הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

8.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55503

⸱

13 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE), 2Centre for Prions and Protein Folding Diseases & Department of Biochemistry, University of Alberta

במאמר זה

סיכום

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק או הלשון של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, המבטאים אלפא-synuclein אדם עם מוטצית A53T משפחתית בלוציפראז גחלילית, יכול לגרום בנוירופתולוגיה, כולל neuroinflammation , במערכת העצבים המרכזית שלהם.

תקציר

כדי ללמוד את ההתנהגות כמו-הפריון של synuclein אלפא misfolded, מודלי עכבר נדרשים המאפשרים שידור מהיר ופשוט של prionoids אלפא-synuclein, אשר גורם בנוירופתולוגיה בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים כי intraglossal או זריקה intraperitoneal של הסיבים-synuclein אלפא לתוך bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים, אשר ביטוי יתר אלפא-synuclein אדם עם מוטציה A53T מן האמרגן חלבון הפריון ו גחלילית בלוציפראז מ האמרגן עבור חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), מספיקה כדי לגרום למחלה neuropathologic. בהשוואה הומוזיגוטיים Tg (M83 + / +) בעכברים כי לפתח סימפטומים נוירולוגיים חמורים מתחיל בגיל של 8 חודשים, הטרוזיגוטיים Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) חיות להישאר חופשי של המחלה ספונטנית עד שהם יגיעו בגיל 22 חודשים. מעניין, הזרקה של סיבי synuclein-אלפא באמצעות intraperitoneאל מסלול מושרה מחל נוירולוגית עם שיתוק בארבעה מתוך חמש Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. חיות נושאים מחלות הראו פיקדונות חמורים-synuclein אלפא פוספורילציה במוחם וחוטי שדרה. הצטברויות של synuclein אלפא היו sarkosyl-מסיסות ו colocalized עם היוביקוויטין ו p62, ולוו תגובה דלקתית וכתוצאה מכך דבק astrocytic ו microgliosis. באופן מפתיע, חיסון של סיבי synuclein-אלפא לתוך הלשון היה פחות יעיל בגרימת מחלה עם רק אחד מחמש חיות מוזרקות מראות פתולוגיה-synuclein אלפא לאחר 285 ימים. הממצאים שלנו מראים כי חיסון באמצעות המסלול intraglossal ועוד זאת דרך המסלול intraperitoneal מתאים לגרום מחלה נוירולוגית עם סימני ההיכר הרלוונטיים synucleinopathies ב Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים. זה מספק מודל חדש לחקר הפריון דמוי בפתוגנזה לגרוםפ לפי prionoids-synuclein אלפא ביתר פירוט.

מבוא

יש ראיות הולכות ומצטברים כי-synuclein אלפא יש מאפיינים דומים לאלו של חלבון הפריון, במיוחד ביכולתה-זרע עצמי להפיץ misfolding בין תאים לאורך מסלולים עצביים. מאפיין זה של synuclein אלפא גם נקרא "פריון דמוי" או "prionoid", והוא נתמך על ידי תצפיות וניסויים להשתלה, אשר מצביעים על ההדבקה של synuclein אלפא misfolded מנוירונים חולה כדי הושתל נוירונים בריאים 1, 2 , 3, 4. כמו כן הזרקה ישירה של-synuclein אלפא misfolded לתוך המוח או בפריפריה, למשל בשריר hindlimb או לדופן המעי, התוצאות התפשטות פתולוגיה אלפא-synuclein לחלקים הדיסטלי של 5 CNS, 6, 7, 8, 9, 10. ניתחנו העברת prionoids-synuclein אלפא באמצעות מסלולים היקפיים בפירוט יותר התייחס לשאלה האם-synuclein אלפא misfolded עשויה neuroinvade העצבים המרכזית לאחר intraglossal יחיד או זריקה intraperitoneal, תכונה שבעבר הוכח עבור פריונים אבל לא עבור אלפא misfolded synuclein. לאחר ההזרקה של פריונים לתוך הלשון, neuroinvasion של CNS מושג באמצעות התפשטות לאורך העצב תת-הלשון של הלשון שמובילה את הגרעין של עצב תת-לשון, הנמצא בגזע המוח 11. כמו במודל של עכברים בחרנו Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כי ביטוי יתר של מוטציה A53T של synuclein אלפא האדם מן האמרגן הפריון, ו גחלילית בלוציפראז בשליטה של האמרגן GFAP לפקח ההפעלה astrocytic ידי פליטת אור, כמו בעבר הראו במוח שלפריון נגוע עכברים 12. בידיים שלנו bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים לא לפתח מחלת עד 23 חודשים של גיל כפי שהוכח על ידי אחרים 13. זריקה אחת של סיבי-synuclein אלפא האנושי דרך intraglossal או מחלה נוירולוגית הנגרמת המסלול intraperitoneal עם פתולוגיה במוחם ואת מיתרי השדרה של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים תומכים בהשערה כי prionoids-synuclein אלפא אפיונים חשובים עם פריונים 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים כולל חיות בוצעו באישור ועדת הגנה על בעלי חיים של הסוכנות להגנת הסביבה נורדריין וסטפליה המדינה (LANUV). בעלי חיים שוכנו ומטופל בהתאם לתנאים סטנדרטיים עם אור 12 h / מחזור כהה גישה חופשית למזון ומים.

