המוח. מוח הכנות פרוסות wholemount ברשתית, אשר תיבחן כאן, לספק אמצעי לבחון תכונות אלקטרו וקישוריות הסינפטי ללא זיהום הרדמה או מרפי שרירים. פרוסות רשתית המוח wholemount לשמור על שלמות מבנית שלהם, בניגוד תרבויות או homogenates התא, וכך מתאפשר לחקר מעגלים ספציפיים ורשתות המוח 1. הקלטות מרקמות מבודדות יש יתרונות על פני הקלטות vivo כתנועות הקשורים פעילות הלב והנשימה בוטלו. יתר על כן, להדמיה ישירה מאפשרת שיעורים ספציפיים של תאים להיות ממוקד, יישום מקומי של כלי התרופתי 2, 3.

הקלטות תיקון מהדק ו Calcium צבען טעינת wholemount רשתית הוא מסובך בשל הקיום של Inner הגבלת ממברנה (ILM), אשר מכסה את תא גנגליון רשתית (RGC) השכבה ומונעת גישה ישירה אל התאים. בדרך כלל, קרום זה שגירד עם טפטפת זכוכית כדי לאפשר יישום ישיר של תיקון פיפטה היווצרות חותם gigaohm על תא בודד. בנוסף, צבעי סידן מיושם אמבטיה לא לחצות את ILM ואו חייב להיות מוזרק מתחת קרום זה 4, retrogradely מועברים ההזרקה הבאה עצב הראייה 5 או electroporated דרך הרקמה 6. יתר על כן, כאשר ניצול מודל מכרסם של רטיניטיס פיגמנטוזה, עכבר rd / rd, את ILM הוא עבה יותר חדיר. כאן, אנו משתמשים בטכניקה כדי להסיר את ILM עם עיכול אנזימטי 7, כדי לאפשר הן סידן נמצא בכל מקום טעינת צבע, וגישה ישירה לתאי הגנגליון ברשתית עבור recordi תיקון- clampNGS 8.

הקלטות מוצלחות מ פרוס או מוח או wholemount רשתית תלויות לנתיחת דגירה של רקמה עצבית קיימא. בדרך כלל, רקמה מופקת בבוקרו של הניסוי וטופחה בנוזל מלאכותי השדרתי (aCSF) עד שהוא משמש להקלטות. בדרך כלל, רקמה נשארת קיימא עבור 6 - 8 שעות, עם השפלה משמעותית הבאים חלון זמן זה. עם זאת, הן פרוסות המוח והכנות רשתיות wholemount בדרך כלל לייצר יותר רקמות מאשר ניתן להקליט בתוך פרק זמן קצר זה. כתוצאה מכך, רקמה נמחקת לעתים קרובות בסוף היום לנתיחה תושלם שוב בימים שלאחר מכן. משמעות דבר היא חיה אחרת מנוצלת ו ~ 2 שעות של התקנה לנתיחה / מכתים חזר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה עבור הארכת החיים של רקמות עצביות במשך יותר מ -24 שעות, כלומר פחות בעלי חיים מנוצלים, ועוד זמן ניסוי זמין. הכדאיות רקמות wכפי שהוערך באמצעות רישום תכונות אלקטרו ודינמיקה סידן, ומאפיינים אלה אי אפשר היה להבחין בין <ג 4 ו> 24 שעות postdissection.

תוצאות אלו מצביעות כי לא רק הם המאפיינים תא בודד ללא פגע ופונקציונלי לאחר דגירה ממושכת, אך פעילות הרשת, כפי שהוערך על ידי סידן הדמיה הקלטות אלקטרו, הוא ללא שינוי> 24 שעות postdissection. יתר על כן, אנו מראים כי צבעי סידן יכולים להישאר בתאים לתקופות ממושכות מבלי לגרום השפעות מזיקות. יישום של פרוטוקול זה מוכיח כי הפעילות התפקודית של נוירונים ברקמה עצבית חריפה יכולה להישמר במשך תקופות ארוכות, פעם הסביבה החיצונית היא פיקוח הדוק. יתר על כן, כפי כדאיויות רקמות משתנות במידה רבה בין מעבדות עקב פרוטוקולי דגירה שונים, שיטה זו קובעת סטנדרט זהב הפרמטרים האידיאליים כי יש להחיל להפחית השתנות בבריאות neu החריפהרקמת רונאל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול להלן מתאר את הכנת C57BL / 6 ו C3H / הוא (retinally מנוונת) עכבר רקמות עצביות, אך בטכניקות דומות ניתן ליישם מינים אחרים. כל בעלי החיים היו בריאים מטופלים עם תנאים סטנדרטיים של טמפרטורה, לחות, 12 שעות אור / חושך מחזור, גישה חופשית למזון ומים, וללא גירויי מתח מיועדים. כל הניסויים אושרו ובוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מערב סידני ואתיקה הוועדה ועל פי השימוש בבעלי חיים והנחיות טיפול (A9452 # רשות המחקר בבעלי חיים, # A10396 ו A8967 #).

