מאמר שיטה

סוללה של התנהגות בדיקות להערכת גנרל גפיים, כוח השרירים, תיאום בעכברים

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55491

⸱

23 בינואר 2018

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Neuroscience Studies, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Medical Genetics/ Department of Pediatrics, Kingston General Hospital, Centre for Neuroscience Studies, and Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University

במאמר זה

סיכום

בדיקה התנהגותית משמש בניסויים קליניים כדי להעריך את ההשפעות פנוטיפי של מחלה או טיפול על רווחתם של חיה. כדי להעריך באופן גלובלי תפקוד מוטורי, בחרנו בדיקות כלליות גפיים, כוח השרירים של תיאום: במגרש הפתוח מבחן, הבדיקה רשת, ואת הבדיקה rotarod, בהתאמה.

תקציר

בדיקה התנהגותית משמש בניסויים קליניים כדי להעריך את ההשפעות פנוטיפי ואת תוצאות מחלה מסוימת או טיפול בעל על רווחה ובריאות של החיה. ישנם מבחנים התנהגותיים רבים כי ניתן להחיל. בחרנו למבחן ומכניקה כללי, במגרש הפתוח מבחן (OFT); בדיקת כוח שרירים, רשת השינוי מבחן (MT); מבחן קואורדינציה, הבדיקה rotarod (RR). הבדיקה יכולה להתבצע על בסיס שבועי או חודשי. כדי לבחון גפיים כללי, יצירותיהם של OFT ערכי התנועה תוך העכבר ניטור באופן אובייקטיבי הוא מנגנון בשטח פתוח. השדה הוא בדרך כלל תיבה 2' x 2', התנועות נרשמות באמצעות לייזר חישה או באמצעות לכידת וידאו. העכבר ממוקם במרכז המגרש, לנוע בחופשיות עבור הבדיקה. MT משתמש ההשהיה עכבר כדי ליפול ומציג מסך הפוך כאמצעי של כוח השרירים. עכבר מושם על מסך, אשר היא הפוכה מעל תיבת נקה, במשך השהיה שלהם ליפול. מתוזמן. שלושה ניסויים מבוצעים, עם הטוב ביותר של משפטי שלושה הבקיע ליום הזה. ציון של 60 s הוא הזמן המרבי עכבר שנשאר הפוכה. עכברים ניתנת תקופת מנוחה 5-מין בין רשת הניסיונות. לבסוף, פרוטוקול מואצת ב RR מעריך קואורדינציה וסיבולת. במהלך משפט, עכבר הולכת על מוט סיבוב שכן היא מגבירה את מהירות מ- 4 סל ד כדי 40 סל ד מעל 5 דקות. המשפט מסתיים כאשר העכבר נוגע החיישן magnetized לחץ כשהחיים יורדים. כל עכבר עובר שלושה ניסויים, המשפט הכי טוב הוא הבקיע ליום הזה. נתונים התנהגותיים משולב זה מאפשר ההערכה הכללית של ניידות, קואורדינציה, כוח, תנועת מבעלי החיים. לפחות שתיים מתוך שלוש מידות בדיקה התנהגותית יש להציג שיפור בעל חיים להיות זכאי כבעלי הכוללת שיפור בתפקוד מוטורי.

מבוא

המטרה של בדיקה התנהגותית היא למדוד את אפיון פנוטיפי, אם בלימודי עבור דגם העכבר החדש של מחלות התוקפות את מערכת העצבים המרכזית או עבור גירסת ניסיון של טיפול חדש. ישנם מגוון רחב של בדיקות התנהגותית לבחירה. הרציונל שבבסיס באמצעות שילוב של בדיקות התנהגותית היא לעתים קרובות להעריך באופן מלא את תוצאות הטיפול קליניים. הסוללה של בדיקה התנהגותית בזאת כולל ניסוי השדה פתוח (. למוד), הבדיקה רשת (MT), rotarod את הבדיקה (RR).

OFT משמש כאמצעי של פעילות גינקולוגיות כללי1,2,3,4,5,6,7. ההערכה מאפשרת את העכבר כדי להזיז בחופשיות בשטח פתוח, המדידות לקחו התנועות של העכבר במהלך המשפט התנהגותית. כמותני עשה שימוש OFT כוללים גידול, מרחק זז, הזמן בילה זז (למשל, הליכה וריצה), ושינויים בפעילות לאורך זמן (למשל, קופץ והיפראקטיבית יותר איטי/תנועות), ולכן הוא מהווה ו ניתוח מעמיק של התנהגות מכרסמים.