1. מודל חיה

  1. Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) עכברים עם hemizygous Tg (M83 +/-) עכברים כדי ליצור hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) בעכברים 15, 16.
  2. גנוטיפ הצאצאים עם PCR בזמן אמת עבור נוכחות של אלפא-synuclein האנושי קידוד transgene ועם PCR תקן גחלילית בלוציפראז 12, 17.
  3. לחסן את בעלי החיים בגיל שישה עד שמונה שבועות.

2. הכנת בידוד

  1. כן moאלפא-synuclein אנושי רקומביננטי nomeric עם המוטציה A53T מלוחים שנאגרו טריס (TBS) מאגר המכיל 150 מ"מ NaCl ב 20 mM Tris-HCl (pH 7.2) כפי שתואר קודם לכן 14.
  2. הכן אלפא-synuclein סִיבִי לצורך חיסונים על ידי התססה 3 מיקרוגרם / μL של synuclein-אלפא אנושי רקומביננטי monomeric ב שייקר מסלולית ב 800 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים.
  3. לדלל מכלולים הפיברילות ב פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) כדי להגיע לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / μL עבור intraperitoneal או 2 מיקרוגרם / μL עבור חיסונים intraglossal.
  4. שבר את סיבי synuclein-אלפא עם sonicator מוט עבור 1 דק '(40 פולסים של משך s 0.5 עם הפסקה של שנייה אחת בין כל דופק ואת משרעת מוגדרת 50%) על קרח. כדי למנוע זיהום על ידי זריעת צלב. להשתמש בדיקות sonication נקיות להכין בידוד שונה.

3. זריקות Intraglossal

  1. להרדים חיות עם intrapeהזרקת ritoneal של 100 מ"ג / ק"ג קטמין 10 מ"ג / ק"ג xylazine. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין. השתמש במשחת וטרינר על העיניים של החיה כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
  2. תקן חיות מסוממות בזהירות עם דבק על גבי צלחת חימום בעמדת גב שכיבה עם ראשם פונה לכיוון החוקר.
  3. מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 5 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS.
  4. שימוש במלקחי אגודל פחוסת-חוטם אחד עם טיפים משוננים להחזיק את הפה של החיה פתוחה, וזוג נוסף קטן יותר של מלקחיים בזהירות לשלוף את הלשון כדי להפוך את הצד התחתון של הלשון נגישה עבור הזרקה.
  5. להזריק את המחט של המזרק לתוך הצד התחתון הימני או השמאלי של הלשון בסמיכות העצבה תת-הלשון. לאט לאט להזריק את הבידוד אחרי 5 ימים. לאט לאט חוזר בי את המחט לאחר 5 ימים כדי להבטיח כי הבידודחדרה הרקמה והוא לא איבד תוך שמבטלת את המחט.
  6. שחרר את החיה מן הקיבעונות שלו ולהשאיר אותו על צלחת חימום תת ניטור מתמיד עד להחלמה מלאה.

