מאמר שיטה

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

DOI:

10.3791/55505

⸱

27 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Nephrology, Department of Internal Medicine, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי ביטוי microRNA ב קרום עכברוש עכברוש באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז. שיטה זו מתאימה ללימוד פרופיל הביטוי microRNA בקרום עכברוש עכברוש במספר תנאים פתולוגיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) הם RNAs noncoding קטנים המווסת את הביטוי RNA שליח הודעה שלאחר transcriptionally. פרופיל הביטוי miRNA נחקרה באיברים ורקמות שונים בעכברוש. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור miRNAs וזיהוי הביטוי שלהם בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב. פיתחנו שיטה יעילה ואמינה לטהר לכמת miRNAs באמצעות כמותי בזמן אמת הפוכה תעתיק התגובה שרשרת פולימראז (qRT-PCR) בממברנה פריטוניאלית עכברוש. פרוטוקול זה מורכב של ארבעה שלבים: 1) טיהור מדגם קרום פריטוניאלי; 2) טיהור של RNA הכולל כולל מירנה מדגם הממברנה פריטוניאלית; 3) שעתוק לאחור של מירנה לייצר cDNA; ו 4) qRT-PCR כדי לגלות ביטוי מירנה. באמצעות פרוטוקול זה, קבענו בהצלחה כי הביטוי של miRNAs שישה (מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו- miRNA-34a-5p) גדלבאופן מובהק בממברנה הצפקית של מודל חולשת הצפק של העכברוש בהשוואה לאלו בקבוצת הביקורת. פרוטוקול זה ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפרופיל של ביטוי מירנה בקרום הצפק של חולדות בתנאים פתולוגיים רבים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroRNAs (miRNAs) הם קצרים, RNAs לא קידוד כי שלאחר transcriptionally לווסת את השליח RNA (mRNA) ביטוי 1 . שינויים בביטוי של miRNAs להסדיר את הביטוי של mRNAs רבים אשר ממלאים תפקידים מרכזיים במצבים פתולוגיים שונים, כולל סרטן, דלקות, הפרעות מטבוליות, ו פיברוזיס 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . לכן, miRNAs יש פוטנציאל כמו ביומרקרים חדשים ומטרות טיפוליות 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . פרופיל הביטוי miRNA נקבע בעכברוש שוניםאיברים ורקמות, כולל כבד, לב, ריאה וכליות. עם זאת, שיטות סטנדרטיות לטיהור וזיהוי של miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש לא היו מבוססים היטב.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא בהצלחה לטהר ולזהות miRNAs בממברנה פריטוניאלית עכברוש. ראשית, מדגם הממברנה הצפק היה homogenized באמצעות homogenizer זכוכית, ואחריו חשיפה למערכת biopolymer רטוש בעמודה microcentrifuge ספין 10 . לאחר מכן, סך כולל RNA כולל miRNA היה מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית באמצעות עמודה סיליקה מבוסס קרום סיליקה 10 . לאחר מכן, cDNA היה מסונתז מן RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל 11 . לבסוף, הביטוי של מירנה נקבע על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating 11 . הרציונל של פרוטוקול זה הוא בכמו על מחקרים קודמים שהראו טיהור משמעותי וזיהוי של מירנה ברקמות על ידי תהליך פשוט 8 , 10 , 11 . זה כבר דיווח כי השימוש במערכת biopolymer-רטוש בעמודה microcentrifuge ספין סיליקה קרום מבוסס ספין טור יכול לטהר באיכות גבוהה RNA סך מ רקמות 10 . השיטה של ​​סינתזה cDNA מ RNA סך מטוהרים באמצעות transcriptase הפוך, פולימראז פולי (א), ו אוליגו dT תחל, ואת השיטה של ​​גילוי ביטוי מירנה על ידי qRT-PCR באמצעות צבע intercalating בפרוטוקול זה דווחו כדי להראות דיוק גבוהה רגישות 11 . בנוסף, זהו תהליך פשוט, אשר חוסך זמן ומונע שגיאות טכניות. לכן, פרוטוקול זה שימושי במחקרים הדורשים זיהוי מדויק ורגיש מאוד של מירנה בממברנה פריטוניאלית עכברוש במגוון רחב של תנאים פתולוגיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של אוניברסיטת Jichi רפואי ונערכו בהתאם לשימוש וטיפול של הנחיות לבעלי חיים ניסיוניים מן Jichi Medical University Guide עבור חיות מעבדה.