1. הכנת פרוסת המוח

  1. להרדים את החיה על ידי שאיפה של isoflurane (5%) לערוף באמצעות גיליוטינה מכרסם. הסר את המוח במהירות, כפי שתואר לעיל 9 ולמקם אותו לתוך פתרון פיזיולוגי קר כקרח (aCSF) המכיל (מ"מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 1 MgCl 2, 1.25 לאא 2 PO 4, 2 CaCl 2, 253 NaHCO, 25 דקסטרוז, ורווי carbogen (95% O 2/5% תערובת CO 2; 310 mOsm; pH 7.4).
  2. חותכים פרוסות המוח, באזור של עניין, 300 מיקרומטר עבה עם microtome רוטט.
  3. עבר פרוסות למערכת דגירה שהותקנה מנטרת מקרוב ושולט רמות pH (pH 7.2 - 7.4), זרימת carbogen, וטמפרטורה כפי שתואר לעיל 10, 11.
  4. גדר טמפרטורה בתא ראשונית עד 35 מעלות צלזיוס במשך 15 - 30 דקות, ולאחר מכן להפחית לאט עד 15 - 16 מעלות צלזיוס כפי שמוצג באיור 1C. ואז דגירה פרוסה במערכת הדגירה עד צורך, גם עבור electrophysiology או הדמיה.
    הערה: אם פרוס לשמש הדמית סידן, בצע את השלבים הבאים לפני קירור רקמות מתחת RT.

2. רשתית Wholemount כן פנימי להסרת ממברנה הגבלה

  1. כן wholemounts רשתית תחת ל'רגילבתנאי תאורה במעבדה או אור אדום / אינפרא-אדום עמום.
  2. להרדים בעלי חיים על ידי נקע בצוואר הרחם ועיניים enucleate מיד. ביצוע חתך קטן לאורך serrata אורה, ומניחים מדיה או איימס, או aCSF המכיל (מ"מ): 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 3 KCl, 2 2 CaCl, 1 2 MgCl, 10 גלוקוז, 0.5 L- גלוטמין, ו להרוות עם carbogen (95% O 2/5% CO 2 תערובת; ~ 300 mOsm; pH 7.4), ב RT.
  3. מיד להסיר את הקרנית, העדשה זגוגי על ידי חיתוך לאורך serrata אורה עם מספריים קטנים הסרת העדשה זגוגי עם מלקחיים. מניחים רקמות במערכת הדגירה ב RT.
    הערה: רקמת רשתית יכולה להישמר כוס העין, לאחר הפחתת טמפרטורה איטית עד 15 - 16 מעלות צלזיוס, עבור> 24 שעות במערכת הדגירה עד הצורך.
  4. כדי להסיר את ILM, להעביר את כוס העין שמכילה את הרשתית צנצנת זכוכית קטנה שהכילה 30 פפאין U / mL, 1 מ"מ L- ציסטין, 0.5 mM EDTA ו 0.005% DNase ב Earl's-תמיסת מלח מאוזנת (BSS) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. החל 95% O 2/5% CO 2 לפתרון דרך המכסה אבל לא בועה. אם אתה משתמש רקמות מחיות צעירות (<6 שבועות), לדלל את תמיסת לחץ הכח.
    1. עצור עיכול אנזימטי, בעצם הצבתה של רקמות בתוך ovomucoid (10 מ"ג / מ"ל) ו BSA (10 מ"ג / מ"ל) פתרון עבור 10 דקות ב BSS של ארל. רקמות לשטוף ביסודיות עם aCSF לפני ההעברה למערכת הדגירה ולהפחית טמפרטורה עד 15 - 16 מעלות צלזיוס.
  5. לשמור על רקמת הרשתית ב-כוס העין עד הצורך. להעברה המיקרוסקופ, לבודד את הרשתית מהגביע-העין וחותך ל -4 חתיכות עם סכיני גילוח. אם הרשתית כולה נדרשת, לעשות ארבעה חתכים קטנים בפריפריה של הרשתית כדי לאפשר לו לשכב.
    הערה: בניסויי הדמיה, עומס עם סידן צבע לפני ההעברה למערכת הדגירה, ראה להלן.