4. זריקות intraperitoneal

  1. עבור זריקות intraperitoneal, לְהַרְדִים החיות בקרוב תא הרדמה משאיפת עם חמצן isoflurane / באמצעות קצב הזרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדר 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין.
  2. מלאו מזרק חד פעמי 27 G עם 50 μL של סיבים-synuclein אלפא sonicated או PBS.
  3. ישירות להזריק לתוך הצפק של עכבר ולהימנע חודר למעי או cecum קטן הממוקם מאחורי קיר הבטן על ידי החזקת החיה בעמדה הגב עם הראש מול הרחק החוקר וכלפי מטה על כ 45 °. מעקב אחר בעלי חיים עד שהם התאוששומן ההרדמה.

5. הדמיה פליטת אור

  1. Tg תמונה (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים כל 2-4 שבועות באמצעות מערכת הדמיה פליטת אור.
  2. לפני ההדמיה בקרוב להרדים עכברים בתא isoflurane / חמצן עם קצב זרימה של 2 ליטר / דקה ו מאדה מוגדרת 2%. לצבוט את הבוהן של החיה ולאשר שזה לא לסגת hindlimb שלה כדי להבטיח הרדמה תקין.
  3. גילוח את שער ראשי העכברים עם קרם מקריח. צבע את האוזניים בשחורות בטוש לא מעצבן לחסום פליטת אור נוקבת.
  4. לדלל מלח אשלגן D-luciferin, המצע של luciferase, ב PBS פתרון המניות 30 מ"ג / מ"ל. בחנות זו ב 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הגנו על D-luciferin מומס מחשיפה לאור.
  5. לשקול את החיות לפני ההזרקה. חשב את נפח המדויק של D-luciferin עבור הזרקה של 150 מ"ג / ק"ג משקל גוף. Intraperitoneally להזריק D-luciferin ולהחזיר את בעל החיים בתא הרדמה.
  6. הפעל את תוכנת ההדמיה. לאחר מערכת ההדמיה הגיעה טמפרטורת ההפעלה שלה לאתחל את המערכת על ידי לחיצה על הכפתור "האתחול" בלוח הבקרה.
  7. בחר את "אור פלורסנט" ו "צילום" הכפתורים. קבע את זמן החשיפה כדי 60 s, binning אל "בינונית", ה- F / Stop ל "1", ואת רווח EM ל "כבוי".
  8. ודא מסנן עירור מוגדר "בלוק" ואת מסנן פליטה ל'פתח ', ולהגדיר את גובה בכפוף 1.50 ס"מ.
  9. עשר דקות לאחר הזרקה עם D-luciferin, למקם את החיות לצלחת החימום בחדר ההדמיה ולהבטיח כי חרטומם ממוקם כראוי לשקע ההרדמה. סגור את זרימת isoflurane / חמצן מבית הבליעה שאיפה לפתוח את הזרימה עבור חדר ההדמיה עם קצב זרימה של 0.25 L / min ו אידוי של 2%. סגור את הדלת של יחסי ציבור לחדר ההדמיהoperly.
  10. לחץ על הכפתור "רוכש את" כדי למדוד את פליטת האור, אשר לוקח 60 s. עצור את זרימת isoflurane ולנטר את החיות עד שהם התאוששו לחלוטין לאחר שחזר אותם בחזרה לכלובים שלהם.
  11. השתמש בתוכנת ההדמיה לכמת את פליטת האור. בעמוד התווך "Palette Tool" לבחור "כלים ROI". תחת "סוג" בתוך "כלי ROI" בחר "ROI המדידה".
  12. בעמוד התווך "כלים ROI" על הכלי "המעגל" ובחר את מספר ROIs לצייר מהתפריט לנתץ - אידיאלי "3" במשך שלושה עכברים.
  13. בתמונה, לחיצה ימנית על כל ROI ותחת "מאפיינים" להתאים את הרוחב והגובה של 1.25 ס"מ. מיקום כל ROI על האזור במוח היא לכמת.
  14. בפינה הימנית העליונה של התמונה, להגדיר בלוח יחידות "זוהר (פוטונים)".
  15. בעמוד התווך "Palette Tool", ובחר "תמונה כוונן" ולהתאים את המינימוםהמקסימום של "סולם צבעים", למשל, מן 0.20e6 כדי 1.00e6.
  16. תחת "קובץ" לשמור את הנתונים עם "שמור".

