החקירה של סחר קרום הוא חיוני להבנת תפקודים נוירונים. כאן, אנו מציגים שיטה לכימות תנועתיות שלפוחית נוירונים. זוהי שיטה נוחה שניתן להתאים את כימות של סחר קרום במערכת העצבים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
במוח, מערכות סחר ממברנה משחקות תפקידים חשובים בוויסות תפקודים עצביים, כגון מורפולוגיה נוירונים, גמישות סינפטית, הישרדות ותקשורת גלייה. עד כה, מחקרים רבים דיווחו כי פגמים במערכות אלה גורמים למחלות עצביות שונות. לפיכך, הבנה של המנגנונים הבסיסיים של הדינמיקה שלפוחית עשוי לספק רמזים משפיעים שיכולים לסייע בטיפול של הפרעות עצביות מספר. כאן, אנו מתארים שיטה לכמת motities שלפוחית, כגון מרחק התנועה ואת קצב התנועה, באמצעות תוכנה plug-in עבור פלטפורמת ImageJ. כדי להשיג תמונות לכימות, אנו שכותרתו מבנים endosome-lysosome נוירונים עם EGFP- מתויג שלפוחית חלבונים סמן נצפתה התנועה של שלפוחית באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות. שיטה זו שימושית מאוד לפשט את תנועת שלפוחיות מדידה neurites, כגון אקסונים ודנדריטים, כמו גם סומה של שני נוירונים ותאי גלייה. מחיר SONYמחדש, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על שורות תאים אחרים, כגון fibroblasts ותאי האנדותל. גישה זו יכולה לספק התקדמות חשובה של ההבנה שלנו של סחר קרום.
מבוא
שליטה מדויקת של סחר endosome-lysosome היא הכרחית לוויסות פונקציה העצבית. יש לציין כי התנועות הדינמיות של שלפוחיות אלה הן גורם מרכזי ביסוד המורפולוגיה הנוירונים, הפיתוח והישרדות. פגמים במערכת זו לגרום להפרעות נוירונים חמורים 1 , 2 . המנגנונים המולקולריים המקשרים בין סרטן שלפוחית למחלות נוירונים נחשבים מסובכים, וכמה קבוצות ביקשו לבחון את הרלוונטיות הזו. לדוגמה, דווח כי תנועה נידחת מאוחר של האינדוזום קשורה באופן משמעותי למחלת נימן-פיק 3 , מחלה תורשתית נוירו-גנטית הנגרמת על ידי פגמים בליזוזום. דוגמה נוספת היא מוטציה של ערוץ Ca 2 + ly....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור של אוניברסיטת Tsukuba טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC).
1. דיסקציה
- כדי להכין יום עובריים 13-14 ICR או C57BL / 6 עוברים, להרדים עכברים בהריון על ידי פריקה צוואר הרחם. הסר את הרחם והכניס אותו לתוך צלחת פטרי עם תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS). שוטפים אותו היטב כדי להסיר את הדם.
- באמצעות מלקחיים, להעביר את הרחם לצלחת פטרי חדש עם אתנול 70% לעקר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Assay זה נועד למדוד את הדינמיקה שלפוחית בתרבות חוץ גופית . Assay זה נוצל כדי לקבוע את תנועתיות שלפוחית הקשורים מורפולוגיה העצבית והישרדות. איור 1A ו- B להציג נתונים נציג מראה תנועתיות lysosome בנוירונים. נוירונים בקליפת המוח היו transfected עם סמן lysosome, LAMP-EGFP, ונצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. זה כבר דווח בעבר כי ספציפי endosome-lysosome שלפוחית הם ניידים מאוד, אפילו נוירונים מנוחה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מציג את ההליך לכימות תנועתיות שלפוחית. ב נוירונים ראשוניים, endosomes ו lysosomes נוטים להראות תנועתיות גבוהה אצל נוירונים צעירים יותר (4-6 DIV). בהתחשב בכך נוירונים חייבים לספק כמה רכיבים לקצוות המובילים להאריך תהליכים עצביים, סחר קרום צריכה להתרחש באופן דינמי במהלך שלב זה. לכן, חשוב להשתמש נוירונים צעירים יותר כדי לבחון תנועתיות דינמית ב דנדריטים עצביים. בנוסף, שלפוחית גדולה יותר לא נוטים להציג תנועתיות גבוהה, אפילו אצל נוירונים צעירים יותר. תקנה של גודל שלפוחית .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים לד"ר ריקרדו דולמטש (בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, השתייכות נוכחית: מכוני נוברטיס למחקר ביו-רפואי) על סיוע בפיתוח ניתוח זה וד"ר מתיו ווד, טקומה איהארה ודנגסוק קים לקריאה ביקורתית של כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מדיום נוירובזאלי | תרמו פישר | 21103-049 | |
| מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985070 | מדיום ללא סרום |
| תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) | Thermo Fisher | 14170112 | |
| פניצילין Streptmycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
| תוספי L-גלוטמין | תרמו פישר | 25030081 | |
| B-27 | תרמו פישר | 17504044 | |
| 2.5% טריפסין | תרמו פישר | 15090046 | |
| פולי-די-ליזין הידרוברומיד (PDL) | Sigma | P7280 | |
| פולי-L-אורניתין (PLO) | Sigma | P4957 | |
| מסננת | תאי ניילוןקורנינג | 431750 | |
| ליפופקטמין 2000 | תרמו פישר | 11668027 | מגיב טרנספקציה |
| פוליאתילאימין "מקס" (PEI) | Polysciences | 24765 | מגיב טרנספקציה. כחלופה לליפופקטמין 2000, ניתן להשיג 0.1 מ"ג/מ"ל פוליאתילן מומס במים מעוקרים. אבל זה יעילות נמוכה ורעילות גבוהה. |
| BIOREVO BZ-9000 | Keyence | NA | |
| מערכת דגירה INUG2-K13 | Tokay Hit | NA | |
| GraphPad Prism גרסה 6.0 | GraphPad | ||
| NA Excel גרסה 15 | Microsoft | NA | |
| ImageJ verion 1.47 | NA | NA |
מקורות
- Nicot, A. S., Laporte, J. Endosomal phosphoinositides and human diseases. Traffic. 9 (8), 1240-1249 (2008).
- De Matteis, M. A., Luini, A. Mendelian disorders of membrane trafficking. N Engl J Med. 365 (10), 927-938 (2011).
- Lebrand, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
