מאמר שיטה

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

DOI:

10.3791/55501

⸱

24 במאי 2017

 ,  , 
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, המחקר של גישות שונות לזיהוי נגעי DNA באמצעות הדמיית AFM של מולקולה בודדת מודגם עם מערכת תיקון כריתת נוקלאוטידים כדוגמה. מתוארים ההליכים של הכנת דגימות DNA וחלבון ופרטים ניסיוניים כמו גם אנליטיים עבור ניסויי AFM.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיית AFM היא טכניקה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון-DNA. שיטת מולקולה בודדת זו מאפשרת רזולוציה בו זמנית של מולקולות ומכלולים מולקולריים שונים בדגימה הטרוגנית. בהקשר הספציפי של מערכות חלבון המקיימות אינטראקציה עם DNA, ניתן להבחין בצורות שונות של קומפלקס חלבונים ומיקומי הקישור המתאימים שלהן באתרי יעד המכילים שברי DNA. כאן, מוצג יישום של AFM לחקר זיהוי נגעי DNA במערכות תיקון DNA של כריתת נוקלאוטידים פרוקריוטית ואאוקריוטית (NER). מתוארים ההליכים של הכנת דגימות DNA וחלבון וניתנים פרטים ניסיוניים כמו גם אנליטיים של הניסויים. הנתונים מאפשרים מסקנות חשובות לגבי האסטרטגיות שבאמצעותן ניתן להשיג אימות אתר יעד על ידי חלבוני ה-NER. מעניין לציין שהם מצביעים על גישות שונות לזיהוי וזיהוי נגעים עבור מערכת ה-NER האיקריוטית, בהתאם לסוג הנגע. יתר על כן, תכונות מבניות מובהקות של שני ההליקזים השונים המעורבים ב-NER פרוקריוטי ואאוקריוטי מביאות ומסבירות את האסטרטגיות השונות שנצפו עבור שתי מערכות אלה. חשוב לציין, ניתן ליישם גישות ניסיוניות ואנליטיות אלה לא רק לחקר תיקון ה-DNA, אלא גם באופן דומה מאוד למערכות חלבון אחרות הפועלות באינטראקציה עם DNA כגון אלה המעורבות בתהליכי שכפול או שעתוק.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה רבת עוצמה לניתוח אינטראקציות DNA-חלבון 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . זה דורש רק כמויות נמוכות של חומר המדגם ישירות לדמיין דוגמאות הטרוגניות עם רזולוציה ברמת מולקולה אחת. ההטרוגניות יכולה לנבוע ממצבים קונפורמיים או אוליגומריים שונים של חלבון. בפרט, בהקשר של דגימות DNA חלבון, מתחמי חלבון יכול להציג stoichiometries שונים ו / או קונפורמיות המושרה על ידי DNA מחייב בכלל או מחייב לאתר יעד מסוים בתוך DNA. דגימות הטרוגניות עשויות להכיל גם שני סוגי חלבונים שונים (או יותר), וחלבונים שונים( למשל , המורכבת מסוג אחד בלבד של חלבון לעומת קומפלקסים heteromeric) עשויים לתקשר באופן שונה עם DNA. מחקרים שנדונו כאן לנצל AFM הדמיה באוויר על דגימות סטטי, מיובש של חלבונים לתקן דנ"א כרוך ארוך (~ 900 זוגות, bp) שברי DNA המכילים נגע, המייצג יעד של חלבונים אלה. רזולוציה גבוהה, מולקולרית של AFM מאפשר את ההבחנה בין סוגים שונים של קומפלקסים חלבונים כדי לקבוע את עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ"א. חשוב לציין, נגעים הם הציגו לתוך מצעים דנ"א בעמדות מוגדרים היטב. מכיוון שמיקומו של אתר הנגע בדנ"א ידוע, התפלגות החלבונים הכרוכים בדנ"א מספקת תובנה למאפייני ההזיה השונים (השונים) של מכלולי החלבון (השונים), למשל , עד כמה הם מזהים סוג מסוים של נגע (בהשוואה כדי DNA פגום) 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . עמדותיהם על הדנ"א גם מאפשרות את ההבחנה בין מתחמי חלבון הקשורים ספציפית לנגעים ולמתחמים שאינם קשורים באופן ספציפי למקום אחר בדנ"א. אפיון נפרד של סוגים מורכבים אלה שונים (מתחמים קשורה במיוחד הנגע לעומת קומפלקסים שאינם ספציפיים) יכול לחשוף שינויים קונפורמציה פוטנציאליים במתחמים הנגרמת על זיהוי האתר היעד.