6. ניתוח ביוכימיים

  1. לבודד את המוח ואת מיתרי השדרה פי פרוטוקולים הוקמה 18, 19.
  2. Homogenize כולו מוח ודגימות חוט השדרה כולו בנפרד PBS בנוכחות מעכבי פרוטאז ו phosphatase (מדולל ל X 1 ב PBS) בשני 30 מחזורים של עם 6000 סל"ד ב homogenizer רקמות. ודא כי המוח ודגימות וחוט השדרה הומוגני לריכוז סופי של 20% (wt / כרך).
  3. Sonicate דגימות פעמיים תוך שמירה על אותם על הקרח עם דופק קבוע של 10 s ו משרעת מוגדר 50%.
  4. התאם את homogenates כדי 10% ב PBS ו 750 מ"מ NaCl ידי דילול אותם 1: 1 עם 1.5 M NaCl ב PBS.
  5. כדי להפריד את הפסולת התאית, צנטריפוגות homogenates ב 1000 XG במשך 5 דקות ב4 ° C. שמור את supernatants לקראת השלבים הבאים וזורקים כדורי.
  6. למדוד את ריכוז החלבון homogenates באמצעות חומצה bicinchoninic assay (BCA) על פי הוראות היצרן. דגירה 1.0 מ"ג של חלבון סך homogenates המוח או 0.8 מ"ג מן homogenates חוט השדרה ב N-laurylsarcosyl בריכוז סופי של 10% (wt / כרך) במשך 15 דקות על הקרח.
  7. מכסים את homogenates על כרית סוכרוז 3 מ"ל של 10% (wt / כרך) במים מזוקקים ultracentrifuge אותם 465,000 XG עבור 1 ש 'ב 4 מעלות צלזיוס.
  8. Resuspend את כדורי במאגר המכיל סולפט dodecyl 4% נתרן (SDS), 2% β-mercaptoethanol, 192 גליצין מ"מ, 25 מ"מ טריס, ו 5% (wt / כרך) סוכרוז.
  9. מרתיח את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 'ומעלה אותם על ג'ל SDS-polyacrylamide אלקטרופורזה בתוך חומצת morpholineethanesulfonic מערכת חיץ (MES).
  10. העברת חלבונים מופרדים כדי polyvinylidene difluoride (PVDF) ממברנות בתוך SEMidry סופג מערכת.
  11. דגירה ממברנות ב 0.4% (כרך / כרך) פתרון פורמלין PBS עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר על הרוטור עם 35 סל"ד כדי צולבות הקישור החלבונים עם הממברנה.
  12. חסום את ממברנות ב TBS חיץ המכיל 0.05% (כרך / כרך) Tween 20 ו 5% (wt / כרך) חלב 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  13. דגירה כתם עם הנוגדן הראשוני חסימת חיץ בין הלילה ב 4 ° C..
  14. שטפו את ממברנות שלוש פעמים TBS חיץ דגירה אותם עם נוגדנים משני peroxidase- או fluorophore מצומדות ב TBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  15. דמיינו את הנוגדנים משני מחויב chemiluminescence או פלואורסצנטי פי פרוטוקולים הוקמו 20.

