אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצה קטנה של תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני, גרימת תגובה מערכתית כדי גידול ורבייה. בשנת חרקים, בלוטת prothoracic הזחל (PG) ואת התפקידים החיוניים השחלה משחק הנקבה הבוגרת ב biosynthesizing ההורמונים הסטרואידים העיקרי שנקרא ecdysteroids. אברי ecdysteroidogenic אלה מעוצבבים ממערכת העצבים, שדרכו עיתוי ביוסינתזה מושפעת לגירויים סביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמית איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם זחלים ומבוגרים של זבוב הפרות תסיסנית, אשר מספקת מערכת מודל מתאימה ללימוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. דיסקציה מיומנת מאפשרת לנו לשמור על העמדות של איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל המוח, חוט עצב הגחון, ורקמות אחרות. Immunostaining עםntibodies נגד אנזימי ecdysteroidogenic, יחד עם חלבוני קרינה מהונדסים מונעים על ידי יזמי רקמות ספציפיות, זמינה לתייג תאי ecdysteroidogenic. יתר על כן, innervations של איברי ecdysteroidogenic יכול גם להיות מתויג על ידי נוגדנים ספציפיים או אוסף של נהגי GAL4 בסוגים שונים של נוירונים. לכן, איברי ecdysteroidogenic והקשרים העצביים שלהם ניתן דמיינו בו זמנית על ידי immunostaining וטכניקות מהונדסות. לבסוף, אנו מתארים כיצד לחזות תאי גזע germline, אשר התפשטות ותחזוקה נשלטים על ידי ecdysteroids. שיטה זו תורמת להבנה מקיפה של ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולטורים העצבי שלו.
מבוא
בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצת תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני כי הוא חיוני לגוף כולו. כדי למלא את משימותיהם, בכל רקמה או איבר מבטא שורה של גנים הקשורים לתפקידם ומתקשרת עם רקמות אחרות לתזמר את פעילותם בהקשר של פיתוח. כדי לאפיין פונקציות הסלולר מיוחדות כגון ואינטראקציות בין-איבר, אנו צריכים לציין קבוצת התאים יחד עם סוגים אחרים של תאי אצלינו שלמים בארכיטקטורה הרבה-התאית.
דוגמא אחת של איברים מיוחדים כגון היא איבר steroidogenic, שבו אנזימי biosynthetic רבים לתווך שלבי ההמרה מכולסטרול להורמוני סטרואידים פעילים 1. רוב גני אנזימי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.
1. דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל (RG)
הערה: D. melanogaster, השייכת Diptera cyclorrhaphous, האחריות ההורית היא שבתוך איבר האנדוקרינית מורכב הנקרא בלוטת טבעת (RG, איור 2D). מאז היא בלתי ישימה כי PG מופרד בניתוח מסוגים אחרים של תאים (נדון בהמשך), מטרה מעשית היא לבודד RG שלם, שלא נפגעו לנתיחה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להמחיש איברי steroidogenic ואיברים האינטרקטיוויים שלהם אצל נשי זחלי melanogaster ד ו בוגרת. בראייה הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.
RG, כולל PG (איור 2 ד), הוא קטן יותר ושקוף יותר במוח והוא ממוקם בצד-הגבה הקדמי של המוח (איור 2 א-ג ו 3A-E). כדי לתייג את תאי PG, מספר קבוצות יצרו סוגים שונים של נוגדנים כנגד אנזימי ecdysteroidogenic (כלומר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
למדנו ביוסינתזה ecdysteroid מנגנון הרגולציה שלה ב ד melanogaster, ועבדתי פרוטוקול לנתיחת immunostaining. התזמון של ביוסינתזה ecdysteroid מושפע לגירויים סביבתיים באמצעות תשומות עצביות 33, כך שחיוני לשמר את העצבוב של איברי ecdysteroidogenic יחד עם המוח, VNC, ורקמות אחרות במהלך לנתיחה.