1. פריטוניום אוסף דוגמאות

  1. לאסוף את הפריטים הבאים: 50 צנטריפוגות צינור מ"ל עם כותנה ספוג ב isoflurane, גיליון הפקק, צלחת פטרי עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מספריים כירורגי, מלקחיים.
  2. להרדים חולדה עם מנת יתר של isofluorane, ולאחר מכן לרסס את העור הבטן של החולדה עם אתנול 70%, ואת הרם חולדה על גיליון השעם על גבו.
  3. בצע חתך אורכי של העור הבטן, שריר, הממברנה פריטוניאלית באמצעות מספריים ו מלקחיים.
  4. להרים את הממברנה פריטוניאלית באמצעות מלקחיים, ולעשות חתכים אופקיים על החלק העליון שלה לאורך עצם הצלע הנמוך ביותר מתחת לסרעפת ועל l שלהצד ower על האזור לרוחב באמצעות מספריים כירורגית. לאחר מכן, לבצע חתכים אורך לרוחב כדי להסיר את הממברנה פריטוניאלית מהגוף באמצעות מספריים כירורגיים. לאחר מכן, לשטוף אותו עם PBS בצלחת פטרי.
  5. לחתוך ולקצץ 20 מ"ג (3-5 מ"מ 2 ) של דגימות קרום פריטוניאלי, אשר מתאים בגודל הצעדים הבאים, באמצעות מספריים כירורגי ומלקחיים.

2. מטהר RNAs סך דגימות ממברנה פריטוניאלית

הערה: הנה, דגימות הממברנה פריטוניאלית במשקל 20 מ"ג הם homogenized באמצעות homogenizer זכוכית מערכת biopolymer רטוש בעמודה ספין microcentrifuge. לאחר מכן, RNA הכולל מדגם הממברנה הצפק מבודד באמצעות טור ספין סיליקה מבוססי קרום.