7. ניתוח Immunofluorescence

  1. מייבשים את המוח גזור מיתרי השדרה בתחנת עיבוד רקמות ולהטביע אותם פרפין באמצעות תחנת פרפין.
  2. חותכים את TIS פרפין-מוטבעתובעת עם microtome ב 8 חלקי העטרה עבים מיקרומטר ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית.
  3. Deparaffinize בסעיפי הרקמות ידי דוגרים להם שתי אמבטיות xylol נפרדות במשך 5 עד 10 דקות ו רעננותם אותם באמצעות סדרה של אמבטיות אתנול מדורגים (100%, 90%, 70%, 50%) ולבסוף עם H 2 O.
  4. דגירת מקטעי חיץ ציטראט 0.01 M (pH 6.0) עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר ובנוסף להרתיח אותם 10 דקות במיקרוגל.
  5. תנו חלקים להתקרר לטמפרטורת החדר דגירה אותם עם פתרון חמצן 3% עבור 30 דקות כדי לעכב peroxidases אנדוגניים.
  6. חסום את הסעיפים רקמה על ידי הדגירה עם 20% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) אלבומין בסרום שור (BSA), ו 0.5% טריטון X-100 ב PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  7. דגירה החלקה עם הנוגדן העיקרי מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו 0.25% Triton X-100 ב PBS הלילה בשעה C ° 4.
  8. לשטוף את הסעיפים פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS.
  9. הכתם בסעיפים עם נוגדנים משני fluorophore מצומדות המקביל ואת DAPI צבע גרעיני מדולל 1% (כרך / כרך) בסרום עז נורמלי, 1% (כרך / כרך) BSA, ו PBS עבור 1 שעות בטמפרטורת החדר.
  10. לאחר שטיפת פעמיים עם 0.25% (כרך / כרך) טריטון X-100 ב PBS ופעם עם PBS, coverslip השקופיות עם התקשורת הטבעה ולדמיין מכתים עם מיקרוסקופ סורק לייזר confocal.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הזרקה היקפית של prionoids-synuclein אלפא באמצעות הלשון או בנוירופתולוגיה מושרה הצפק ב CNS של bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים (לוח 1 ואיור 1). לאחר הזרקת intraperitoneal יחידה עם סיבים-synuclein אלפא, ארבעה מתוך חמישה עכברים פתחו מחל נוירולוגית עם זמן דגירה החציוני של 229 ± 17 ימים. באופן מפתיע, רק אחד מחמישה עכברים פיתחו מחלת CNS לאחר הזרקת intraglossal עם הסיבים-synuclein ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הזרקה היקפית של סיבים-synuclein אלפא לתוך הצפק של Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) עכברים מייצגים שיטה קלילה כדי לגרום פגיעה עצבית מלווית neuroinflammation לשחזר מאפיינים חשובים של synucleinopathies. באופן דומה, הזרקת הלשון מייצגת נתיב אחר neuroinvasion ידי prionoids-synuclein אלפא בעכברים טרנסגניים אבל הוא פחות יעיל. בחרנו לסיים את הניסויים שלנו בכתובת 420 ימים לאחר הזרקה ואנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי יותר או כל העכברים שהוזרקו הפיברילות עשוי פתחה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים אולגה שארמה, תרזה Hundt, והצוות של מתקני מיקרוסקופיה ובעלי חיים DZNE לקבלת תמיכה טכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן נגד אקטיןMerck MilliporeMAB1501
נוגדן נגד אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [pSyn#64]Wako015-25191
אנטי-אלפא-סינוקלאין, נוגדן פוספו S129 [EP1536Y]Abcamab51253
נוגדן נגד GFAPDakoZ0334 01
נוגדן נגד IBA-1Wako019-19741
נוגדן נגד Sequestosome-1 (p62)Proteintech18420-1-AP
נוגדן נגד יוביקוויטין [Ubi-1]Merck MilliporeMAB1510
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Invitrogen14190169
קטמין רציופארם100 מ"ג/ק"ג
קסילזיןרציופארם10 מ"ג/ק"ג
מזרק 27 גרםVWR613-4900
איזופלורן Piramal HealthcarePZN  קרם
Veet
Secureline סמן מעבדה Neolab25040
D-luciferin מלח אשלגןAcrisLK1000030 מ"ג/מ"ל תמיסת מלאי
ThermomixerEppendorf5776671
Sonopuls Mini20 סוניקטורBandelin3648
IVIS Lumina II מערכת הדמיהPerkinElmer
Living Image 3.0 תוכנתPerkinElmer
עכברי Tg(M83+/-) או B6; עכברי C3-Tg (Prnp-SNCA*A53T)83Vle/Jמעבדת ג'קסון004479
מלקחיים דפוס סטנדרטיכלי מדע עדינים11000-16
מלקחיים בתבנית צרהכלי מדע עדינים11002-12
N-laurylasarcosylSigmaL5125-100G
Optima Max-XP אולטרה-צנטריפוגה בקמן קולטרTLA-110 
צינורות פוליקרבונט עבי דופןבקמן קולטר362305
NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi ג'ל חלבוןתרמו פישר ScientificWG1401BOX
נוגדן מצומד HRPקיימןקיימן10004301-1
IR צבע 680 נוגדן מצומד LI-COR Biosciences926-68070
SuperSignal West Dura מצע משך מורחבThermo Fisher Scientific34075
מערכת הדמיה Stella 3200 מערכת הדמיהRaytest
Odyssey מערכת הדמיה אינפרא אדום LI-COR Biosciences
Tween 20 MP BiomedicalsTWEEN201
Triton X-100SigmaSA/T8787
Immobilon-FL PVDF ממברנהMerck MilliporeIPFL00010
XylolSigmaRoth
מי חמצןSigmaSA/00216763/000500תמיסת עבודה 3%
אלבומין בסרום בקר (BSA) Thermo Fisher ScientificA3294-100G
סרום עיזיםThermo Fisher ScientificPCN5000
4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD1306דילול עבודה 1:50,000
Fluoromount media OmnilabSA/F4680/000025
LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליCarl Zeiss
מעכבי פרוטאז ופוספטאז HALTThermo Fisher Scientific 
Precellys 24-Dual הומוגנייזר Peqlab91-PCS24D
Alexa Fluor 488 נוגדן מצומדThermo Fisher ScientificA31619
Alexa Fluor 594 נוגדן מצומדThermo Fisher ScientificA11005
Pierce  חומצות אמינו מסועפות שרשרת  חלבון  בדיקה  ערכתתרמו פישר סיינטיפיק10741395
מיקרוטום RM2255Leica
LSM700 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליקארל זייס
אפילציה 4831850 רוטור 10516495

