מאמר שיטה

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

DOI:

10.3791/55412

⸱

30 במרץ 2017

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae הם אורגניזם מודל חשוב בחקר ההזדקנות. מחקרים גנטיים חשפו גנים רבים עם השפעות שמורות על תוחלת החיים בין מינים. עם זאת, הגורמים המולקולריים להזדקנות ומוות נותרו חמקמקים. כדי להשיג הבנה שיטתית של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הזדקנות השמרים, אנו זקוקים לשיטות בעלות תפוקה גבוהה למדידת תוחלת חיים ולכימות פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים בתאים בודדים. בעבר, פיתחנו מכשירים מיקרופלואידיים למעקב אחר תאי אם שמרים ניצנים לאורך חייהם תוך שטיפת תאי בת שזה עתה נולדו. מאמר זה מציג שיטה להכנת שבבים מיקרופלואידיים ולהקמת ניסויים מיקרופלואידיים. ניתן להשתמש במספר ערוצים כדי לעקוב בו זמנית אחר תאים בתנאים שונים או מזני שמרים שונים. מערך טיפוסי יכול לעקוב אחר מאות תאים בכל ערוץ ולאפשר הדמיית מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה לאורך כל חיי התאים. השיטה שלנו מאפשרת גם אפיון מפורט של תוחלת החיים, סמנים מולקולריים, מורפולוגיה של תאים ודינמיקה של מחזור התא של תאים בודדים. בנוסף, המכשיר המיקרופלואידי שלנו מסוגל ללכוד כמות משמעותית של תאי אם טריים שניתן לזהות על ידי ניתוח תמונה במורד הזרם, מה שמאפשר למדוד את תוחלת החיים בדיוק גבוה יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל עצמת הזדקנות מחקר. עם זאת, assay תוחלת חיים מקובל בשמרים מסתמך על microdissection, וזה לא רק עבודה אינטנסיבית אך גם נמוכה תפוקה 1, 2. בנוסף, הגישה המסורתית microdissection אינה מספקת תצוגה מפורטת של תכונות תאיות ומולקולריות שונות בתאים אם חד ההוריים ככל שהם מזדקנים. הפיתוח של מכשירי microfluidic אפשר הליך אוטומטי למדידת אורך חיי שמרים, כמו גם לעקוב סמנים מולקולריים פנוטיפים הסלולר שונים לאורך חיי תאי אמא 3, 4, 5, 6, 7, 8. אחרי תאי שמרים נטענים לתוך מכשיר microfluidic, הם יכולים להיות במעקב תחת מיקרוסקופ אלקטרוני-הקפות זמן אוטומטיותהדמית דואר. בעזרת הדמית כלים לעיבוד, פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים ניתן לחלץ 3, 6, 8, כולל תוחלת חיים, גודל, כתב ניאון, מורפולוגיה תא, דינמיקת מחזור התא, וכו ', שרבים מהם קשים או בלתי אפשריים להשיג באמצעות שיטת microdissection המסורתית. מכשירים microfluidic שזכו להבלטה מחקר הזדקנות בשמרים מאז הפיתוח המוצלח שלהם 3 לפני כמה שנים, 4, 6, 7. מספר קבוצות מכן פרסמו על וריאציות של העיצובים הקודמים 5, ומעבדות שמרים רבות מועסקות התקני microfluidic המחקר שלהם.

בתרבות תא עוברת גידול מעריכי, מספר תאי אמו ישישה זמינים עבור תצפית הוא miniscule. לכן, עיקרון העיצוב הכללי של מכשיר microfluidic למדידות תוחלת חיים הוא לשמר תאי אמא ולהסיר תאים הבת. עיצובים אחד כזה עושה שימוש בעובדה שמרים עובר חלוקת התא אסימטרי. המבנים במלכודת המכשיר תאי אמא גדולים ולאפשר לתאי בת קטנים ייסחפו. שבב microfluidic המתואר במאמר זה משתמש polydimethylsiloxane רך (PDMS) כרית (עמודות pensile אנכיות) לתאי אמא מלכודת (איור 1). התקנים של עיצוב דומה דווחו 3 בעבר, 4, 6, 7. פרוטוקול זה משתמש הליך פשוט לפברק מכשירי microfluidic ו שיטת תא-טעינה פשוטה כי הוא אופטימיזציה עבור ניסויי הדמית הזמן לשגות. אחד הפרמטרים העיקריים במכשיר microfluidic הוא הרוחב של רפידות PDMS המשמשות תאי אמא מלכודת. ד שלנוevice משתמשת רפידות רחבות שיכול לשמור תאי אמא יותר תחת כל כרית, כולל חלק משמעותי של תאי אמא טרייה, שניתן לעקוב אחריהם לאורך כל תוחלת החיים שלהם. בנוסף מדידות אורך חיים, פרוטוקול זה הוא שימושי עבור ניסויי הדמית תא בודד זמן לשגות כאשר התאים צריכים להיות במעקב במשך דורות רבים או כאשר תצפית לאורך טווח החיים היא הכרחית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ייצור תבנית סיליקון ופלה