הר משמש כדי להעריך את כוחו של עכברים1,2,8,9,10,11. השימוש של כל ארבעת הגפיים לתלות מחוץ רשת מחוט מאפשר המדד לא פולשנית של היכולת של העכברים להראות את האיבר מתמשכת המתח while מנוגדות את השפעות כוח הכבידה. הערכה זו נעשית על ידי הצבת עכבר על רשת הפוך ואת התזמון שלה השהיה ליפול. את כוח השרירים של העכבר על ידי מדידת כמה זמן הוא יכול להחזיק עצמה על-גבי המסך הפוך לפני ליפול ששוחררו.

RR מעריך את התיאום של עכבר תוך שימוש האצת פרוטוקול1,2,7,8,9,12,13. המנגנון rotarod מורכב קרן גלילי שמסובבת באוויר החל מ- 4 סל ד. העכבר ניתן ללמוד מיומנות זו קואורדינציה, ואז קוראים תיגר על ידי גדל לאט, מצטבר עד 40 סל ד. באופן קלאסי, פרוטוקול קבוע המהירות היא מידה של כוח השרירים, ואילו פרוטוקול מאיץ RR מעריך תיאום, סיבולת, כוח השרירים1,2,7, 14.

היתרונות של אלה שלוש בדיקות התנהגותיים הם כי הן נרחב מקובלות ברחבי מכרסמים התנהגותית בדיקות הקהילה2,7,8,9, וכאשר שנלקחה לא רק הסכום בדיקות בודדות, אך באופן קולקטיבי, הם יכולים לשמש הערכה גלובלית של התנהגות פנוטיפי כאשר חוקרים את תוצאות שונות של טיפולים ניסיוניים. OFT נמנה רק בדיקות גינקולוגיות הכולל פעילות2. RR הוא גם אחד הדרכים היחידות כדי להעריך תיאום2, אחרים מאשר להשתמש בתוכנת ניתוח הילוך, בו לא נדון כאן. ישנן כמה דרכים בהן כוח השרירים של עכבר יכול להידרש; עם זאת, שימוש של MT, או מבחן לתלות תיל, שימש prevalently בספרות, מתקבלת כשיטה אמין לבדיקת כוח השרירים2,8,9,10, 11. טכניקות רבות אחרות למדידת ומכניקה כללי ותיאום הם מאוד לארוך זמן רב, לייצר מידע אמין (למשל, באופן ידני עיתוי תנועת העכבר או באופן ידני ציור כפות לניתוח הילוך). מערכות אוטומטיות עבור OFT את ו- RR להגביר את המהימנות ואת תוקפם של נתוני המיוצר ולחסוך זמן ומאמץ.

לדוגמה, בהתחשב את הקשורים ניוון מוחיים של דגם העכבר מחלת Sandhoff, בעת ביצוע סוללת מבחנים זו, OFT יהיה הראשון של אלה בדיקות להערכת ליקויים מוטוריים כי הם ראו בדרך כלל במודל עכבר זה החל בגיל 3 חודשים. לגירעונות קואורדינציה צריך להפוך גם לכאורה החל בגיל 12 שבועות. לגירעונות כוח השרירים צריכים להתחיל בסביבות גיל 14 שבועות בלבד, אך הם בסופו של דבר להיות הרבה יותר משמעותי על ידי 16 שבועות.

בדיקות אלה שימושיים כאשר הלומדים המחלות הגורמות לליקויים מוטוריים משמעותית, כולל מחלות ניווניות9 כגון Sandhoff המחלה1,8,13, מחלת פרקינסון7, מחלת הנטינגטון, טרשת נפוצה. הבדיקות יכול לשמש גם כדי ללמוד הזדקנות וכדי להפוך השוואתי הערכות גריאטרי או מדידות של בריאות. הפרעות בהליכה ושינויים ומכניקה ואיזון נראים רבים של מצבי מחלה אלה. עם זאת, התועלת של בדיקות אלה אינה מוגבלת למחלות עם תסמינים neuromuscular ונפוצים.

