הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים
במאמר זה
סיכום
תקציר
כדי ללמוד את ההתנהגות כמו-הפריון של synuclein אלפא misfolded, מודלי עכבר נדרשים המאפשרים שידור מהיר ופשוט של prionoids אלפא-synuclein, אשר גורם בנוירופתולוגיה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים כי intraglossal או זריקה intraperitoneal של הסיבים-synuclein אלפא לתוך bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, אשר ביטוי יתר אלפא-synuclein אדם עם מוטציה A53T מן האמרגן חלבון הפריון ו גחלילית בלוציפראז מ האמרגן עבור חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), מספיקה כדי לגרום למחלה neuropathologic. בהשוואה הומוזיגוטיים Tg (M83 + / +) בעכברים כי לפתח סימפטומים נוירולוגיים חמורים מתחיל בגיל של 8 חודשים, הטרוזיגוטיים Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) חיות להישאר חופשי של המחלה ספונטנית עד שהם יגיעו בגיל 22 חודשים. מעניין, הזרקה של סיבי synuclein-אלפא באמצעות intraperitoneאל מסלול מושרה מחל נוירולוגית עם שיתוק בארבעה מתוך חמש Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. חיות נושאים מחלות הראו פיקדונות חמורים-synuclein אלפא פוספורילציה במוחם וחוטי שדרה. הצטברויות של synuclein אלפא היו sarkosyl-מסיסות ו colocalized עם היוביקוויטין ו p62, ולוו תגובה דלקתית וכתוצאה מכך דבק astrocytic ו microgliosis. באופן מפתיע, חיסון של סיבי synuclein-אלפא לתוך הלשון היה פחות יעיל בגרימת מחלה עם רק אחד מחמש חיות מוזרקות מראות פתולוגיה-synuclein אלפא לאחר 285 ימים. הממצאים שלנו מראים כי חיסון באמצעות המסלול intraglossal ועוד זאת דרך המסלול intraperitoneal מתאים לגרום מחלה נוירולוגית עם סימני ההיכר הרלוונטיים synucleinopathies ב Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. זה מספק מודל חדש לחקר הפריון דמוי בפתוגנזה לגרוםפ לפי prionoids-synuclein אלפא ביתר פירוט.
מבוא
יש ראיות הולכות ומצטברים כי-synuclein אלפא יש מאפיינים דומים לאלו של חלבון הפריון, במיוחד ביכולתה-זרע עצמי להפיץ misfolding בין תאים לאורך מסלולים עצביים. מאפיין זה של synuclein אלפא גם נקרא "פריון דמוי" או "prionoid", והוא נתמך על ידי תצפיות וניסויים להשתלה, אשר מצביעים על ההדבקה של synuclein אלפא misfolded מנוירונים חולה כדי הושתל נוירונים בריאים 1, 2 , 3, 4. כמו כן הזרקה ישירה של-synuclein אלפא misfolded לתוך המוח או בפריפריה, למשל בשריר hindlimb או לדופן המעי, התוצאות התפשטות פתולוגיה אלפ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים כולל חיות בוצעו באישור ועדת הגנה על בעלי חיים של הסוכנות להגנת הסביבה נורדריין וסטפליה המדינה (LANUV). בעלי חיים שוכנו ומטופל בהתאם לתנאים סטנדרטיים עם אור 12 h / מחזור כהה גישה חופשית למזון ומים.
1. מודל חיה
- Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) עכברים עם hemizygous Tg (M83 +/-) עכברים כדי ליצור hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים 15,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הזרקה היקפית של prionoids-synuclein אלפא באמצעות הלשון או בנוירופתולוגיה מושרה הצפק ב CNS של bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים (לוח 1 ואיור 1). לאחר הזרקת intraperitoneal יחידה עם סיבים-synuclein אלפא, ארבעה מתוך חמישה עכברים פתחו מחל נוירולוגית עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. באופן מפתיע, רק אחד מחמישה עכברים פיתחו מחלת CNS לאחר הזרקת intraglossal עם הסיבים-synuclein .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים מייצגים שיטה קלילה כדי לגרום פגיעה עצבית מלווית neuroinflammation לשחזר מאפיינים חשובים של synucleinopathies. באופן דומה, הזרקת הלשון מייצגת נתיב אחר neuroinvasion ידי prionoids-synuclein אלפא בעכברים טרנסגניים אבל הוא פחות יעיל. בחרנו לסיים את הניסויים שלנו בכתובת 420 ימים לאחר הזרקה ואנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי יותר או כל העכברים שהוזרקו הפיברילות עשוי פתחה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים אולגה שארמה, תרזה Hundt, והצוות של מתקני מיקרוסקופיה ובעלי חיים DZNE לקבלת תמיכה טכנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן נגד אקטין | Merck Millipore | MAB1501 | |
| נוגדן נגד אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| אנטי-אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| נוגדן נגד GFAP | Dako | Z0334 01 | |
| נוגדן נגד IBA-1 | Wako | 019-19741 | |
| נוגדן נגד Sequestosome-1 (p62) | Proteintech | 18420-1-AP | |
| נוגדן נגד יוביקוויטין [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| קטמין | רציופארם | 100 מ"ג/ק"ג | |
| קסילזין | רציופארם | 10 מ"ג/ק"ג | |
| מזרק 27 גרם | VWR | 613-4900 | |
| איזופלורן | Piramal Healthcare | PZN קרם | |
| Veet | |||
| Secureline סמן מעבדה | Neolab | 25040 | |
| D-luciferin מלח אשלגן | Acris | LK10000 | 30 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 סוניקטור | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II מערכת הדמיה | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 תוכנת | PerkinElmer | ||
| עכברי Tg(M83+/-) או B6; עכברי C3-Tg (Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J | מעבדת ג'קסון | 004479 | |
| מלקחיים דפוס סטנדרטי | כלי מדע עדינים | 11000-16 | |
| מלקחיים בתבנית צרה | כלי מדע עדינים | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר | TLA-110 | |
| צינורות פוליקרבונט עבי דופן | בקמן קולטר | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi ג'ל חלבון | תרמו פישר Scientific | WG1401BOX | |
| נוגדן מצומד HRP | קיימן | קיימן10004301-1 | |
| IR צבע 680 נוגדן מצומד | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura מצע משך מורחב | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| מערכת הדמיה Stella 3200 מערכת הדמיה | Raytest | ||
| Odyssey מערכת הדמיה אינפרא אדום | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL PVDF ממברנה | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| מי חמצן | Sigma | SA/00216763/000500 | תמיסת עבודה 3% |
| אלבומין בסרום בקר (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| סרום עיזים | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | דילול עבודה 1:50,000 |
| Fluoromount media | Omnilab | SA/F4680/000025 | |
| LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Carl Zeiss | ||
| מעכבי פרוטאז ופוספטאז HALT | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precellys 24-Dual הומוגנייזר | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Alexa Fluor 488 נוגדן מצומד | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Alexa Fluor 594 נוגדן מצומד | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce חומצות אמינו מסועפות שרשרת חלבון בדיקה ערכת | תרמו פישר סיינטיפיק | 10741395 | |
| מיקרוטום RM2255 | Leica | ||
| LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | קארל זייס |
מקורות
- Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
- Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