הערה: photomask נועד עם תוכנת AutoCAD ומיוצר על ידי חברה מסחרית. עיצוב זה מכיל שלוש שכבות של דפוסים שונים ( קובץ משלים 1 ). בגבהים של הראשון, השני, השלישי ושכבות עומדים 4 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 50 מיקרומטר, בהתאמה. העובש הפרוס סיליקון נוצר מן photomask באמצעות ליתוגרפיה רך 9, 10.

  1. לאפות פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להתאדות אדי מים. ספין מעיל photoresist שלילית SU-8 על גבי פרוסות סיליקון סיליקון.
    הערה: מעיל ספין SU-8 3005 ב 5000 סל"ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה הראשונה, SU-8 2010 ב 3000 סל"ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה השנייה, ו SU-8 3025 ב 2000 סל"ד במשך 30 s כדי ליצור את שכבה שלישית.
  2. Soft-אופה את הפרוסות המצופות לפני tהוא דפוס העברה. יישר ולחשוף את הפרוסות במצב "קשר ישיר" באמצעות aligner מסכה.
    הערה: Soft-לאפות את רקיק עבור 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה הראשונה, 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השנייה, ולאחר 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השלישית. השתמש במינון החשיפה ב 100 mJ / ס"מ 2 עבור השכבה הראשונה, 130 mJ / ס"מ 2 עבור השכבה השנייה, ו 200 mJ / ס"מ 2 עבור השכבה השלישית.
  3. לאחר החשיפה, פוסט-אופים את פרוסות ולפתח אותו באמצעות מפתח SU-8. לייבש את פרוסות באמצעות אקדח N 2 וקשה לאפות את פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: תבנית סיליקון מקובעת צלחת 15 סנטימטרי קוטר פטרי מפלסטיק באמצעות נייר דבק, עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. בדרך כלל, אנחנו שמים כמה מבני שבב זהה על אותו שטאנץ, המאפשר שבבי microfluidic מרובה כדי להיות מפוברקים בו זמנית. ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כל עובש פעמים רבות לפברק שבבי microfluidic.