  1. אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 או 2.0 מ"ל צינורות microcentrifuge, אתנול 100%, כלורופורם, homogenizer זכוכית, קרח, biopolymer-רטוש מערכת בעמודה ספין microcentrifuge 10 10 , פנול / guanidine מבוסס מגיב תמוגה, לשטוף חיץ כולל guanidine ואתנול (לשטוף חיץ 1), וכן לשטוף חיץ כולל אתנול (לשטוף חיץ 2).
  2. שים 20 מ"ג מדגם קרום פריטוניאלית לתוך homogenizer זכוכית ולהוסיף 700 μL של מגיב תמוגה פנול / guanidine.
  3. Homogenize דגימת הממברנה הצפק על ידי לחיצה איטית על העלי על המדגם עם פיתול. חזור על תהליך זה כמה עשרות פעמים על הקרח עד דגימת הממברנה פריטוניאלית יש מומס לחלוטין לתוך מגיב תמוגה פנול / guanidine.
  4. לקבלת homogenization נוספת, העברת lysate homogenized כדי biopolymer-רטוש המערכת בעמודה ספין microcentrifuge ב 2.0 צינור מ"ל. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 14,000 במשך 3 דקות ב 4 ° C.
  5. מעבירים את lysate הומוגני לצינור microcentrifuge חדש.
  6. הוסף 140 μL של כלורופורם כדי lysate הומוגני ואת מכסה את האמבט. לאחר מכן, לערבב את הצינור על ידי היפוך במשך 15 s.
  7. דגירה הדגימות במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, צנטריפוגה אותם XG 12,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  8. מעבירים את supernatant (בדרך כלל 300 μL) לצינור microcentrifuge חדש מבלי להפריע את המשקע, ולהוסיף 1.5x נפח שלה (בדרך כלל 450 μL) של אתנול 100%. לאחר מכן, לערבב את המדגם על ידי vortexing עבור 5 s.
  9. פיפטה עד 700 μL של המדגם לתוך עמודה ספין מבוסס סיליקה סיליקה ממוקם צינור 2.0 מ"ל אוסף. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
  10. הוסף 700 μL של חיץ לשטוף 1 לעמוד סיליקה מבוססי קרום סיליקה לשטוף בחום את המדגם. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
  11. הוסף 500 μL של חיץ לשטוף 2 סיליקה- membRane מבוסס ספין טור להסיר כל זכר של מלח. סגור את מכסה העמודה. ואז, צנטריפוגה זה ב XG 15,000 במשך 15 s. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
  12. חזור על 2.11.
  13. צנטריפוגה סיליקה קרום מבוסס ספין טור שוב ב XG 15,000 במשך 1 דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את הזרימה דרך בצינור אוסף.
  14. מניחים את סיליקה קרום מבוסס ספין טור ב צינור 1.5 מ"ל חדש אוסף. לאחר מכן, העברת 25 μL של מים חינם RNase לתוך העמודה. סגור את מכסה העמודה. השאירו את המדגם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. ואז, צנטריפוגה אותו ב XG 15,000 במשך 1 דקות.
  15. מעבירים את eluate 25 μL המכיל RNA הכולל לצינור microcentrifuge חדש. לאחר מכן, לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

3. הפוך שעתוק של RNA סך

הערה: הפניה ודבקות המידע המינימלי לפרסום כמותי בזמן אמת PCR מומחה(IMQ) הנחיות מעודדות תרגול טוב יותר ועזרה בהשגת תוצאות אמינות וחד משמעיות 12 .
הערה: כאן, סך של 1.0 מיקרוגרם של רנ"א מבודד הוא transcript לאחור באמצעות transcriptase לאחור, פולימראז פולי (A), ו אוליגו dT תחל.

  1. אסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל microcentrifuge צינורות; שמונה צינורות שפופרת היטב; מים נטולי RNase; קֶרַח; ערכת transcriptase לאחור (ראה טבלת חומרים) 11 .
  2. הכן פתרון לערבב מאסטר המכיל 2.0 μL של תערובת חומצה גרעין 10x, 2.0 μL של תמהיל transcriptase הפוך (מתוך הערכה), ו 4.0 μL של חיץ 5x Hi-spec עבור סכום כולל של 8.0 μL לכל צינור.
  3. לוותר 8.0 μL של פתרון לערבב הורים (מן הערכה) לתוך כל צינור.
  4. למדוד את כמות RNAs הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. הוסף 1.0 מיקרוגרם של RNAs סך מבודדים מטוהרים מדגם הממברנה פריטוניאלית לכל צינור.
    הערה: qRT-PCR עשוי להתבצע usiNg סך RNAs כתבנית ללא שעתוק לאחור עבור בקרת איכות של RNAs סך מטוהרים. אם כל DNA הוא מזוהם, מוצרים הגברה בלתי צפויות נצפים על ידי qRT-PCR.
  5. הוסף מים RNase חינם לכל צינור כדי סך של 20 μL. לאחר מכן, לערבב היטב על ידי pipetting ו צנטריפוגה זה 15 s.
  6. דגירה הדגימות למשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מיד דגירה 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
    הערה: שלב זה יכול להתבצע ב cycler תרמי.
  7. העברת cDNA לצינור microcentrifuge חדש לדלל עשר פעמים (1:10) עם מים ללא RNase.
  8. חנות cDNA מדולל על קרח באופן זמני, ב -80 מעלות צלזיוס לטווח ארוך לפני השימוש.