3. שמירה על רקמות בחממה

  1. רקם מקום בתא הראשי המכיל בדיקות למדידות pH וטמפרטורה (איור 1 א ', ב').
  2. הפץ aCSF באמצעות בתא שני (תא UVC, בנויה כפי שתוארו לעיל 12) מבודד מהאולם הראשי חשוף 1.1 W אור UVC (254 ננומטר, 5W / 2P מעקר מנורת UV) על מנת eradiate חיידקים צפים הפתרון (איור 1A). בקרת UVC עיתוי אור באמצעות טיימר לתכנות באמצעות תכונה אקראית המפעילה בזמנים משתנים בין 15 ל 26 דקות כל 15 - 30 דקות כדי למנוע חימום יתר של aCSF.
  3. הגדר את קצב הזרימה בתא UVC ל -12 mL / min כפי שדווח בעבר 12. מכסה את תא UVC עם רדיד אלומיניום על מנת למנוע תאורת UVC מחוץ לתא, אשר עלול לגרום ניזק לרקמות עצביות.
    הערה: לקבלת רקמת רשתית כהה מותאם, חל כיסוי מחוייט לתא הראשי להוציא לאור.
  4. השתמש משאבת peristaltic כדי circulate הפתרון (aCSF) דרך השני תאי צלחת קרה ותרמית פלטייה קרירה משני מגניבים או לחמם את החדר הראשי הטמפרטורה הרצויה בטווח של 0 - 50 ° C. לאינקובטורים רקמה אופטימליים, להשתמש 15 - 16 מעלות צלזיוס למשך כדאיות לטווח ארוכה.

טוען 4. סידן דיי

  1. בחר צבעי סידן על בסיס ההעדפה של חוקר הפרט. כאן אנו משתמשים פורעה-02:00, Fluo-08:00 או Fluo-04:00. עם זאת, ניתן ליישם שיטה זו כדי צבעים אחרים כמו גם: לפזר צבעים סידן ב DMSO פתרון 1 מ"מ ו 1% קופולימרים לחסום (למשל, חומצה-127 pluronic) לנפח סופי של 50 μL sonicate במשך 10 דקות.
  2. הוספת פתרון aCSF לריכוז סופי של 10 מיקרומטר, קופולימרים לחסום 0.01% עבור פרוסות מוח, ו -20 מיקרומטר (רשתית), קופולימרים לחסום 0.02% עבור הרשתית. בשנת רשתיות (פפאין מטופלים) ופרוסות המוח מפני בעלי חיים צעירים, עומס באמבטיה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (פורעה -2 AM) או ב RT (Fluo-4 בבוקר; Fלואו-8 בבוקר).
    1. עבור בעלי חיים בוגרים, (> 12 שבועות) פיפטה הצבעים (50 μL) ישירות על גבי פרוסות המוח, ולשמור למשך 75 דקות כדי לאפשר חדירה טובה יותר של הצבע לתוך השכבות העמוקות.
    2. כדי להבטיח חמצון נאותה של הפרוסה שקוע במהלך הדגירה לצבוע, להכין קאמרית טעינת זכוכית עם מכסה סגור (כד עגול בקוטר 2.5 ס"מ, 3.5 ס"מ גובה) עם צבעים סידן מדולל 2.5 מ"ל של aCSF. חמצן ברציפות עם 95% O 2/5% CO 2. האם לא בועה.
  3. בעקבות טעינת צבע, לשטוף את הרקמה עם aCSF והעביר למערכת הדגירה, לאט להפחית את הטמפרטורה ל 15 - 16 מעלות צלזיוס עד לשימוש ניסיוני.