2. Microfluidicייצור שבב

  1. מניח סירה במשקל נקיה על איזון טרה את האיזון. יוצקים 50 גרם של בסיס PDMS לתוך הסירה לשקול.
  2. להוסיף 5 גרם של סוכן ריפוי PDMS לסירה שוקל (w / w יחס של 1:10 לבסיס PDMS).
    הערה: נפח זה מבוסס על צלחת 15 ס"מ קוטר פטרי עם עובש. התאם את הכמות מגיב אם באמצעות צלחת פטרי בגודל שונה.
  3. מערבבים את בסיס PDMS ואת הסוכן ריפוי עם טפטפת הפנויה. התחל מקצה הסירה במשקל ולאט לאט להזיז פנימה. מערבבים היטב במשך כמה דקות עד בועות קטנות יוצרים ברחבי תערובת; ערבוב יסודי חיוני פילמור PDMS.
  4. יוצקים את התערובת לאט לתוך צלחת פטרי; את התערובת יש לכסות את התבנית פרוסות סיליקון לחלוטין.
  5. מניחים את צלחת פטרי בחלל ריק עבור 10 דקות כדי להסיר את כל בועות אוויר מן התערובת PDMS. אם הבועות נשארים על פני השטח של התערובת, להשתמש פיפטה לפוצץ אותן.
  6. דגירת סיליקוןעובש פרוס עם PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך כ 2 h.
  7. לקלף בעדינות את השכבה של PDMS פולימר את העובש הפרוס סיליקון, להימנע מכל פגיעת בניית התבנית הפרוסה. לחלופין, לחתוך את PDMS ישירות מהתבנית פרוסות סיליקון עם מרווח של 5 מ"מ מינימום סביב התבנית בעזרת סכין גילוח תעשייתי חד קצה; לקלף את שכבת PDMS בעדינות את התבנית הפרוסה.
  8. מניח את שכבת PDMS על הספסל עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. לחתוך בזהירות את השבב היחיד עם סכין גילוח תעשייתי חד קצה, שמירת מרווח הולם מהקצה של כל שבב יחיד, כדי למנוע ניזק הבנייה.
  9. עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה, השתמש בעט אגרוף (מזהה 0.75 מ"מ) מחורר ישר למטה דרך מעגלי הכניסה ויציאה בכל צד של הערוצים.
    הערה: אלה חורים ליצור את מסלול הזרימה של המדיום. לכן, חשוב לעבור את עיגולי אגרוף כל הדרך דרך שכבת PDMS. הקפדלהסיר את עמודות PDMS מן החור.
  10. בדוק בכל חור מנוקב על ידי החדרת מחט עט אגרוף שוב לתוך החור. ודא את המחט יכולה לצאת מהצד השני, המציין כי אין חסימה. החל קלטת אל פני שטח הדפוס, אז בעדינות לקלף את הקלטת כדי לנקות חלקיקי אבק. חזור על פעולה זו לפחות שלוש פעמים. השאר פיסה נקיה של נייר דבק על PDMS לשמור עיקור.
  11. חזור על הליך זה בצד השני של PDMS ולהשאיר את החלק האחרון של הסרט על גם כן.
  12. הכן כוס כיסוי 24 מ"מ x 30 מ"מ עם עובי של 0.13-0.17 מ"מ. תרסיס אתנול 70% על הזכוכית ויבשה עם מסיר אבק לעקר פני השטח; בנוסף, ניתן לכבס את הכוס במי autoclaved מיובשת עם מסיר אבק.
  13. העבר את מכסה זכוכית PDMS לצלחת פלסטיק. הסר את נייר הדבק מן PDMS ומניח את צד הדפוס פונה כלפי מעלה. להימנע מכל מגע עם משטח הדפוס במהלך ההעברה.
  14. מניח את צלחת הפלסטיק במכונת הפלזמה. החל טיפול פלזמת חמצן PDMS ואת מכסה הזכוכית כדי לעבד את המשטחים הידרופילי עם פרמטרי הפעולה הבאים: חשיפה, 75 s; ייצוב גז, 20 סמ"ק / min; לחץ, 200; וכוח, 100 W.
  15. בזהירות למקם את PDMS על מכסה הזכוכית, חיבור שני משטחים הידרופיליים (המשטחים אשר התמודדו במהלך טיפול פלזמה). ודא שאין בועות אוויר בין PDMS ואת מכסה הזכוכית.
  16. דגירת שבב PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך h 2 לפחות.
    הערה: מיקרופלואידיקה חסר עלול לגרום לדליפת נוזל על מיקרוסקופ במהלך הניסוי. לכן, חשוב לבדוק את הקשר בין PDMS ואת מכסה זכוכית על ידי הרמת PDMS מעט מן הקצוות עם פינצטה. בהרימו בעדינות את PDMS לא צריך להפריד אותו מכסה הזכוכית, המצביע על קשר מוצלח.