4. qRT-PCR של מירנה

הערה: qRT-PCR של מירנה מבוצעת באמצעות צבע intercalating. הנה, primers עבור רנ"א, U6 קטן גרעיני 2 (RNU6-2), מירנה -142-3p, מירנה 21-5p, מירנה-221-3p, מירנה-223-3p, מירנה -327, ו מירנה -34a-5p שומשו.

  1. לאסוף את הפריטים הבאים: 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, 96-גם צלחת תגובה עבור qRT-PCR, סרט דבק עבור 96-גם תגובה צלחת, מירנה ספציפיים primers, צבע ירוק מבוסס PCR Kit (ראה טבלה חומרים) 11 , בזמן אמת PCR כלי.
  2. הכן תערובת אב המכיל μL 12.5 של תערובת 2x PCR מאסטר, 2.5 μL של 5 מיקרומטר כל פריימר מירנה מומס במים nuclease חינם, ו 1.25 μL של תחל אוניברסלי 10x עבור כל טוב.
  3. לוותר על 22.5 μL של תערובת אב לתוך היטב כל צלחת 96-היטב.
  4. הוסף 2.5 μL של cDNA תבנית היטב כל אחד.
  5. חותם את הצלחת עם סרט דבק עבור 96-גם צלחת התגובה. ואז, צנטריפוגה צלחת ב 1000 xg במשך 30 s.
  6. הפעל את תוכנית רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת PCR כלי ותוכנה כדלקמן.
    1. הגדר את הצלחת בזמן אמת מכשיר ה- PCR. בזמן אמת תוכנה PCR, להגדיר מאפיינים ניסיוניים (קלט ניסיונישם, לבחור "96 בארות" עבור סוג הניסוי של המכשיר, לבחור "2 - שיטת ΔΔCT " עבור שיטת quantitation, בחר "SYBR ריאגנטים ירוקים" עבור מגיב כדי לזהות את רצף היעד, לבחור "מהירות כבש רגילה" עבור הפעלת מכשיר).
    2. לאחר מכן, להקצות שמות לדגימות miRNAs היעד בכל טוב. דוגמאות נבדקות תמיד כפולים או בשלושה עותקים כדי לקבל מספיק נתונים לאימות התוצאות. בחר מדגם התייחסות ובקרה אנדוגנית. בחר "ללא" עבור צבע להשתמש כהפניה פסיבית.
    3. קלט נפח התגובה של "20 μL" ואת התנאים הבאים רכיבה על אופניים PCR בזמן אמת התוכנה PCR בהתאם להוראות: פרינקובציה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של denaturation ב 94 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות , חישול על 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, וכן הרחבה ב 70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.
  7. ניתוח נתונים qRT-PCR uלשיר את התוכנה של מכשיר ה- PCR בזמן אמת. ודא כי סף הבסיס אשר נקבעים באופן אוטומטי על ידי התוכנה מתאימים כל טוב.
  8. בדוק את מחזור הסף של miRNAs היעד בכל מדגם. מחזור הסף הוא הצומת בין עקומת הגברה לקו סף. ואז, לנרמל את רמת הביטוי של miRNAs היעד נגד RNU6-2 כבקרה אנדוגני, ולחשב את רמת הביטוי היחסי של miRNAs היעד באמצעות שיטה 2 - ΔΔCT 13 .
    הערה: יצוין כי היציבות של רמת הביטוי של מירנה בקרה אנדוגני צריך להיות מאומת. בניסוי זה, RNU6-2 אושר להתבטא ברמה גבוהה יחסית קבוע לאורך כל קבוצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות כאן מבוססות על המחקר הקודם שלנו 8 . חקרנו את פרופיל הביטוי מירנה ב fibrois פריטוניאלי. סיבוך פריטוניאלי הוא סיבוך גדול בדיאליזה פריטונאלית. זה מאופיין על ידי אובדן monolayer התא mesothelial ואת הצטברות עודף של מרכיבי מטריקס תאיים, והוא מזוהה עם קרום הממברנה הצפק 14 , 15 . מודל עכברוש סיבי פריטוניאלי נוצר על ידי הזרקה intraperitoneal של 100 מ"ל / ק"ג ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות פרוטוקול המוצג בכתב היד הזה, miRNAs בקרום עכברוש עכברוש טוהרו בהצלחה זוהה באמצעות qRT-PCR. האמינות של ניתוח נתונים qRT-PCR תלוי באיכות של miRNAs מטוהרים. לכן, טוהר miRNAs ניתן לבדוק לפני qRT-PCR על ידי היחס של ספיגת ב 260 ננומטר לזה ב 280 ננומטר, אשר ניתן למדוד באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר הגברה משמעותית של מירנה לא ניתן להשיג באמצעות qRT-PCR, הריכוז של cDNA תבנית עשוי להיות מוגברת. ריכוז של כל מירנה ספציפי תחל יכול גם להיות מוגברת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות Miyako Shigeta על התמיכה הטכנית שלה מעולה. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי JSPS KAKENHI (מענק מספר 25461252).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מגרסת QIAQiagen79654מערכת גריסה ביופולימר במיקרו צנטריפוגה ספין טור
