התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Summary

מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H ₂ DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

Abstract

מינים חמצן תגובתי (ROS) מווסתים תהליכים תאיים חיוניים, כולל ביטוי גנטי, הגירה, הבחנה והתפשטות. עם זאת, רמות ROS מוגזמות לגרום למצב של מתח חמצוני, אשר מלווה בנזק חמצוני בלתי הפיך ל- DNA, שומנים וחלבונים. לפיכך, כימות של ROS מספק פרוקסי ישיר למצב הבריאות הסלולרית. מאז המיטוכונדריה הם בין המקורות הסלולר העיקריים ומטרות של ROS, ניתוח משותף של תפקוד המיטוכונדריה ו ROS הייצור באותם תאים הוא חיוני להבנה טובה יותר של הקישוריות בתנאים פתופיזיולוגיים. לכן, אסטרטגיה גבוהה מבוסס מיקרוסקופ אסטרטגיה שפותחה עבור כימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה (ΔΨ _{מ '} ) ומורפולוגיה המיטוכונדריה. הוא מבוסס על מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומאטי widefield וניתוח תמונה של תאים חסיד חיים, גדל צלחות רב, וכן staineD עם חדיר תאים חדיר מולקולות פלורסנט CM-H ₂ DCFDA (ROS) ו TMRM (ΔΨ _מ ו מורפולוגיה המיטוכונדריה). בניגוד fluorimetry או זרימת cytometry, אסטרטגיה זו מאפשרת כימות הפרמטרים subcellular ברמה של תא בודד עם רזולוציה גבוהה spatiotemporal, הן לפני ואחרי גירוי ניסיוני. חשוב לציין, את האופי מבוסס התמונה של השיטה מאפשרת לחלץ פרמטרים מורפולוגיים בנוסף עוצמת האות. מערך התכונות המשולב משמש לניתוח נתונים רב-משתני וניתוח סטטיסטי כדי לזהות הבדלים בין תת-אוכלוסיות, סוגי תאים ו / או טיפולים. הנה, תיאור מפורט של assay מסופק, יחד עם ניסוי לדוגמה זה מוכיח את הפוטנציאל שלה לאפליה חד משמעית בין מדינות הסלולר לאחר הפרעה כימית.

Introduction

ריכוז של ROS תאיים הוא מוסדר בקפידה באמצעות אינטראקציה דינמית בין ROS לייצר ROS מערכות defusing. חוסר איזון בין שני מעורר מצב של מתח חמצוני. בין המקורות העיקריים של ROS הם המיטוכונדריה ¹ . בהינתן תפקידם בנשימה התאית, הם אחראים על חלק הארי של מולקולות הסופר-חמצן הבין-תאיות (O ₂ ^{- -} ). זה נובע בעיקר דליפת אלקטרונים O ₂ ב 1 מורכבים של שרשרת התחבורה האלקטרון בתנאים של פוטנציאל פנימי שלילי מיטוכונדריאלי שלילי (Δψ _{מ '} ), כלומר hyperpolarization המיטוכונדריה. מצד שני, dololarization המיטוכונדריה יש גם מתואמים עם ייצור ROS מוגברת הצבעה על מצבים מרובי....

Protocol

פרוטוקול להלן מתואר כפי שבוצעה עבור תאים NHDF ועם השימוש של לוחות multiwell המפורטים בקובץ חומרים. ראה איור 1 לקבלת סקירה כללית על זרימת העבודה.

1. הכנה של ריאגנטים

1. הכן בינוני שלם על ידי הוספת Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם 10% V / V בסרום שור העובר (FBS) ו 100 IU / מ"ל ​​פניצילין ו 100 IU / מ"ל ​​סטרפטומיצין (PS). במשך בינוני 500 מ"ל מלא, להוסיף 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של PS ל 445 מ"ל של DMEM.

Results

Assay כבר benchmarked באמצעות מספר ניסויים שליטה, את התוצאות אשר מתוארים Sieprath et al. ¹ . בקצרה, התגובה הקרינה של CM-H ₂ DCFDA ו TMRM לשינויים המושרה באופן חיצוני ROS תאיים Δψ _{מ ',} בהתאמה כבר לכמת כדי לקבוע את טווח דינמי. עבור CM-H ₂ DCFDA, הראה NHDF עלייה ליניארית האות הקרינה כאשר מטופלים עם ריכוזים הולכים וגדלים של TBHP בין טווח של 10 מיקרומטר עד 160 מיקרומטר. כמו כן, עבור TMRM,.......

Discussion

מאמר זה מתאר שיטה גבוהה תוכן מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים ו morphofunction המיטוכונדרי ב NHDF. הביצועים שלה הודגם עם מקרה מבחן על SQV שטופלו NHDF. התוצאות תומכות בראיות מוקדמות יותר מהספרות שבהן רמות ROS גבוהות או תפקוד מיטוכונדריאלי נצפו לאחר טיפול במעכבי פרוטאז מסוג 1, אם כי בניסויים נפרדים ^{19 , 20 , 21 , 22 ,}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>ריאגנטים
טטרמתילרודמין, מתיל אסטר, פרכלורט (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (מחוון מתח חמצוני כללי)	ThermoFisher Scientific	C6827
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא)Aldrich	D8418
MatriPlate 96 באר זכוכית תחתונה MicroWell צלחת 630 ומיקרו; L-שחור 0.17 מ"מ מכסה זכוכית נמוכה	ברוקס מערכות מדעי החיים	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o פנול אדום 500 מ"ל	לונזה	BE10-527F
DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין	לונזה	BE12-604F
פוספט מי מלח (PBS) ללא Ca ו-Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 מ"ל	לונזה	17-737F
תמיסת Trypsin-Versene (EDTA)	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד ארנב IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	נוגדן המשמש לרכישת תמונת שדה שטוח
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 שבר חמור נגד ארנב IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	נוגדן המשמש לרכישת תמונת שדה שטוח
name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti מיקרוסקופ שדה רחב ליקוי	חמה Nikon
מערכת מיקוד מושלמת (PFS)	מבוססת		מערכת פוקוס אוטומטי
CFI Plan Apo Lambda 20X אובייקטיבי	Nikon
Name<	strong>Company	Catalog Number	>Comments
strong>Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS	module Nikon		תוכנה זו משמשת לניווט המיקרוסקופ ולתכנת/לבצע את רכישת התמונה האוטומטית prototocol
ImageJ (FIJI) גרסה 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio גרסה 1.0.44	Rstudio
R גרסה 3.3.2