אנא שימו לב כי היו לא המשתנים מבלבלים ציין ביחס מוטיבציה או החידוש של כל אחד האמצעים המתוארים בדיקה התנהגותית. . זה בוודאות מצבי מחלה ובכפוף פתולוגיות כי החוקרים להשיג נתונים התנהגותיים ראשוני לפני העכבר מראה תסמינים פנוטיפי; החוקר צריך מעת לעת (שבועי) להבטיח כי כל ליקויים מוטוריים ספורים. מחלות רבות יש את הופעת התסמינים פנוטיפי מהירה, ללא בדיקה שבועית, תסמינים אלו לא להיות אחראים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים המתוארים במסמך זה בוצעו לפי, ואושרו על-ידי, המלכה החיה טיפול הוועדה הכלל אוניברסיטאית. התדירות של בדיקה התנהגותית יכול להיות שבועי או חודשי, או שילוב של השניים (קרי, לשבוע כאשר אני מצפה לראות את ההבדל הגדול ביותר, ויותר במקומות אחרים).

הערה: מחקרים התנהגותיים מאתר בעיקר סקס/גיל/זן-תלוי, לכן חיוני כדי לאסוף את נקודות זמן עצמי וניתן להשאר עקבי לרוחב קבוצות הניסוי. גורמים סביבתיים (למשל, ריחות, רעש, טמפרטורה, לחות תאורה, וכו ') להשפיע במידה רבה על התנהגות וחרדה בעכברים. נסה להפחית כמה שיותר גורמים סביבתיים אלו.

1. בדיקת שדה פתוח

הערה: לפני בדיקה התנהגותית, בעלי החיים צריך להיות בלתי לחדר הבדיקות איפה יתקיים במשך 10-15 דקות לפני תחילתה של בדיקות. ודא כי ציוד מגן אישי המתאים כל מתקן מקומי הנחיות עוקבים עבור הפרוטוקולים בדיקה התנהגותית.

הערה: אין הכשרה לפני הבדיקה.

  1. ודא המחשב ואת התוכנית OFT, פועל, ומחובר כראוי על המצלמה או תיבת שדה פתוח. לחץ על התוכנית smartware, סמל בשטח פתוח ו "אישור." בחר מקור "דיגיטלית ממיר אנלוגי" מתוך אפשרויות המצלמה. לחץ על "גילוי", ודא כי השטח שדה פתוח הוא מדמיין כי הממדים הם 30 ס"מ על 30 ס"מ.
    הערה: לפריסה ציוד עשוי להשתנות בהתאם אילוצי מקום, אך להבטיח את המחשב ואת שדה פתוח המנגנון נמצאים קרוב זו לזו חדר מואר היטב עבור לכידת וידאו נאותה.
  2. לחץ על "כיול", "תמונה", ואחר כך "אישור" כדי לוודא כי העכבר הוא להתגלות בגבולות המגרש. לחץ על "זמן" כדי להגדיר מראש את משך הזמן לבחון את העכברים; במקרה זה, קבע 5 דקות.
  3. הזן את הנושאים על-ידי לחיצה על סמל "נושאים". לחץ על "מתזמן" והאר מבחן כל הנושאים ולאחר מכן לחץ על החיצים הירוקים כפול, "השלב הראשון, מפגש ראשון;" זה יביא בכל הנושאים על מנת להתחיל באיסוף נתונים.
  4. במקום עכבר במרכז המגרש ולחץ על הסמל "התחל" כדי להנחות את התוכנית כדי להתחיל את ההקלטה. מבחן עכבר אחד בלבד בכל פעם.
  5. לאחר 5 דקות תושלם, התוכנית יעבור אוטומטית לנושא הבא. במקרה זה, להסיר את העכבר זה סיים את המבחן והנח לנושא הבא לשטח הפתוח. לחץ על "התחל".
  6. נגב את הציוד. חזור על הצעדים 1.3-1.4 הנבדקים הנותרים.
  7. על מנת לנתח את הנתונים לאחר כל הנבדקים עברו בדיקות, לחץ על סמל "לנתח" בחלק העליון של המסך. לחץ על "לנתח" שוב ולאחר מכן "דוח סיכום". באופן אופציונלי, לייצא את הנתונים על גבי USB.

2. מבחן mesh

הערה: שטח הפנים ואת הגודל של הרשת ב- MT עשויים להשפיע ביצועים. ב- MT, אם עכבר נופל בתוך הראשונות 10 s במהלך הזמן האוסף הראשון 2 נקודות, הם יושם בחזרה על רשת השינוי מיד על ניסיון נוסף. רשת השינוי נעשה שימוש במסמך זה היה מחוט מתכת, עם החורים רשת כ 1.5 מ מ קוטר.