עמוד miRNeasy ערכת מיניQiagen217004עמוד סיבוב מבוסס ממברנת סיליקה
QIAzol Lysis Reagent Qiagen79306מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין
מאגר RLTQiagen79216מאגר כביסה 1
מאגר RWTמאגר כביסה Qiagen10679332
ערכת miScript II RT Qiagen218161כולל 10 פעמים; תערובת גרעינים המכילה דאוקסינוקלאוטידים, ריבונוקלאוטידים טריפוספטים ופריימרים אוליגו-dT; miScript Reverse Transcriptase Mix המכיל פולי (A) פולימראז וטרנסקריפטאז הפוך ו; מאגר miScript HiSpec
miScript ערכת PCR ירוקה SYBRQiagen218073כוללת QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix ו-miScript Universal Primer
RNU6-2 primer   QiagenMS00033740לא נחשף
miRNA-142-3p פריימרQiagenMS000314515'-UGUAGUGUUUCC
UACUUUAUGGA-3'   
פריימר miRNA-21-5pQiagenMS000090795'-UAGCUUAUCAG
ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
פריימרQiagenMS000038575'-AGCUACAUUGU
CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
פריימרQiagenMS000333205'-UGUCAGUUUG
פריימר UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
פריימרQiagenMS000033185'-UGGCAGUGUCU
UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
פריימרQiagenMS000008055'-CCUUGAGGGG
CAUGAGGGU-3'MicroAmp
96 צלחת תגובה באר עבור qRT-PCRתרמו פישר 431681396 בארות צלחת
תגובה מיקרואמפ סרט דבק אופטי Thermo Fisher Scientific4311971לצלחת תגובה של 96 בארות
QuantStudio 12K Flex Flex מערכת PCR בזמן אמתThermo Fisher Scientific4472380מכשיר PCR בזמן אמת
QuantStudio 12K Flex תוכנה גרסה 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת
methylglyoxalSigma-AldrichM0252
MidpericTerumoלא מוקצה נוזל דיאליזה פריטונאלי
Sprague– חולדות דוליSLCלא מוקצה 
אופטי סרט דבק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
  2. Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
  3. Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
  4. Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
  5. Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
  6. Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
  7. Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
  8. Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
  9. Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005(2014).
  10. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  11. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  12. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  13. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  14. Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, Suppl 4. S22-S42 (2000).
  15. Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
  16. Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
  17. Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate? BMC Genomics. 6, 59(2005).
  18. Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data--is it really necessary? Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicroRNA ExpressionQuantitative Real time PCRPeritoneal MembraneRNA PurificationReverse TranscriptionmiRNA DetectionPeritoneal FibrosisRat ModelTotal RNA IsolationqRT PCR Protocol

מאמרים קשורים