חלבונים התיקון DNA התמקדו כאן הם helicases כי הם אחראים להכרה נגע תיקון נוקליאוטיד תיקון כריתה (NER) מסלול. בחיידקים, NER מושגת על ידי חלבונים UvrA, UvrB, ו UvrC. UvrA אחראי על חישה ראשונית של הנגע במכלול UvaA 2 / UvrB 2 . עם אימות הנגע על ידי UvrB זה מורכב ממיר מונומריק UvrB כבול באתר הנגע זה מורכבים ספציפיים יכולים ואז לגייס את pNR. UvrC מכסה טווח קצר (12-13 nt) של DNA בודד תקוע (ssDNA) המכיל את הנגע. החסר החסר הוא מילא לאחר מכן על ידי פולימראז DNA. לבסוף, ה- DNA ligase חותמת את המסור החדש מסונתז עם המקורי DNA 9 , 10 . ב eukaryotes, רוב החלבונים של מפל NER הם חלק גדול, multimeric גורם שעתוק II H (TFIIH) מורכבת. לאחר הנגע הראשונית חישה באמצעות trimeric CEN2-XPC-HR23B מורכבים, TFIIH הוא גויס לאתר היעד DNA. כאשר XPD בתוך המתחם מאמת את נוכחותו של נגע מטרה NER, האנדוקלאס NER האיקריאטי NG ו XPF הם גויסו לבלו קצר (24-32 nt) מתיחה של ssDNA המכיל את הנגע 9 , 10 . כאן, במיוחד, את helicases UvrB ו XPD מ prokaryotic ו eukaryotic NER, בהתאמה, נחקרו. אלה helicases דורשים unaired באזורDNA (בועת דנ"א) על חוט אחד של שני גדילי דנ"א יחיד ולאחר מכן לתרגם לאורך זה גדיל מונעת על ידי הידרוליזה ATP. בנוסף נגעים דנ"א, בועה דנ"א היה ולכן הציג את המצעים המתפקדים כמו טעינת האתר עבור החלבונים.

ההליך להכנת מצע DNA ספציפי מצעים תוארה בעבר 11 . זה דורש מבנה דנ"א עגול (פלסמיד) עם שני אתרי הגבלה מקרוב מרווחים עבור nickase. בהקשר של מחקר זה, נעשה שימוש ב- pUC19N (2729 bp) פלסמיד (שנוצר על ידי המעבדה של ס 'וילסון, NIEHS). זה פלסמיד מכיל שלושה אתרי הגבלה מקרוב עבור ntase Nbase כי מסגרת 48 נוקלאוטיד (nt) למתוח. לאחר הדגירה עם nickase, את המתיחה של ssDNA בין האתרים האלה ניתן להסיר והוחלף על ידי oligonucleotide המכיל כל תכונה היעד. לאחר כל צעד, עיכול אנזימטי מלא נבדק באמצעות ג'ל agaroseאלקטרופורזה. DNA מעוגל DNA ניתן להבחין בשל הניידות האלקטרופורטית נמוכה יותר לעומת פלסמיד המקורי supercoiled. Gapping של הדנ"א והחלפת מתיחה להסיר על ידי oligonucleotide המצע הספציפיים ניתן להעריך באמצעות עיכול עם אנזים הגבלה אשר חותך את המצע באופן בלעדי באזור בין nicks. לינאריזציה של פלסמיד מעגלי על ידי האנזים ולכן יהיה מדוכא עבור ה- DNA gapped ומשוחזר לאחר החדרת oligonucleotide ספציפיים. לבסוף, שני אתרי הגבלת endonuclease (אידיאלי חותכי יחיד) לאפשר את הדור של מצע דנ"א ליניארי, עם אורך כנדרש ועם אתר היעד הספציפי במיקום מוגדר, כמו גם בועת דנ"א במרחק מן הנגע או 5 'או' 3 '.

הכרה של lesions על ידי nlic helicases ניתן לחקור באמצעות הדמיה AFM. טרנספוקציה דנ"א נתקע של helicases ב tהוא אתר lesion גלוי כמו שיא בחלבון הפצה מיקום על הדנ"א ומצביע על זיהוי הנגע. מאחר שהטרנספוקציה של דנ"א של הליקזים אלה היא גם כיוונית, עם קוטביות של 5'עד 3, התלות של זיהוי הנגע על המיקום של אתר הטעינה (בועת ה- DNA במעלה הזרם או במורד הזרם מן הנגע) גם מציינת אם הנגע מוכר באופן מועדף על transocated או על ההפך, לא transocated ssDNA strand 5 , 9 . בסעיפים הבאים, השיטות שיושמו יובאו, וממצאים מרכזיים מניסויים אלה יידונו בקצרה. חשוב לציין, מקביל לעבודה המופתית על תיקון דנ"א המוצג כאן, הדמיה AFM ניתן ליישם את המחקר של מערכות שונות אינטראקציה DNA, כגון שכפול דנ"א או שעתוק 8 , 12 , 13 , 14