כפי שתואר לעיל, ד melanogaster PG יוצר RG איבר האנדוקרינית מורכבת עם allata corpora (CA) ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים רייקו כסא ו Tomotsune Ameku לתמיכה הטכנית שלהם עבור עבודה זו. אנחנו גם מודה Kei איטו, אולגה Alekseyenko, אקיקו קוטו, מסאיוקי מיורה, מרכז במלאי Bloomington תסיסנית, קיוטו לניירות מרכז (DGRC), והבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma עבור מניות ריאגנטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים YSN מן JSPs KAKENHI גרנט מספר 16K20945, קרן נאיטו, ו Inoue מדע ומחקר פרס; ועל ידי מענק RN מ MEXT KAKENHI גרנט מספר 16H04792.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <צלחת >איסוף ביצים > | |||
| תרבית רקמות חזקות (55 מ"מ) | AS ONE | 1-8549-02 | לכוס איסוף צלחות אגר מיץ ענבים |
| HIKARI KAGAKU | |||
| ממרח שמרים | יבשים מזרחיים, טוקיו | ||
| 100% מיץ ענבים | Welch Food Inc. | ||
| <זחלי גידול חזקים> | |||
| קטנים (12 מ"ל, 40 פעמים; 23.5 מ"מ, נ.ב) | SARSTEDT | 58.487 | |
| לולאה חד פעמית | AS ONE | 6-488-01 | |
| מזון | הקבל אותנו באתר האינטרנט של מרכז המניות של בלוינגטון. | ||
| מיקרוסקופ <חזק>דיסקציה | |||
| חיתוך | קרל זייס | סטמי 2000-C | |
| מיקרוסקופ ניתוח | Leica | S8 AP0 | |
| צלחת תרבית רקמות (35 x 10 מ"מ, לא מטופל) | IWAKI | 1000-035 | |
| סילגארד | TORAY | סיליקון קוארטינג בתוך כלים | |
| מחט טרומו (27 גרם, 0.40 x 19 מ"מ) | TERUMO | NN-2719S | "סכין" לחיתוך מלקחיים לרקמות |
| , Inox, #5 | Dumont, שוויץ | ||
| סיכת חרקים (קוטר 0.18 מ"מ) | מותג Shiga | למספריים מיקרו לחיתוך פילה | |
| NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | ||
| <חזק>קיבוע | |||
| אולטרה-טהורים | Merck Millipore | ||
| phosphate Buffered Salt (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| מיקרו-צינורות (1.5 מ"ל) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| <חזק>דגירה | |||
| כמערבל סוויסט אחד TM-300 (נדנדה)כאחד | נדנדה | TM-300 | |
| בקר סרום אלבומין | SIGMA | 9048-46-8 | |
| <נוגדן חזק>ראשוני | |||
| anti-Sro (שרקן ניסיונות), 1:1000 | |||
| anti-GFP (ארנב), 1:1000 | בדיקות מולקולריות | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (עכבר mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (ארנב), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (עכבר) | מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (חולדה), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (עכבר), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| <נוגדן חזק>משני | |||
| עז נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 488 מצומד | Life Technologies | A-11001 | |
| נוגדן משני נגד עכברים IgG (H+L), Alexa Fluor 546 Conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| נוגדן משני נגד חזיר ניסיונות IgG (H+L), Alexa Fluor 555 מצומד | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 פלואידין מצומד | בצבע חיים טכנולוגיות | A-22283 | |
| <ריאגנטים חזקים>הרכבה | |||
| מיקרו | זכוכית Matsunami Glass Ind., Ltd. | SS7213 | |
| כיסוי מיקרוסקופ מרובע זכוכית | Matsunami Glass Ind., Ltd. | מגיב C218181 | |
| FluorSave (מגיב הרכבה) | Calbiochem | 345789 | |
| העברת פיפטה 1 מ"ל (טפטפת חד פעמית) | WATSON | 5660-222-1S | |
| <חזק>הדמיה | |||
| LSM700 מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזר | קרל זייס | הפוכה Axio Observer. Z1 SP שמאל | |
| <חזק>עיבוד תמונה | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | זהו ממשק משתמש מיוחד המבוסס על מערכת ההפעלה 64 סיביות Microsoft Windows7 | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#46260) | ||
| כטב"מים– GFP; כטב"מים– mCD8::GFP | מתנות מ-K. Ito, אוניברסיטת טוקיו. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | ראה ב-Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & קרביץ, א. א. (2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#51941) |
מקורות
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