מקורות

  1. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459 (7249), 924-925 (2009).
  2. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T. B. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. Olanow, C. W. 14 (5), 504-506 (2008).
  3. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  4. Hansen, C., et al. alpha-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells. J Clin Invest. 121 (2), 715-725 (2011).
  5. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological alpha-synuclein in brain. Brain. 136 (4), 1128-1138 (2013).
  6. Holmqvist, S., et al. Direct evidence of Parkinson pathology spread from the gastrointestinal tract to the brain in rats. Acta Neuropathol. 128 (6), 805-820 (2014).
  7. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  8. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1, 38(2013).
  9. Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of alpha-synuclein induces CNS alpha-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10732-10737 (2014).
  10. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  11. Bartz, J. C., Kincaid, A. E., Bessen, R. A. Rapid prion neuroinvasion following tongue infection. J Virol. 77 (1), 583-591 (2003).
  12. Tamgüney, G., et al. Measuring prions by bioluminescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 15002-15006 (2009).
  13. Watts, J. C., et al. Transmission of multiple system atrophy prions to transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (48), 19555-19560 (2013).
  14. Breid, S., et al. Neuroinvasion of alpha-Synuclein Prionoids after Intraperitoneal and Intraglossal Inoculation. J Virol. 90 (20), 9182-9193 (2016).
  15. Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
  16. Zhu, L., et al. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci Lett. 367 (2), 210-212 (2004).
  17. Bernis, M. E., et al. Prion-like propagation of human brain-derived alpha-synuclein in transgenic mice expressing human wild-type alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 3 (1), 75(2015).
  18. Gunther, R., et al. Clinical testing and spinal cord removal in a mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS). J Vis Exp. (61), (2012).
  19. Jackson-Lewis, V., Przedborski, S. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2 (1), 141-151 (2007).
  20. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  21. Kim, C., et al. Exposure to bacterial endotoxin generates a distinct strain of alpha-synuclein fibril. Sci Rep. 6, 30891(2016).
  22. Keller, A. F., Gravel, M., Kriz, J. Live imaging of amyotrophic lateral sclerosis pathogenesis: disease onset is characterized by marked induction of GFAP in Schwann cells. Glia. 57 (10), 1130-1142 (2009).
  23. Stöhr, J., et al. Distinct synthetic Abeta prion strains producing different amyloid deposits in bigenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2014).
  24. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological alpha-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative alpha-synucleinopathy in mice. J Exp Med. 209 (5), 975-986 (2012).
  25. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger alpha-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys. Ann Neurol. 75 (3), 351-362 (2014).
  26. Sacino, A. N., et al. Induction of CNS alpha-synuclein pathology by fibrillar and non-amyloidogenic recombinant alpha-synuclein. Acta Neuropathol Commun. 1 (1), 38(2013).
  27. Peelaerts, W., et al. alpha-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522 (7556), 340-344 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CNSGFAP
הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.