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה לדוגמא

  1. הכנת מצעי דנ"א 11
    1. יצירת פער ssDNA פלסמיד
      1. לעכל לחלוטין מדגם של פלסמיד (כאן: שונה pUC19, pUC19N) בצינור תגובה עם nickase מתאים (כאן: Nt.BstNBI) ואחריו איזון חום אנזים, תוך שימוש בתנאים על פי פרוטוקול של היצרן (ראה איור 1 עבור סכמטי הַצָגָה). התחל עם ~ 50 μL ~ ~ 500 ננומטר פלסמיד לתשואה מספקת.
      2. ודא ninks פלסמיד על ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל על דגימות מדולל (~ 20 ננומטר) 15 . ללבוש כפפות להגנה מפני צבע דנה מחייב המשמש להדמיה DNA.
        הערה: מובילים electrophoretic שונים מאפשרים הבחנה בין דנ"א (נינוח) ו supercoiled מעגלית פלסמיד ( איור 1 ).
      3. הסר את למתוח ssDNA למתוח (בין אתרי ניק) מן הפלסמיד על ידיהדגירה עם עודף 10 ~ של oligonucleotide משלימים (oligonucleotide 1 בטבלה 1 ), רועד בסל"ד 300 במשך 30 דקות ליד טמפרטורת ההיתוך של oligonucleotide (כאן: 68 מעלות צלזיוס עבור pUC19N) בבלוק חום ( איור 1 ).
      4. להפריד את פלסמיד gapped מ שברי DNA קטנים יותר באמצעות 50 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) מסנן על ידי צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 10,000 xg בצנטריפוגה שולחן ( איור 1 ). כדי לחלץ את ה- DNA מרוכז מן המסנן, להפוך את המסנן ולהכניס לתוך צינור תגובה 1.5 מ"ל חדש. צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 1,000 x גרם.
      5. מילוי הדגימה וכתוצאה מכך דנ"א מרוכז μL 500 עם מים מסוננים deionized, להוסיף עוד פי 5 ~ עודף של oligonucleotide משלים וחוזר על צעדים 1.1.1.3 ו 1.1.1.4 לפחות 3 פעמים.
      6. מבחן עבור gapping מלא של ה- DNA על ידי הדגירה עם אנזים הגבלה מתאים (כאן: Xhoi או BglII) באמצעות conditiעל פי תיאור היצרן. השתמש מדולל דגימות DNA מדולל (nicked לעומת gapped) (~ 20 ננומטר). הפעל ג'ל אלקטרופורזה agarose להבחין בין פלסמיד לינארי (המכיל שום פער ssDNA) ו- DNA לא חרוטים (דנ"א gapped) באמצעות דנ"א nicked כמו שליטה חיובית (כולל סולם DNA עבור התייחסות, איור 1 ). לובש כפפות.
    2. מילוי הפער עם oligonucleotides ssDNA שונה
      1. אנאל את gasm פלסמיד באמצעות הדגירה עם עודף פי 25 ~ של 5 'phosphorylated oligonlotide המכיל את אתר היעד הספציפי (S) של בחירה, דוגרים על ~ 45 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות ( איור 1 ). כאן, השתמש 48 nt ssDNA המכיל נגע, או thymine פלואורסצין adymed או דיקלר cyclobutane pyrimidine (CPD), ובנוסף רצף קצר (8 nt) לא משלימים לייצר בועות DNA (ראה טבלה 1 ).
      2. Covalently קישור את annealed להוסיף פלסמיד על ידי incubaTion עם ליגז DNA T4 לילה בטמפרטורת החדר על פי פרוטוקול של היצרן ( איור 1 ). עבור תגובה זו, להוסיף ATP המכיל מרוכז מאגר מאגר פתרון לייצר תנאים מתאימים חיץ עבור ligase ( למשל , להשתמש במאגר התגובה UvrB: 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 10 מ"מ MgCl 2 , 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ DTT, 1 מ"מ ATP).
      3. בדיקה עבור ההכנסה של oligonucleotide ספציפיים לתוך פלסמיד gapped על ידי עיכול של דגימות מדולל עם אנזים הגבלה מתאים (כמו ב 1.1.1.6) על פי פרוטוקול של היצרן ואחריו ג'ל אלקטרופורזה agarose (כמו 1.1.1.6, איור 1 ).
    3. הכנת מצע דנ"א לינארי
      1. לעכל את ה- DNA פלסמיד שונה עם אנזימים הגבלה (באופן אידיאלי עם אתר הגבלה אחת הפלסמיד) שימוש בתנאים המומלצים על ידי היצרן ( איור 1 ). שלב זה מייצר שברי ליניארי מכיליםIng את השינוי שהוכנס במיקום מוגדר. כאן, השתמש SspI ו BspQI חיתוך במיקומים 613 ו 255 bp במעלה ומורד במורד של הכנס, בהתאמה, וכתוצאה מכך 916 קטע ה- DNA bp המכיל את אתר הנגע ספציפי ב ~ 30% אורך ה- DNA.
        הערה: עבור ניסויים הדמיה AFM כמתואר כאן, שברי דנ"א עם אורכים בין ~ 200 bp ~ 2000 bp הם מצעים מתאימים.
      2. לבודד את החלק המטרה באמצעות agarose ג'ל אלקטרופורזה מיצוי ג'ל באמצעות ערכת מסחרי. ללבוש כפפות להגנה.
      3. לחלופין, לחתוך ג'ל agarose עם אזמל להפריד את סולם ה- DNA ו נתיבים מדולל מדולל (שני נתיבים הראשונים) מן הנתיבים המכילים את ה- DNA מרוכז להיות מטוהרים. רק לחשוף את החלק ג'ל עם שני נתיבים הראשונים לקרינה UV על ידי הנחת רק חלק זה של ג 'ל על שולחן UV.
        1. חותכים את הלהקה המתאימה לשבר של בחירה עם אזמל. מחדש לאחד את שני חלקים ג'ל (את הכרטיסייה UVLe). השתמש את המיקום של הלהקה הוסר מן המדגם לדלל ככוונה למיקום של הלהקה של המצע הדנ"א הרצוי. חשבון עבור ריכוז גבוה יותר על ידי חיתוך פרוסות רחב מעט יותר עבור שליטה לדלל.
          הערה: מכיוון שכאן נחקרה ההכרה בנגעים UV, הכנסת נגעים נוספים באמצעות קרינת UV נמנעה בקפדנות במצע הדנ"א על ​​ידי גישה זו.
      4. לחשב את ריכוז ה- DNA C מן הקליטה ב 260 ננומטר נמדד על ידי ספקטרופוטומטר UV-Vis באמצעות חוק למברט-באר עם דנ"א תקועים כפול (dsDNA) מקדם טוחנת הממוצע מקדם של ε 260nm ~ 6,700 M - 1 ס"מ - 1 לכל bp:
        figure-protocol-1
        שבו L הוא אורך הנתיב (אורך החדר מדידה, בדרך כלל 1 ס"מ).
  2. ביטוי וטיהור של חלבונים
    1. רקומביננטי להביע UvrB ב E. coli ו לטהר את החלבון באמצעות זיקה חרוז סטנדרטי chitin 15 ואת גודל כרומטוגרפיה הדרה 15 כפי שתואר לעיל 16 .
      הערה: הגן uvrB מ Bacillus caldotenax היה משובטים לתוך וקטור pTYB1.
    2. אקספרס XPD ב E. coli ו לטהר את החלבון באמצעות תקן ניקל זיקה IDA 15 ו כרומטוגרפיה הדרה גודל 15 ואחריו חילופי אניון כרומטוגרפיה 15 , כפי שתואר לעיל 17 .
      הערה: הגן עבור chetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum קבוצת D חלבון (XPD) היה משובטים לתוך וקטור pBADM11. ג תרמופילום p44 היה מתנה מתנה מן המעבדה של קרוליין Kisker, הביע ו puriFied כמתואר 17 .

