פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials, באמצעות תאים בלבד. Cardiomyocytes, תאים אנדותל fibroblasts מבודדים הראשון, נספר ומעורב ביחסים התא הרצוי. הם שיתוף תרבותי בארות בודדים נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. תוך 3 ימים, להכות בצורת spheroids. אלה spheroids אז הרימו ידי זרבובית באמצעות יניקה ואקום התאספו על מערך מחט באמצעות bioprinter 3D. את spheroids מותר אז כדי fuse על מחט מערך. שלושה ימים לאחר bioprinting 3D, spheroids מוסרים כתיקון שלם, אשר כבר ספונטני מכות. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
מבוא
ישנן שיטות רבות ושונות של 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting מסווגת לעתים קרובות על ידי טכנולוגיית הדפסה 1 , עם דוגמאות כגון bioprinting דיו, biocrinting microextrusion, לייזר בסיוע bioprinting, שילוב של שיטות, או גישות חדשות יותר. 3D bioprinting יכול גם להיות מסווגים לתוך ללא פיגומים או שיטות פיגום תלוי 4 . רוב השיטות של bioprinting 3D הם תלויים פיגום, שם יש צורך biomaterials, למשל ביוינקים 5 או פיגומים 6 . עם זאת, תלוי 3D פ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת Cardiomyocytes
- יצירת ותרבות האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) על 6-גם צלחות מצופה מטריצה במרתף במרתף כמתואר 10 .
- הבדל hiPSCs לתוך cardiomyocytes hiPSC נגזר (hiPSC-CMs) באמצעות שיטות המתוארות לעיל 11 , 12 .
- ביום 19 לאחר הבחנה, לבודד את cardiomyocytes באמצעות 2 מ"ל של טריפסין / EDTA 0.05% בכל טוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בסוף שלב 4.4 (שיתוף תרבות), התאים בכל טוב צריך צבירה בתחתית של מצורף נמוך במיוחד 96-טוב U-bottom צלחות כדי ליצור spheroids על ידי כוח הכבידה. אלה spheroids להכיל hiPSC-CM, HCFs, ו HUVECs, והוא יכול להיות בחן ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור, שם הם צריכים להופיע מעגלית על ידי היטל דו מימדי ( איור 1 ). בסוף שלב 6.3, תיקון לב bioprinted 3D צריך להכיל חללים ברקמה, בשל חורים מחט שנוצרו על ידי מערך המחט ( איור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חשוב להשתמש בספרואידים פועמים ופונקציונליים להדפסה ביולוגית תלת מימדית. אם ספרואידים אינם פועמים, המשך השימוש בהם יגרום תמיד למדבקה תלת-ממדית מודפסת ביולוגית לא מתפקדת.
יתרון אחד של גישה זו הוא היכולת לתפעל את תכולת התאים של המדבקה על ידי שינוי מספר התאים הכולל ואחוז הקרדיומיוציטים, תאי האנדותל והפיברובלסטים בספרואידים. זה מאפשר להדפיס סוגים רבים ושונים של מדבקות לב, עם תכונות היסטולוגיות ומכניות שונות.
גישה זו מאפשרת גם להשתמש בסוגים שונים של ספרואידים לייצור מדבקה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
המחברים מאשרים את מקורות המימון הבאים: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research ו- Maryland Stem Cell Research Research (2016-MSCRFI-2735).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Geltrex | Invitrogen | ||
| טריפסין/EDTA 0.05% | תרמו פישר | 15400054 | |
| מעכב טריפסין מוגדר 0.0125% | תרמו פישר | R007100 | |
| RPMI מדיה סלולרית | Invitrogen | 11875-093 | RPMI בתוספת B27 מהווה מדיה תרבית HIPSC-CM |
| תוסף B-27 | פישר | 17504044 | RPMI בתוספת B27 מהווה HIPSC-CM מדיה תרבית |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| פיברובלסטים לבביים אנושיים (סוג חדר למבוגרים) | Sciencell | 6310 | |
| תאי אנדותל וריד טבורי אנושי | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface חיבור נמוך במיוחד 96 בארות צלחות U תחתונות | אקיטה סומיטומו בקליט ושות' | MS-9096UZ | |
| מדפסת תלת מימד Regenova Bio | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T נוגדן | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) נוגדן | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
מקורות
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