הערה: הפעלת בדיקות אלה באותו זמן של יום מומלץ, כיוון פרמטרים פיזיולוגיים וביוכימי משתנים לאורך כל היום. Bodyweight עשוי להשפיע על הביצועים במבחן הזה, ולכן חייבים להילקח בחשבון.

  1. במקום עכבר במרכז של רשת שינוי, להפוך את רשת לפחות 20 ס"מ מעל מיכל ברורה. ברגע הפוכה, להתחיל את הטיימר.
  2. וזמן שיא תקופת החביון ליפול. אם העכבר לא נופל בתוך 60 s, תן את זה ציון של 60 s והתנהלות לא עוד ניסויים. לאפשר את העכבר כדי לנוח לפחות 5 דקות. . זה הסוף של משפט 1.
  3. לנגב ומטה את הציוד במהלך מרווח בין הניסיון 5-מין, בדיקת עכבר השני, אם נדרש. חזור על השלבים 2.1-2.2 לניסויים 2 ו- 3, במידת הצורך (כל עוד בעכבר לא ציון 60 s, זה צריך לעבור שלושה ניסויים).

3. Rotarod המבחן

הערה: השטח ואת קוטר של המוט על RT עשויים להשפיע ביצועים. ב- RT, אם עכבר נופל בתוך הראשונות 10 s במהלך נקודות זמן אוסף 2 הראשונות, להחזיר. אותה על המוט מיד על ניסיון נוסף.

הערה: הפעלת בדיקות אלה באותו זמן של יום מומלץ, כיוון פרמטרים פיזיולוגיים וביוכימי משתנים לאורך כל היום. Bodyweight עשוי להשפיע על הביצועים במבחן הזה, ולכן חייבים להילקח בחשבון.

  1. הפעל את שני – rotarod והמחשב. ודא שהם מחוברים כראוי עבור הקלטת נתונים.
  2. ודא כי התוכנית פועל פרוטוקול מואצת. הגדר לאורך הרצוי של הבדיקה rotarod xxx (הטווח החוקי הוא 000 עד 999); במקרה זה, הקש על 300 *. להגדיר את מספר הנתיבים כדי לשמש xxx (הטווח החוקי הוא 001 עד 005); במקרה זה, הקש על 005 *. להגדיר את מהירות ההתחלה כדי xxx rpms (הזן 3005 5 rpms; הטווח החוקי הוא 001 עד 045); במקרה זה, הקש 004 *.
  3. להגדיר את המהירות xxx rpms (הזן 4,030 30 rpms; הטווח החוקי הוא 001 עד 045); במקרה זה, הקש 040 *. הגדר את מהירות שיפוע xxx ב- s (הזן 5,030 כבש 30-s כדי מהירות מירבית; הטווח החוקי הוא 000 עד 999); במקרה זה הקש 300 *. הגדר את יחידת למצב העכבר (הזן 6001 עבור העכבר קדימה, 6002 עבור העכבר הפוכה); במקרה זה, הקש 6001 *.
  4. ודא כי כל הנתיבים magnetized מאוזנים לפני תחילת המשפט. מקום עכבר אחד כל ליין של rotarod.
  5. הקש התחל כדי להפעיל את התוכנית. כמו העכברים נופלים, להסיר אותם מן הנתיבים שלהם מיד על מנת להבטיח כי הם לא "הטיול" המסלולים אחרות.
  6. לאפשר העכברים לנוח עבור מרווח בין-למשפט 10 דקות. . זה הסוף של משפט 1. במהלך מרווח בין משפט, לנקות את הציוד ולהתחיל המשפט לסט הבא של עכברים.
  7. חזור על שלבים 4-6 לפי הצורך. אם העכבר נשאר על rotarod למשפט מלא 5-מין, אין ניסויים נוספים נדרשים עבור העכבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

החיות המחקר עשוי לעבור את הפרדיגמה בדיקה התנהגותית שבועי או חודשי כדי להכיל את הזמן הדרוש הנקודות הדרושות לצורך ניתוח. לקבלת דוגמאות התזמון בדיקה התנהגותית, ראה איור 1 . בנתונים נציג להלן, שנלקחו Osmon et al. (2016), העכברים עברו את הסוללה של התנהגות בדיקות אחת לחודש, החל בגיל 12 שבועות של גיל, עד קצה ההומאנית שלהם בסביבות גיל 40 שבועות. העיתוי של בדיקה התנהגותית לפעמים הוא קריטי עבור ניסוי, במיוחד כאשר ההישרדות של מטופל נגד חיות שטופלו נע באופן דרסטי, השוואות נד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עבור כל הבדיקות, לנקות ולחטא את השטח כדי למזער את contagions ואת distractors לעכברים. גם, לוודא כי העכברים בהתחשב תקופות מנוחה מספקת בין משפטים ובין התנהגות בוחנים בעת שימוש את OFT RR, הר

OFT, הוא קריטי כי כל עכבר תמוקם במרכז המגרש, כי התוכנית מופעל בעת השחרור של העכבר לתוך המרכז. להיות בטוח שאין שום תנועות ידיים שהחיישנים יכולים להירשם בעת הפעלת התוכנית.

הר, חשוב שיהיה חיץ בין אזור רשת שבו העכבר יהיו תלויים בצדדים של המיכל שהם נופלים אל תוך. זה נרשמה כי כאשר העכברי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות קרן תקווה חדשה לאחרונה שלהם המשך תמיכה ומימון המחקר שלנו. כן נרצה להודות שני – תמיכה כספית חלקית לעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IITC Life Sciences Rotarod עם תוכנת מחשוב סדרה 8 IITC Life Sciences755
שדה פתוח מרובע 45 x 45 x 40 ס"מ (צבע אפור). צבע רצפה אחר זמין: לבן, שחור.Harvard Aparatus (PanLab)760190
  מודול שדה פתוח מוגדר מראשHarvard Aparatus (PanLab)760688
פלטפורמת תוכנה Smart V3.0 Harvard Aparatus (PanLab)760681
ממיר וידאו (אנלוגי/דיגיטלי)Harvard Aparatus (PanLab)760262
מערכות תיקון גג למצלמהHarvard Aparatus (PanLab)760277
מצלמה ועדשה אנלוגית של SonseNTSCHarvard Aparatus (PanLab)760505

מקורות

  1. Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
  2. Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
  3. Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
  4. Menalled, L. B., et al. Early motor dysfunction and striosomal distribution of huntingtin microaggregates in Huntington's disease knock-in mice. J.Neurosci. 22, 8266-8276 (2002).
  5. Grusser, C., Grusser-Cornehls, U. Improvement in motor performance of Weaver mutant mice following lesion of the cerebellum. Behav. Brain Res. 97, 189-194 (1998).
  6. De Leonibus, E., et al. Spatial deficits in a mouse model of Parkinson's disease. Psychopharmacology (Berl). 194, 517-525 (2007).
  7. Morris, M., Koyama, A., Masliah, E., Mucke, L. Tau Reduction Does Not Prevent Motor Deficits in Two Mouse Models of Parkinson's Disease. PLoS ONE. 6 (12), 1-7 (2011).
  8. Abo-ouf, A., et al. Deletion of tumour necrosis factor-α ameliorates neurodegeneration in Sandhoff disease mice. Human Molecular Genetics. , 1-16 (2013).
  9. Dumont, M. Behavioral Phenotyping of Mouse Models of Neurodegeneration. Neurodegeneration : Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 793, 229-237 (2011).
  10. Cabe, P. A., Tilson, H. A., Mitchell, C. L., Dennis, R. A simple recording grip strength device. Pharmacol. Biochem. 8, 101-102 (1978).
  11. Barnēoud, P., Loliver, J., Sanger, D., Moser, P. Quantitative motor assessment in FALS mice: a longitudinal study. Neuroreport. 8, 2861-2865 (1997).
  12. Lui, Y., et al. Mouse model of GM2 activator deficiency manifests cerebellar pathology and motor impairment. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8133-8143 (1997).
  13. Sango, K., et al. Mouse models of Tay-Sachs and Sandhoff diseases differ in neurologic phenotype and ganglioside metabolism. Nature Genetics. 11 (2), 170-176 (1995).
  14. Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor inco-ordination in naïve mice. Nauyn-Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 259 (2), 211(1968).
  15. Deacon, R. M. J. Measuring the Strength of Mice. Journal of Visualized Experiments JoVE. (76), (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

arod

מאמרים קשורים