2. ניסוי AFM

  1. הכנת דוגמאות
    1. לחלופין, מראש דגירה המצע דנ"א ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות בבלוק חום להסיר גבישים פוטנציאליים מלח מיקרו שאולי יצרו במהלך האחסון במקרר.
    2. הכן חיץ התגובה (ים) בריכוז 10 פי (מאגרים 10x).
      הערה: חיץ התגובה XPD בריכוז 1x הכיל 20 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 10 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2 , 1 מ"מ TCEP, 2 מ"מ ATP; 1x UvrB למאגר התגובה הכיל 50 מ"מ טריס HCl pH 7.5, 50 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2 , 5 מ"מ DTT, ו 1 מ"מ ATP.
    3. טרום דגירה חלבונים בריכוז גבוה יותר בתנאים הדגירה מתאים כדי לשפר את היווצרות מורכבת. טרום לדלל נפח קטן ( למשל , 1 μL) של חלבונים בודדים במאגר התגובה 1x חלבון לריכוז הרצוי לערב כמויות קטנות ( למשל , 1 μL) של tהוא פתרונות חלבון בודדים בצינור תגובה 0.5 מ"ל.
      1. מניחים את הצינור בבלוק חום עבור הדגירה בטמפרטורות גבוהות יותר בטמפרטורת החדר. בחר יחס ריכוז בהתאם stoichiometry מורכבים צפוי, או equimolar או ריכוזים המתאימים. הנה, דגירה 1 XPL μL (20 מיקרומטר במאגר התגובה x 1 xD) ו 1 μL p44 (20 מיקרומטר במאגר תגובה 1x XPD) ב 10 מיקרומטר כל 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. דגירה דגימות חלבון מתאים ריכוזי ה- DNA במאגר התגובה חלבון בצינור תגובה 0.5 מ"ל. הנה, להשתמש 500 ננומטר UvrB או 1 מיקרומטר XPD + 1 מיקרומטר p44 ו 100 ננו-דנ"א. פיפטה כרכים קטנים כדי לשמור חומר, למשל , 0.25-0.5 חלבון μL (מראש בדילול לריכוז הדגירה 10 פי) ו DNA בנפח כולל של 2.5-5 μL של חיץ התגובה 1x חלבון. הנה, דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בבלוק חום. ספין למטה בצינור תגובה לזמן קצר (~ 1 s) בצנטריפוגה השולחןדואר כדי להבטיח ערבוב של כרכים קטנים.
  2. דוגמה בתצהיר
    1. הכן מצע נציץ: לחתוך בערך 1 x 1 ס"מ 2 חתיכת נציץ מ רצועות גדול באמצעות אזמל. הפרד את השכבות העליונות של חתיכת המינרלים הרב שכבתית באמצעות סרט דבק כדי לחשוף משטח נקי, שטוח, אטומי חלקה המצע.
      הערה: חתיכת נציץ ניתן להשתמש מחדש עבור ניסויים מרובים על ידי הפשטת את השכבה נוספת (ים).
    2. הכן את מאגר חיץ AFM עם מים מסוננים deionized, למשל , 25 מ"מ HEPES pH 7.5, 25 מ"מ Na- אצטט, 10 מ"מ Mg- אצטט. סינון דרך מסנן 0.02 מיקרומטר מזרק.
      הערה: קטיונים Divalent במאגר בתצהיר לשמש chelate של מולקולות DNA טעונה שלילית על פני נציץ, אשר גם הוא טעונה שלילית ב pH ניטרלי. אם גבוה יחסית Mg 2 + יון ריכוז במאגר בתצהיר מציב בעיה עבור מערכת חלבון DNA מסוים, לחילופין,משטח פני השטח יכול להיות טעון מראש עם קבוצות אמינו באמצעות כימיה מבוסס סילאטרן לספק חיובי משטח חיובי עבור עיגון 18 . התצהיר המדגם יכול להתבצע במאגר המכיל לא רק כמויות נמוכות של קטיונים divalent.
    3. מדולל את המדגם (ראה 2.1) עבור בתצהיר מיידי על נציץ במאגר בתצהיר. הפקדה נפח קטן (כאן: 20 μL).
      הערה: גורמי דילול תלויים בריכוז המדגם. הנה, לדלל דגימות 50-100x. ככלל אצבע, ~ 1 nm DNA תוצאות כיסוי משטח טוב ~ 1000 bp.
    4. מיד לשטוף מדגם שלוש עד ארבע פעמים עם כמה מיליליטר של מים מסוננים, deionized, כתם נוזלי עודף, מכה יבש בזרם עדין של חנקן. התהליך כולו מן בתצהיר מדגם דגימות יבשים יכול להתבצע בתוך פחות מ -30 s.
    5. תקן את פיסת נציץ על שקופית מיקרוסקופ באמצעות סרט דבק על הקצוות שלה.
      הערה: למערכות AFM שונות יש דדרישות שונות עבור תיקון המדגם לשלב. אחר AFMs יש שלבים מגנטיים, ואת חתיכות נציץ קבועים על דיסקים מגנטיים, למשל , באמצעות דבק תרמי. פרטים על מערכת AFM בשימוש כאן ניתן למצוא בטבלה של חומרים.
  3. AFM הדמיה
    1. מניחים את המדגם (ראה 2.2.5) מרכזי על שלב AFM ולתקן את השקופית מיקרוסקופ על הבמה עם רפידות מגנטיות.