3. הכנות לקראת הניסוי

  1. כן Tube.
    1. לצלול צינורות קלט ופלט בתמיסת 70% אתנול בנפרד 1 יום לפני הכנת שבב PDMS.
    2. ממלאים מזרק 5 מ"ל עם מים autoclaved לשטוף את הצינורות. לשטוף כל צינור ידי חיבור הצינור על המזרק שטיפה בצינור מים.
    3. חזור על שלב הכביסה לפחות 3 פעמים כדי לנקות שאריות אתנול.
  2. בדוק את ערוצי PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 10X לוודא את המבנה עקבי וללא פגע. ייצב את שבב PDMS על פלטפורמת מיקרוסקופ באמצעות נייר דבק.
    הערה: הפוך שבבים מרובים בבת אחת בשלב 2 על מנת להבטיח כי ישנם שבב גיבוי, במיוחד אם מה שהופך את המכשיר בפעם הראשונה.
  3. ממלאים מזרק 5 מ"ל עם מים autoclaved. Secure את מזרק משאבת מזרק והכנס את צינורות קלט ופלט המקבילים. קבע את מהירות הכביסה כדי 750 μL / h כדי לשטוף את השבב במשך כ 10 דקות. בועות האוויר בערוצי הסניףיש נשטף במהלך תקופה זו; אם יש בועות נותרות, להתאים את המהירות ידנית כדי לחסל את הבועות.
  4. הכנת מדגם שמרים.
    1. העברת 1 מ"ל של מדגם שמרים מוכן (OD 600 0.6-0.8) לשני צינורות 1.5-מ"ל microcentrifuge צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3000 x ז.
    2. הסר את רוב supernatant מצינור כל ולשלב את השארית ליצירת מדגם 0.5 מיליליטר.
  5. השהה את משאבת המזרק ולהסיר את צינורות הזנה משבב PDMS.
  6. ידנית להפוך את משאבת מזרק כדי למצוץ בועת אוויר קטן (1 עד 2 ס"מ אורך) לתוך צינור אחד קלט. הזז על למצוץ במדגם השמרים; בועת האוויר תציג את גבול המדגם מצביע כמה כבר נמשכה מדגם.
    הערה: הימנע מוצץ המדגם לתוך המזרק.
  7. הכנס את צינור ההזנה בחזרה לתוך שבב PDMS ולהפעיל מחדש את המשאבה כדי לטעון את התאים במהירות של 750 μL / h.
  8. השאר את המזרק לשאוב במשך 10 דק 'n ולבחון את התקדמות טעינת תא תחת מיקרוסקופ; עם טעינה מוצלחת תהיה תאי מלכודת תחת יותר מ 60% של להשעות עמוד.
  9. Switch to פתרון תזונה ולהתאים את המהירות ל 400 μL / h עבור culturing תא.
  10. עמדות תצפית בחר עבור מיקרוסקופ.
    הערה: עבור מדידות אורך חיים, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 40x. לניתוח כתב הניאון, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרת שמן 60X.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר הניסויים, תוחלת החיים של תאים ורבי פנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לחלץ מן הזמן לשגות תמונות המוקלטות. מאחר שיש מספר תכונות שונות כי ניתן לחלץ כל תא, הצעד הראשון של הניתוח הוא לביאור התאים ואירועים, כולל עמדות וגבולות של התאים ואת התזמון של אירועים שונים נמצאים במעקב, כגון כמו האירועים ניצני. הערות אלו יקלו לחזור לאותה קבוצה של תאים ולנתח תכונות שונות בעתיד. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון ImageJ 11 ואת התוספים הנלווים,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשיר PDMS צריך להיעשות טרי. אחרת, את בועות האוויר הנגרם על ידי החדרת צינורות לתוך המכשיר תהיינה קשות להסיר. שלב 3.4 חשוב כדי לשפר את יעילות טעינת תא על ידי ריכוז התאים. כדי להגדיל את התפוקה של הניסוי, 4 עד 6 מודולים באותו השבב PDMS מחוברים משאבות הפועלות באופן עצמאי משמשות בדרך כלל כדי לבצע 4 עד 6 ניסויים שונים (זנים שונים או יצירות תקשורת) בו זמנית.

בהשוואת assay ההזדקנות הקונבנציונלית שמר בשכפול הדנ"א (המ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי NIH Grant AG043080 והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC), מס' 11434001. אנו מודים ללוקאס וולדבורגר על הגהה של כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3 אינץ' < 111> פרוסת סיליקוןאדיסון הנדסה
SU-8 2000 ו-3000 סדרותMicroChem
Sylgard® 184 ערכת אלסטומר סיליקוןellsworth2065622כולל Sylgard® בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי
צלחות פטריVWR391-1502
Harris Uni-core™ אגרוף (מזהה 0.75 מ"מ)סיגמא-אולדריץ'
24 מ"מ x 40 מ"מ SLIP-RITE® כיסוי זכוכיתThermo Fisher Scientific102440
3M סקוטש טייפULINES-10223
VWR® סכיני גילוחVWR55411-050
אתנול טהור, KoptecVWR64-17-5
Whoosh-Duster ומסחר;VWR16650-027
מזרק BD 5 מ"ל (Luer-Lock™ טיפ)בקטון, דיקינסון ושות'309646
צינורות קיר סטנדרטיים PTFE (100 רגל, גודל AWG: 22, מזהה נומינלי: 0.028)חברת אספקת רכיביםSWTT-22
אספקת רכיבימבחר מחטיםNEKIT-1
מייבשHACH2238300
תנור מעבדהפישר סיינטיפיק13246516GAQ
מיקרוסקופ Nikon TE2000 עם אובייקטיביות 40X ו-60XNikon
Zeiss Axio Observer Z1 עם 40X ו-60X אובייקטיביZeiss
מזרק משאבתLongerpumpTS-1B
29002513חברת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
  4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
  5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143(2013).
  8. Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
  9. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
  10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
  13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
  14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microfluidic DeviceYeast LifespanCell LoadingMicroscope ImagingPDMS ChipFlow RateYeast SampleImage Analysis

מאמרים קשורים