5. הקלטות אלקטרו והדמיה

  1. מניח רקמות בתא הקלטה שקועה תחת מיקרוסקופ, ו perfuse עם aCSF מחומצן בקצב זרימה של 4 - 5 מיליליטר / דקה או ב RT (~ 22 ° C) או טמפרטורה פיזיולוגית (~ 35 ° C). חולד הרקמה במקום באמצעות מנהג עשה '' נבל '', עשוי חוטי ניילון או זהב נמתחו ומודבקים על פני פיסה בצורת U זהב או חוט פלטינה.
  2. לקבלת אלקטרופיזיולוגיה:
    1. כן טפטפות הקלטה מ -1.5 מ"מ (1.19 מזהה מ"מ) הזכוכית בורוסיליקט באמצעות חולץ micropipette להשיג התנגדות סופית של 5-6 MΩ.
    2. מלאו את פיפטה עם 3 - 4 μL של פתרון פנימי כפי שתואר לעיל 13 ולדמיין התאים תחת התערבות ההפרש לעומת אינפרא אדום (IR-DIC) באמצעות מצלמת CCD. הפתרון התאי צריך להיות מותאם בקפידה כל ניסוי כדי להשיג תוצאות ניסוי.
    3. פיפטה עמדה, תוך שמירה על לחץ חיובי להחיל דרך יציאת יניקה על בעל פיפטה, על קרומית התא באמצעות micromanipulator. מאז ILM הוסר מהרשתית, לא גירוד קרום לפני נדרש. ברגע פיפטה הוא על התא, להחיל שלילי עדיןלחץ פיפטה להשיג חותם gigaohm. ואז לקרוע את קרום התא עם כמות קצרה של לחץ שלילי.
    4. הפוך כל תא קלטות שוטפות או מתח- clamp באמצעות טכניקות סטנדרטיות על פי צורך.
  3. סידן הדמיה:
    1. עבור הדמיה ratiometric של פורעה -2, השתמש במחליף גל מהירות גבוהה במיוחד כדי לספק אורכי גל עירור של 340 ננומטר ו -380 ננומטר. Pass אור נפלט תאים בודדים באמצעות מסנן פליטה של ​​510 ± 20 ננומטר, וללכוד עם מצלמה דיגיטלית, במהירות גבוהה רגישות גבוהה.
    2. עבור גל עירור יחיד של Fluo-4, אור עירור מסנן דרך 460 - לעבור סינון 490 ננומטר להקת אור נפלט דרך 515 - מסנן מעביר פס 550 ננומטר. עבור ההקלטה המהירה הרגישה ביותר להשתמש במצלמה דיגיטלית במהירות גבוהה כל כך. לרכוש תמונות כנדרש.
    3. מדוד שינויי קרינה כפונקציה של זמן או בכל אורך גל יחיד (Fluo-4) או באמצעות יחס אורך הגלשיטה (פורעה-2), כמתואר 8 בעבר, 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

רגולציה הדוקה של העומס חום חיידקים של aCSF במהלך הדגירה היא חיונית כדי לשמור על כדאיות רקמות עצבית. זה יכול להיות מותאם באמצעות הקרנת אור UVC ושמירה על הטמפרטורה של aCSF ב 15 - 16 ° C (איור 1). יתר על כן, aCSF פרמטרים החותם (APS; איור 1 ג) מספק הנסיין עם רקורד של התנאים הסביבתיים (pH ואת זמנים.), ובכך להציע סטנדרט זהב פרמטרים כאשר דוגר רקמה עצבית, אשר, אם בעקבותיו, תפחית השתנות בין ניסויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר שיטת דגירה להאריך את הכדאיות של רקמות עצביות חריפות לניסויי הדמית אלקטרו, ובכך להפחית את מספרי החיה הדרושים כדי להשלים מטרות ניסוי. שני תהליכים עיקריים הקובעים את ההידרדרות של רקמה עצבית לאורך זמן: i) רמות חיידקים מוגברים, וגידול ליווי רעלן פנימי חיידקים שוחרר, ii) יתר רעיל אשר עוקב אחר הליך החיתוך הטראומתי 10. כמו רקמה עצבית חריפה היא הגנה על איכות הסביבה, רגולציה הדוקה של הסביבה רקמות באמצעות מעקב צמוד של pH, טמפרטורה ורמת חיידקים חיונית לשמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יוסי בוסקילה ופול ברין מצהירים כי הם בעלים משותפים של PAYO Scientific Pty Ltd, חברה המתמחה בבניית מערכות דגירה לרקמות עצביות חריפה. כל המחברים האחרים אינם מדווחים על אינטרסים פיננסיים או ניגודי אינטרסים פוטנציאליים הקשורים למחקר הנוכחי.