    2. הכנס את קצה ה- AFM למחזיק קצה. השתמש cantilevers עם חדה (<10 ננומטר) AFM בדיקה מתאים תנודות, מתנדנד מצב הדמיה מצב באוויר. השתמש בדיקות AFM, למשל, כפי שמופיע בטבלה של חומרים . כאן (תלוי AFM), לתקן את קצה מחזיק תחת מהדק ידי הידוק בורג מהדק (אצבע חזק). הכנס את קצה קצה לתוך ראש המדידה AFM. הניחו את הראש על הגב עבור שלב זה.
    3. מניחים את ראש המדידה AFM על גבי המדגם. פרטים תלויים במודל AFM. הנה, מאקה בטוח הראש עומד ביציבות עם הרגליים שלה בתוך החריצים הבמה. ודא כי נציץ ממוקם על הבמה שבה קצה AFM ירחף מעל זה. ברגים מיקרומטר בצד ימין של הבמה לאפשר מיקום בסדר של המדגם.
    4. יישר את הלייזר AFM בצד האחורי של שלוחה עבור כוח האות אופטימלי מן photodetector רגיש המיקום שעליו הלייזר משתקף. פרטים תלויים במודל AFM.
      1. הנה, להפוך את הגלגלים בצד ימין ובחלק האחורי של ראש המדידה AFM להתאים את x ו- y עמדות של לייזר AFM לכוון אותו מרכזי על קצה שלוחה. צפה באיתות ההשתקפות בחלון הווידאו AFM (אם זמין, כאן: לחץ על סמל המצלמה ובחר קלט: Svideo).
      2. לאחר מיקומו בגסות, לייעל את סכום גלאי סכום (סכום ב סכום ו סטיה חלון Meter ב AFM תוכנה) על ידי כוונון עדין של מיקום לייזר עם שני גלגלים (להישאר בסוף שלוחה, סכום signaאני תלוי AFM ו סוג שלוחה, כאן: המטרה עבור סכום 5).
    5. אפס את אות ההבדל מהדיודות העליונות והתחתונות של מערך הגלאי (כאן: אות הטיה בחלון סכום וסטייה) על ידי הפניית השתקפות הלייזר AFM אל מרכז הגלאי (כאן: סובב את הגלגל בצד שמאל של המדידה AFM רֹאשׁ).
      הערה: סטיות מאפס מציינות את סטייה של שלוחה עקב אינטראקציות פני השטח, אשר מתורגמים למידע גובה על ידי AFM.
    6. קביעת תדר תהודה שלוחה על ידי תדר המנגינה מיושם לתוך תוכנת AFM (כאן: מנגינה אוטומטי הפקודה בלוח הורים / חלון Tune). בחר משרעת המתאימה 1 V קלט עבור piezo המניע את תנודה שלוחה. הגדר את התנודה תנודה מעט (5%) נמוך יותר בתדר תהודה ואפס את השלב של תנודה.
    7. גישה קצה למשטח המדגם באמצעות mod לעסוק גולמיE (כאן: פקודה Engage בחלון לוח מאסטר) עד להגדרת המגן (נקודת הצבע). השתמש ~ 2% חיתוך של משרעת תנודה ברמה חופשית כמו נקודת נקודת (כאן, הזן נקודת מוגדר 980 mV בלוח הראשי).
    8. עדיף לעסוק קצה AFM עם משטח המדגם על ידי הפחתת נקודת להגדיר באמצעות תוכנת AFM. לכוון הדמיה מצב דוחה עם שלב תנודה שלוחה (שלב סכום ו סטיה חלון Meter) ממש מתחת לשלב שלב חופשי (לפני לעסוק, כאן בדרך כלל ~ 70). כאן, השתמש טיפוסי סופי להגדיר נקודות על סדר של 70-80% של משרעת ברמה חופשית (1 V).
    9. לפני הסריקה, בחרו את האותות להקלטה בלוח הערוץ הראשי. בחר גובה (Ht) ומשרעת (Am).
    10. התחל סריקת מדגם (כאן: פקודה האם סרוק בחלון לוח ראשי). השתמש מהירות סריקה של למשל, 2.5 מיקרומטר / s (הפקודה מהירות סריקה בלוח הורים) על פני השטח התמונה של 4 מיקרומטר x 4 מיקרומטר או 8 מיקרומטר x 8 מיקרומטר (הזן גודל סריקה בחלונית מאסטרL) עם רזולוציות פיקסל של 2,048 או 4,096 (נקודות סריקה וקווי סריקה בלוח הראשי), בהתאמה.
    11. שמור את קובץ התמונה (פקודה שמור תמונה בלוח מאסטר) ללא שינויים מתאימים (בחר אין בלוח ערוץ ראשי / שמור מטוס Fit).
    12. לניתוח נוסף, לעבד את התמונה שנשמרה. טען את התמונה (פקודה עיין בנתונים שמורים בתפריט AFM Analysis). פתח את לוח השינוי (לחץ על M בחלק העליון של התמונה). להחיל planfit ב x ​​ו- y ממדי לתמונה גובה (הרחבה HtR) (פקודה XY בחלון Planefit ב שינוי לוח, בחר Planefit צו 3). ואז לשטח את התמונה (פקודה לשטח בחלון שטוח ב שינוי לוח) בחירה שטוח 3.
    13. לייצא את התמונה כקובץ TIFF (לחץ על פקודות בחלק העליון של התמונה, בחר TIFF ייצוא 2x המקביל ל -2,048 פיקסלים ברזולוציה) לניתוח נוסף.

