פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

Rupesh Agrawal; Praveen Kumar Balne; Sai Bo Bo Tun; Yeo Sia Wey; Neha Khandelwal; Veluchamy A. Barathi

doi:10.3791/55495

Method Article

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

DOI:

10.3791/55495

⸱

July 3rd, 2017

Rupesh Agrawal*¹^,²^,³ , Praveen Kumar Balne*² , Sai Bo Bo Tun² , Yeo Sia Wey² , Neha Khandelwal¹ , Veluchamy A. Barathi²^,⁴^,⁵

¹National Healthcare Group Eye Institute, Tan Tock Seng Hospital, ²Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore National Eye Center, ³School of Material Science and Engineering, Nanyang Technological University, ⁴Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University Health Systems, National University of Singapore, ⁵Ophthalmology Academic Clinical Research Program, DUKE-NUS Graduate Medical School

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה חיה של תאי הדם המסומנים במחזור העין יכולה לספק מידע על דלקת ואיסכמיה ברטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי הקשור לגיל. פרוטוקול לתווית תאי דם ותמונה תאים שכותרתו במחזור הרשתית מתואר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דינמיקה זרימת הדם של הרשתית והקורואידאלית עשויה לספק תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה והשלכות של מחלות עיניים שונות, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ותנועות דלקתיות אחרות. זה עשוי גם לעזור לפקח על התגובות הטיפוליות בעין. התיוג הנכון של תאי הדם, יחד עם הדמיה תא חי של תאים שכותרתו, מאפשר חקירה של דינמיקה הזרימה של הרשתית ואת זרימת הדם הצורואידית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים סטנדרטית של 1.5% indocyanine ירוק (ICG) ו 1% תיוג פלואורסצין נתרן של עכברים אריתרוציטים ו leukocytes, בהתאמה. סריקה לייזר ophthalmoscopy (SLO) הוחל לדמיין את התאים שכותרתו במחזור הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). שתי השיטות הפגינו תאים שונים שכותרתו fluorescently במחזור הרשתית של העכבר. שיטות תיוג אלה יכולות להיות יישומים רחבים יותר במחלות עיניים שונותמודלים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימוד דינמיקה הזרימה של תאי הדם במחזור הרשתית והקורואידית היא הכרחית להבנת הפתוגנזה של מחלות עיניים אפשריות המסתכנות בראייה ובעיות דלקתיות אחרות. עם זאת, טכניקות אנגיוגרפיה קונבנציונאלי, אשר כרוך מחייב של צבעים פלואורסצנטי חלבונים פלזמה, אינם מספקים כל מידע לגבי הדינמיקה של אריתרוציטים או לויקוציטים ¹ . דינמיקה זרימת כדורית הדם החשמלית חשובים לחקר זרימת הדם ביעילות מטבולית ברשתית, ואת הדינמיקה זרימת לויקוציטים, להבנת נדידת תאים, הכרה, הדבקה והרס בתנאים דלקתיים שונים ² . ישנן מספר מולקולות ניאון המשמשים זיהוי ואפיון של סוגי תאים שונים ³ . המודינמיקה של תאי ה....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקולים של בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת SingHealth, סינגפור והם בהתאם להנחיות של האגודה לחקר חזון ורפואת עיניים (ARVO) הצהרה לשימוש בבעלי חיים עיניים או חזון מחקר.