תודות

אנו מודים לקולין סימונס וג'יימס רייט על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מימון ראשוני (WSU) ל-Y.B. ולמשרד החדשנות באוניברסיטת מערב סידני. M.C. נתמך על ידי מלגת ARC (DECRA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ' VETECV800372
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P9333
N-מתיל-D-גלוקמיןסיגמא אולדריץ'M2004 
D-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G5767
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S6014
נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S2554
מגנזיום כלורידסיגמא אולדריץ'M9272 
סידן כלורי סיגמא אולדריץ'223506
מערכת דיסוציאציה פפאיןוורת'ינגטון 
דימתיל סולפוקסיד נטול מיםסיגמא אולדריץ'276855
פלורוניק F-127 ספיגת UV נמוכה*טכנולוגיות חייםP-6867תמיסה 20% ב-DMSO 
פורה-2 AM   Anaspec84017
Fluo-4 AM   Life TechnologiesF23917
Fluo-8 AMAbcamAb142773
מיקרוטום להב רוטט Leica BiosystemVT1200 Sמצויד ב- Leica ' s Vibrocheck ™ מכשיר מדידה 
שולחן אנטי רטטמערכות קינטיות ויברפלין ויברפליין 9100/9200 
שלב קבוע מיקרוסקופ זקוףאולימפוסBX51WI 
מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוסXLUMPlanFLN 20x/1.00w20X 
מיקרוסקופ אובייקטיביאולימפוסLUMPlanFLN 60x/1.00w60X
CCD מצלמהאנדוראיקסון +
מחליף אורך גל במהירות גבוההמכשיר סאטרLambda DG-4 
מגבר מהדק תיקוןהתקנים מולקולרייםMultiClamp 700B
מערכת רכישת נתוניםהתקנים מולקולרייםDigidata 1440AAxon Digidata® מערכת
נימי זכוכית בורוסיליקטSutter Instrument CoBF150-86-10
חולץ מיקרואלקטרודותSutter Instrument CoP-97חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער / חום
הקלטה / זלוףWarner InstrumentsRC-40LPפרופיל נמוך תאי אמבטיה פתוחים
תוכנההתקנים מולקולרייםpClamp 10.2
Andor iQ Live Cell ImagingSoftware AndoriQ3
BraincubatorPayo ScientificBR26021976www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate CoolerTE TechnologyCP-121
בקר טמפרטורהTE TechnologyTC-36-25 RS232
LK003150 תא

מקורות

  1. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).
  2. Gibb, A., Edwards, F. Patch clamp recording from cells in sliced tissues. Microelect Techniq. , 255-274 (1994).
  3. Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3. Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).
  4. Blankenship, A. G., et al. Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves. Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).
  5. Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina. J Vis Exp. (92), e51396(2014).
  6. Kulkarni, M., et al. Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina. J Vis Exp. (99), e52588(2015).
  7. Velte, T. J., Masland, R. H. Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells. J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).
  8. Cameron, M., et al. Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue. PLoS ONE. 11 (5), (2016).
  9. Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  10. Breen, P. P., Buskila, Y. Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology. Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).
  11. Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).
  12. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Sci Rep. 4, 4-10 (2014).
  13. Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices. Glia. 52 (3), 169-176 (2005).
  14. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).
  15. Buskila, Y., et al. Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse. PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).
  16. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen. London, UK. (1959).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Retinal WholemountUVBraincubator
דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.