3. ניתוח AFM

  1. נפח מורכב של חלבון
    1. מִרֹאשׁ-בחר מתחמי DNA רלוונטיים- DNA על ידי בדיקה חזותית ישירה של התמונות בתוכנה AFM, באמצעות ערכת צבעים מתאימה כדי למקסם הופעות שונות של קומפלקסים בגודל שונה (ראה צבעים שונים וגדלים של קומפלקסים שונים באיור 2 , כאן: ערכת צבעים SeaLandAndFire ב את AFMsoftware). עבור דגימות XPD, מכלולים אפשריים כללו XPD / p44-DNA, כמו גם XPD-DNA ו- p44-DNA, בגדלים שונים במובהק בשל המסה המולקולרית הגדולה והשונה של XPD (~ 95 kDa) ו- p44 (~ 40 kDa) .
    2. מדוד כרכים של פסגות חלבון בודדות על הדנ"א כדי לאמת את הסוג המורכב. זה יכול להיות מושגת עם תוכנות תמונה שונות (כאן: כלי סעיף של תוכנת AFM).
      1. למדוד את גובה (ח) וקוטר (ד) של קטעי חלבון שיא עם סמנים חלון סעיף. מדוד את הקוטר קרוב לבסיס החלק החלקיקים.
      2. לקבוע את נפח (V) של אפונהKs באמצעות מודלים מתמטיים פשוטים, למשל , תוך שימוש בנוסחה הבאה, המבוססת על מודל כדורי כדורי:
        figure-protocol-2
    3. תרגם את הכרכים הנמדדים למסה מולקולארית של חלבון.
      1. בתחילה, לכייל את מערכת AFM עבור נפח כדי משקל מולקולרי (MW) המרה באמצעות מגוון של חלבונים עם משקל מולקולרי ידוע (כאן: סך של 12 ניסויים עם בין 25 ו 851 נקודות נתונים כל נערכו על 5 חלבונים שונים monomeric, dimeric , Trimeric, או מדינות tetrameric) 4 , 19 , 20 . חלבונים ופיקדונות תמונה (כמתואר לעיל, ב 2.2 ו 2.3) ולמדוד כרכים שלהם כמתואר לעיל (3.1.2). תכנן את הכרכים על משקלם המולקולרי הידוע. התרשים המתקבל יציג קשר לינארי בין V לבין MW, המשוואה אשר ניתן להשיג על ידישורה המתאימה לנתונים. עבור מערכת AFM בשימוש כאן, הקשר הבא התקבל 19 :
        figure-protocol-3
        הערה: שלב זה אינו חייב לחזור על עצמו לפני כל מדידה, אך נעשה רק פעם אחת. נפח לכיול MW ניתן להחיל על תמונות שהושגו בתנאי הדמיה דומים באמצעות בדיקות AFM עם קטרים ​​משתנים מעט.
      2. בהתבסס על הכמויות הנמדדות (3.1.2) והכיול של V-to-MW (3.1.3.1), קובעים את MW המשוער של מכלולי החלבון 20 , המספק מידע על התוכן המולקולרי שלו. לדוגמה , עבור דגימות XPD / p44, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa ו ~ 140 kDa התקבלו, בהתאם למתחמי p44-DNA (או פסגות שנגרמו על ידי מבנה דנ"א בלבד), פסגות XPD בלבד, ו- XPD / p44 paks, בהתאמה .
  2. חלבונים מורכבים על דנ"א
    1. קבעו את ה- DNAאורך אור.
      1. עקוב אחר שברי ה- DNA בתמונות AFM, למשל , עם פונקציה הקו freehand של תוכנת ניתוח תמונה מתאים (ראה למשל טבלה של חומרים) ולמדוד את אורך הקו.
        הערה: לא לכלול אגרגטים דנ"א, כמו גם שברי לחתוך על ידי שולי התמונה.
      2. סל ולחתוך את אורך דנ"א מן הניסוי כולו בהיסטוגרמה, תוך שימוש בנתונים מתאימים ניתוח וגרפים תוכנה ( למשל , ראה טבלה של חומרים ).
      3. להתאים את הפצות אורך עם עקומת גאוס בניתוח נתונים תוכנת גרפים כדי לקבוע את אורך שברי ה- DNA. על מנת לדעת את המיקום של אתר היעד של ה- DNA (ראה 1.1), יש לכלול רק שברי דנ"א באורך הנכון בתוך שתי סטיות תקן ממרכז עקומת גאוס (y = y 0 + z exp (-2 (xx c ) 2 / w 2 ), כאשר z הוא גורם נורמלי ו- x c ו- w הם המרכזרוחב מקסימלי מלא למחצה של הגאוסי) בניתוחים נוספים.
        הערה: אורך ה- DNA במרכז עקומת גאוס חייב להיות קרוב לאורך התיאורטי של קטע ה- DNA (מחושב באמצעות 0.34 ננומטר / BP). אורכים של עד 10% קצרים יותר מהערך התיאורטי אופייניים ונגרמים ככל הנראה על ידי מגבלות רזולוציה של AFM.
    2. קביעת עמדות של פסגות חלבון על מצע DNA.
      1. למדוד את המרחק של פסגות חלבון מקצה הדנ"א קרוב יותר, כפי שמתואר 3.2.1.1 ולחלק את אורך הדנ"א הכולל כדי להשיג מרחקים ביחידות של שברי אורך DNA.
      2. סל וחתך את המרחקים נמדד היסטוגרמה באמצעות ניתוח נתונים מתאים תוכנת גרפים (ראה למשל , איור 3 ). ככלל אצבע, בחר גודל סל אשר נותן כ √n פחי עבור n נקודות נתונים.
        הערה: מאז מסתיימת DNA לא ניתן להבחין כאן, העלילה רק לשבריר של אורך 0.5 DNA (מרכז של שבב DNAמנט). מכיוון שהחיבור הסופי של הדנ"א אינו מוקד המחקר, אל תכלול קצוות דנ"א מהניתוחים על ידי התחלת סל נתוני המיקום במקצת לאחר המיקום 0 ( למשל : binning מקטע של דנ"א באורך 0.02).
    3. לקבוע את סגוליות האתר היעד החל חלבונים מיקום הפצות מורכבות.
      1. התאימו את המקסימום (מופעים מחברים משופרים) בהתפלגות המיקום עם עקומת גאוס כמו 3.2.1.3 אבל footed על גובה של מחייב רקע (ראה איור 3 ).
      2. לחשב את הספציפיות S עבור האתר הספציפי לעומת רקע DNA ספציפי (מולקולות חלבון קשורות לא ספציפי DNA אתרים) עם הנוסחה הבאה 21
        figure-protocol-4
        A sp : מספר מתחמים ספציפיים (אזור תחת עקומה גאוס)
        A nsp : מספר קומפלקסים לא ספציפיים (אזור של הרקע, 0 ); השבר של אורך ה- DNA מכוסה כאן הוא 0.48 עבור היסטוגרמה החל באורך 0.02 DNA)
        N: מספר אתרי DNA אפשריים מחייב (כאן: N = 914 למעט קצוות DNA)
  3. זווית לכופף זוויות
    1. באמצעות כלי זווית בתוכנה ניתוח תמונה מתאים, למדוד את הזווית β בין שתי שורות להציב מרכזי לאורך עמוד השדרה דנ"א ומרכוז בשיא חלבון (ראה למשל , הבלעה באיור 4 ). למדוד את הזוויות עבור מספר רלוונטי מבחינה סטטיסטית של DNA- מתחמי DNA (> 50, באופן אידיאלי> 100) 2 , 3 , 5 .
      הערה: זווית ה- DNA לכופף מוגדר 180 ° -β 2 , 3 , 5 .
    2. באמצעות ניתוח נתונים וגרפים תוכנה(ראה טבלה של חומרים) לייצר עקומת זווית הפצה היסטוגרמה על ידי binning זווית ה- DNA זוויות.
    3. התאם את חלוקת הזווית העקומה עם עקומת גאוס. אם אחד או יותר מרבי ניכר בהפצה, בחר מספר גאוס התאמה שיא. מרכז (ים) של עקומת גאוס (ים) לתת (ים) את הממוצע זווית לכופף המדינה של המין בפרט.
    4. אם שינוי בזווית העקמומיות (מקסימום של התאמה גאוס) (s) נראה לעין להפצות, למשל, של וריאנטים חלבונים שונים או מינים שונים של חלבון מורכב, ליישם את התלמיד t-test כדי להעריך את רמת המשמעות של שינויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבחנה בין סוגים מורכבים שונים המבוססים על כמויות מורכבות של חלבון

פעילות helicase של NER helicase prokaryotic UvrB הוא מגורה על ידי DNA מחייב 22 , 23 . UvrB דורש אזור לא מזוהה בדנ"א (בועת דנ"א) כדי לטעון נכונה על אחד משני גדילי ssDNA יחיד. ב vivo , מבנה ה- DNA הזה מסופק על ידי אינטראק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח סטטיסטי AFM של עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ"א ארוכים המכילים אתרים ספציפיים היעד יכול לחשוף פרטים מעניינים על אסטרטגיות מסוימות המשמשים את החלבון לזהות אתרים אלה 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . כדי לפרש את הפצות המיקום וכתוצאה מכך, את המיקום של המטרות ב- DNA צריך להיות מוכר במדויק. זו מושגת על ידי הצגת אתרים ספציפיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PUC19N, oligonucleotides המכיל CPD, ו- p44 סופקו בחביבות על ידי סמואל וילסון, Korbinian Heil ותומאס קארל, ואת Gudrun Michels ו Caroline Kisker, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 ו TE-671/4 ל- IT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בדיקת כוח מולקולרית (MFP) מחקר מקלט תלת מימדN/Aמיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)
Precision 390DELLN/A
מחשב ThermoMixer ובלוק 1.5 מ"לEppendorf5382000015בלוק חום להכנת DNA
Rotilabo Block-Heater H 250 & בלוקים לצינורות 0.5 מ"לCarl Roth GmbHY264.1 & Y267.1בלוק חום לדגירת חלבון-DNA
Mini-Sub Cell GTBio-Rad Laboratories GmbHתא אלקטרופורזה 1704467 עם גלגלת ג'ל וספק כוח
Power Pac BasicBio-Rad Laboratories GmbH1645050ספק כוח אלקטרופורזה
5415 D עם רוטורEppendorf2262120-3צנטריפוגה שולחנית
Ultra-Lum אלקטרונית UV transillumonator MEB-15Ultralum900-1322-02שולחן קרינת UV
NanoDrop ND-1000VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbHN/AUV ספקטרופוטומטר
TKAX-CAD עם 0.2 μ מסנן קפסולה mUnity Lab ServicesN/Aיחידת דה-יוניזציה ומסנן מים
שםstrong>חברהמספר קטלוגיComments
Software
MFP תוכנה בתוכנת Igor ProAsylum ResearchN/AAFM תוכנה
ImageJ (עיבוד תמונה Java בקוד פתוח)NIH ImageN/Aתוכנה לניתוח תמונות
Excel (Microsoft Office)Microsoft CorporationN/Aתוכנת ניתוח נתונים
Origin9 / Origin2016OriginLab CorporationN/Aתוכנת ניתוח נתונים סטטיסטיים וגרפים
NameCompanyמספר קטלוגיהערות
Material
OMCL-AC240TSOlympusOMCL-AC240TSAFM ctellevers
כיתה V-5 מוסקוביטSPI אספקה1805גיליונות נציץ
Amicon Ultra 0.5 מ"ל 50k UltracellMillipore אירלנד בע"מUFC505096מסנני צנטריפוגות
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH740 609.250ערכת מיצוי ג'ל אגרוז
נייר תאית Rotilabo סוג 111ACarl Roth GmbHAP59.1נייר תצהיר AFM
Anatop 25 (0.02 μ m)Whatman GmbH6809-2102מסנן מזרק
SSpI, BspQINew England Biolabs (NEB)R0132, R0712אנזימי הגבלה להכנת מצע DNA
XhoI, BglIIR0146, R0144אנזימי הגבלה להכנת DNA בקרות
אנזים הגבלת ניקינג, Nt.BstNBIניו אינגלנד ביולאבס (NEB)R0607ניקאז
T4 DNA ליגאזניו אינגלנד ביולאבס (NEB)M0202Sליגאז
טריס, HEPESCarl Roth GmbH4855, 9105כימיקלים חוצץ
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetateCarl Roth GmbH3957, HN03, HN02, P026כימיקלים מלח
NaAcSigma-Aldrich Chemie GmbH32318כימיקלים
מלח DTT, TCEP, EDTA6908, HN95, 8040כימיקלים/ ריאגנטים
אגרוז, חומצה אצטית, HClCarl Roth GmbH2267, 3738, K025ריאגנטים
ATPCarl Roth GmbHK054נוקלאוטידים
אוליגונוקלאוטיד #1 בטבלה 1Biomersמותאם אישיתDNA משלים אוליגונוקלאוטידים אוליגונוקלאוטידים
#2, #3 ו-#6 בטבלה 1טכנולוגיות DNA משולבות (IDT)פלואורסצאין מותאם אישית המכיל אוליגונוקלאוטידים
אוליגונוקלאוטידים #4  ו-#5 בטבלה 1פרטי (זמין למשל מ-TriLink או GlenResearch)CPD המכיל אוליגונוקלאוטידים
צינור תגובה SafeSeal 0.5 מ"ל ו-1.5 מ"לSarstedt72.704 ו-72.706צינורות דגירה
GeneRuler 1 kbThermo ScientificSM0311סולם DNA
6x טעינת ג'ל מרוכז צבע סגולחדש אנגליה Biolabs (NEB)51406צבע טעינת DNA
Midori Green Nippon Genetics Europe GmbH999MG28055כתם DNA
Centifuge

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).
  3. Tessmer, I., et al. Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair. J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).
  4. Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer. Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).
  5. Buechner, C. N., et al. Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility. J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).
  6. Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering. Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).
  7. Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids. Methods. 60, 113-121 (2013).
  8. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).
  9. Wirth, N., et al. Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition. J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).
  10. Kuper, J., Kisker, C. Damage recognition in nucleotide excision DNA repair. Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).
  11. Buechner, C. N., Tessmer, I. DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions. J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).
  12. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Sci. Rep. 5, 9625(2015).
  13. Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy. Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).
  14. Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex. EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).
  15. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  16. Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair. EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).
  17. Kuper, J., et al. In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair. PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).
  18. Shlyakhtenko, L. S., et al. Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials. Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).
  19. Roth, H. M., et al. XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1. DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).
  20. Ratcliff, G. C., Erie, D. A. A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants. J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).
  21. Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).
  22. Caron, P. R., Grossman, L. Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair. Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).
  23. Wang, H., et al. UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity. J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).
  24. Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging. Methods. 60 (2), 122-130 (2013).
  25. Truglio, J. J., et al. Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB. Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).
  26. Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation. EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).
  27. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands. EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).
  28. Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition. EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).
  29. Moolenaar, G. F., et al. The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair. J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAAFMDNAXPD p44AFM

מאמרים קשורים