1. תיוג של Erythrocytes ו leukocytes עם צבעים ניאון

הכנה של ריאגנטים
1. הכן ICG (1.5 מ"ג / מ"ל) על ידי המסת 3 מ"ג ICG ב 1800 μL של מים מזוקקים מעוקרים. הוסף 200 μL של 10x פוספט ש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erythrocytes שכותרתו עם ICG 1.5% היו דמיינו את זרימת הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). הן 1% ו 5% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים היו להבדיל במחזור הרשתית. עם זאת, אדם שכותרתו תאים היו בבירור יותר דמיינו עם 1% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים ( איור 1 ). ב 5% hematocrit, בשל המספר הגדול של תאים שכותרתו בכלי הרשתית, לא ניתן היה לסמן את התא הפרט. כמה אריתרוסטזיס נצפתה באזור peripapillary בשני התנ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לימוד המודינמיקה במחזור הרשתית והקורואידאל חיוני להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים רבות. זרימת הדם הדינמיקה במחזור הרשתית ניתן ללמוד על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום פורייה (FD-OCT), לייזר speckle flowgraphy (LSFG) ו oximetry רשתית. למרות ששיטות אלה משתמשות בגישות שונות כדי לחקור את זרימת הדם הכוללת במחזור הרשתית ⁴⁰ ^, ⁴¹ ^, ⁴² ^, ⁴³ ^,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות. ללא ניגוד עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט המחקר מומן על-ידי מענק מחקר חדש מטעם המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC), סינגפור. הצוות יאהה להכיר את ההכשרה המחקרית שניתנה לד"ר אגרוול במכון לרפואת עיניים (IoO), אוניברסיטת קולג 'בלונדון (UCL), במסגרת המחקר הלאומי של המועצה למחקר רפואי (NMRC), מחודש נובמבר 2012 ועד אוקטובר 2014, בהנחיית פרופ' דוד שימה. ד"ר אגרואל רכש את הקונספט ואת הכישורים לתיוג התאים והדמיה חיה במעבדה של ד"ר שימא. לכן, הצוות יכיר בהדרכה ובהדרכה במהלך הדרכתו של פרופ 'דוד שימה, פרופ' קית 'מייסנר, ד"ר פיטר לונד וד"ר דאיו איוואטה.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
צבע פולימתין קרדיוגרין (ירוק אינדוציאנין)	סיגמא אולדריץ'	12633-50 מ"ג
פלואורסצאין 100 מ"ג/מ"ל	נוברטיס	U1705A/H-1330292
10x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) אולטרה טהור דרגה	1 בסיס	BUF-2040-10X1L
אלבומין סרום בקר	סיגמא אולדריץ'	A7906-100G
צינורות מיקרוטיינר עם K2E (K2EDTA) - ריכוז EDTA - 1.8 מ"ג/מ"ל דם	BD, USA	REF
תמיסת Histopaque 1077 Sigma	Aldrich	10771
צנטריפוגה 5810 R	Eppendorf	05-413-401
צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל	Axygen	MCT-200-C-S
	Insta BioAnalytik pte. בע"מ	FINE VORTEX
חממת שייקר	Lab Tech
Ceva הזרקת קטמין (קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל)	Ceva	KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (קסילזין הידרוכלוריד 20 מ"ג/מ"ל)Troy	Laboratories PTY. Limited	LI0605
1% Mydriacyl 15 מ"ל (טרופיקמיד 1%)	אלקון מעבדות בע"מ ארה"ב	NDC 0998-0355-15
2.5% מידפרין 5 מ"ל (פנילפרין הידרוכלוריד 2.5%)	אלקון מעבדות בע"מ ארה"ב	NDC 0998-0342-05
מזרק Terumo עם מחט 1 סמ"ק/מ"ל Tuberculin	Terumo (Philippenes) Corporation, הפיליפינים	SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, ברלין, גרמניה
ספוגיות אלכוהול	Assure חד פעמי רפואי	7M-004-L-01
מערכת אנגיוגרפיה לסריקת לייזר קונפוקלית (היידלברג רטינה אנגיוגרף 2)	היידלברג הנדסה, GmbH, היידלברג, גרמניה
תוכנת מודול הצפייה Hiedelberg Spectralis, v4.0	Heidelberg Engineering, GmbH, היידלברג, גרמניה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	ZEISS	דגם: axio imager z1

365974 מערבל מערבולת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Khoobehi, B., Peyman, G. A. Fluorescent vesicle system. A new technique for measuring blood flow in the retina. Ophthalmology. 101 (10), 1716-1726 (1994).
Beem, E., Segal, M. S. Evaluation of stability and sensitivity of cell fluorescent lab....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles