Method Article

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות תסיסנית

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצה קטנה של תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני, גרימת תגובה מערכתית כדי גידול ורבייה. בשנת חרקים, בלוטת prothoracic הזחל (PG) ואת התפקידים החיוניים השחלה משחק הנקבה הבוגרת ב biosynthesizing ההורמונים הסטרואידים העיקרי שנקרא ecdysteroids. אברי ecdysteroidogenic אלה מעוצבבים ממערכת העצבים, שדרכו עיתוי ביוסינתזה מושפעת לגירויים סביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמית איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם זחלים ומבוגרים של זבוב הפרות תסיסנית, אשר מספקת מערכת מודל מתאימה ללימוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. דיסקציה מיומנת מאפשרת לנו לשמור על העמדות של איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל המוח, חוט עצב הגחון, ורקמות אחרות. Immunostaining עםntibodies נגד אנזימי ecdysteroidogenic, יחד עם חלבוני קרינה מהונדסים מונעים על ידי יזמי רקמות ספציפיות, זמינה לתייג תאי ecdysteroidogenic. יתר על כן, innervations של איברי ecdysteroidogenic יכול גם להיות מתויג על ידי נוגדנים ספציפיים או אוסף של נהגי GAL4 בסוגים שונים של נוירונים. לכן, איברי ecdysteroidogenic והקשרים העצביים שלהם ניתן דמיינו בו זמנית על ידי immunostaining וטכניקות מהונדסות. לבסוף, אנו מתארים כיצד לחזות תאי גזע germline, אשר התפשטות ותחזוקה נשלטים על ידי ecdysteroids. שיטה זו תורמת להבנה מקיפה של ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולטורים העצבי שלו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצת תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני כי הוא חיוני לגוף כולו. כדי למלא את משימותיהם, בכל רקמה או איבר מבטא שורה של גנים הקשורים לתפקידם ומתקשרת עם רקמות אחרות לתזמר את פעילותם בהקשר של פיתוח. כדי לאפיין פונקציות הסלולר מיוחדות כגון ואינטראקציות בין-איבר, אנו צריכים לציין קבוצת התאים יחד עם סוגים אחרים של תאי אצלינו שלמים בארכיטקטורה הרבה-התאית.

דוגמא אחת של איברים מיוחדים כגון היא איבר steroidogenic, שבו אנזימי biosynthetic רבים לתווך שלבי ההמרה מכולסטרול להורמוני סטרואידים פעילים 1. רוב גני אנזימים אלה באים לידי ביטוי במיוחד איברי steroidogenic, ואת המסלול ביוסינתזה מוסדר בחוזקה על ידי גירויים חיצוניים רבים באמצעות תשומות לחות ואת תשומות עצביות. פַּעַםהורמונים מסונתזים, סטרואידים מופרשים לתוך hemolymph ו ממוקדים רבות רקמות ואיברים להסדרת הביטוי במגוון של גנים 2. לכן, הפעולה של הורמון סטרואידים גורמת לתגובה מערכתית לשמור על הומאוסטזיס, צמיחה, רבייה.

כדי לחקור את הפונקציות של ביוסינתזה הורמון סטרואידי והפעולות pleiotropic של הורמונים סטרואידים, תסיסנית יכול להיות מנוצל כמערכת מודל מתאים. במהלך שלבי הזחל, הורמון סטרואידי חרקים, ecdysteroid, הוא biosynthesized באיבר האנדוקרינית מיוחד הנקרא בלוטת prothoracic (PG) 3. בשנות ה PG, מספר אנזימים ecdysteroidogenic במיוחד לזרז את הצעדים המרה מרובות מכולסטרול כדי ecdysone, השולטת השרה ואת המטמורפוזה בשלבים התפתחותיים המתאים 4. לכן, שינוי דינמי כייל ecdysteroid מוסדרעל ידי מסלולי איתות רבים בתגובה לגירויים סביבתיים. מצד שני, בשלב הבוגר, ecdysteroid ממלא תפקידים חיוניים פיזיולוגיה, כולל רבייה, שינה, זיכרון, ואת תוחלת החיים 5, 6, 7, 8. זה ידוע כי ecdysteroid הוא biosynthesized פעיל בשחלה, המסדיר את התקדמות oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. לאחרונה דיווחנו כי מספר תאי גזע germline (GSCs) מושפע איתות פפטיד ecdysteroid ומין בתגובה ההזדווגות לגירויים 12.

כלי רב עצמה של ד melanogaster גנטיקה וביולוגיה תאית, כולל מידע הגנום היטב מבואר, גן בינארימערכות ביטוי, וטכניקות RNAi מהונדסות, אפשרו לנו לזהות גנים חיוניים ecdysteroid ביוסינתזה של PG ואת 13 השחלה, 14, 15. לאחר גני ecdysteroidogenic מזוהים, רגולצית התעתיק של גנים אלה ואת localizations הדינמית של מוצרי גן יכולה להיבחן במסלול ביוסינתזה 16. לשם כך, כמוני-הפוך שעתוק-PCR, RNA כלאה באתרו, וניתוח immunohistological מתנהלת. היישום של טכניקות אלה כולל משימה מאתגרת; לנתיחה המשוכללת של PG או השחלה. בפרט, PG של זבוב הפירות הוא קטן יחסית לזה של חרקים אחרים (למשל תולעי משי ואת הזבוב מכה), כך אחד צריך לתרגל את מיומנות חיונית של זבוב הפירות דיסקציה לדגימה. יתר על כן, איברי ecdysteroidogenic שניהם מקבלים עצבובים ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 17, 18, 19, 20. לפיכך, עבור ניתוחים אנטומיים מדויקים, איברי ecdysteroidogenic צריכים להישמר ללא פגע יחד עם CNS ואיברים אחרים, לא לשבש קשרים העצביים שלהם.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לנתיחה ו להדמיה של איברים steroidogenic ברה. melanogaster. לימוד הטכניקה לנתיחה הוא נקודת מוצא המפתח עבור ניסויים אלה. בנוסף, אפשר לסמן את איברי steroidogenic בהצלחה, כמו גם האיברים האינטרקטיוויים שלהם עם מספר נוגדנים וקווי נהג GAL4. ניצול טכניקות אלה, החומרים, ואת הגנטיקה, אחד יכול ללמוד את המנגנונים המקיפים של ביוסינתזה הורמון סטרואידים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.

1. דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל (RG)

הערה: D. melanogaster, השייכת Diptera cyclorrhaphous, האחריות ההורית היא שבתוך איבר האנדוקרינית מורכב הנקרא בלוטת טבעת (RG, איור 2D). מאז היא בלתי ישימה כי PG מופרד בניתוח מסוגים אחרים של תאים (נדון בהמשך), מטרה מעשית היא לבודד RG שלם, שלא נפגעו לנתיחה.

  1. הכנת הזחלים בשלבי התפתחותיים המתאימים
    הערה: כדי לסנכרן את שלבי ההתפתחות של זחלי melanogaster ד, יש צורך לאסוף ביצים בתוך חלון זמן צר לאסוף זחלים במועדים המתאימים.
    1. איסוף ביצים עבור 2 h על צלחת אגר ענבים מיץ ב 25 מעלות צלזיוס.
    2. אסוף שזה עתה בקע 1 הזחלים instar רח תחת מיקרוסקופ לנתח עם מלקחיים ולהעבירם בקבוקון קטן המכיל מחית שמרים רגיל / קמח תירס אוכל לטוס.
      הערה: הגיל של זחלים מיוצגים על ידי "שעות לאחר הטלה (hAEL)", "שעות לאחר בוקעים (הא)", או "שעות לאחר אכדיסיס L3 (hAL3E)".
    3. באותה נקודת הזמן המתאימה, לאסוף את הזחלים המבוימים עם לולאת פלסטיק חד פעמית, כדי למנוע פגיעה בלתי רצויה. כדי למזער את ההבדל התקדמות התפתחותית של הזחלים 3 rd instar, לאסוף את הזחלים instar 2 nd ב 70 hAEL (48 הא) ולאפשר להם להשיר ב 2 מרווחי h. ואז, לאסוף את הזחלים instar 3 rd בתוך 2 שעות לאחר אכדיסיס L3; הליך זה נותן 0-2 זחלי hAL3E.
    4. מעביר את הזחלים המבוימים לצלחת המלאה בופר פוספט (PBS).
    5. יש לשטוף את הזחלים עם PBS להסיר מזון שיורית מהגוף.
  2. דיסקציה גס של זחלים תחתמיקרוסקופ לנתח
    1. החזק את הקרס בפה של זחל עם מלקחיים. סבר גוף הזחל על השליש הקדמי של אורך הגוף באמצעות מספרי מייקרו.
    2. החזק את הקצוות של גוף הזחל הקדמי עם זוג אחד של מלקחיים. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, בעדינות לדחוף את קצה הראש לכיוון החלק הפנימי של הגוף; הליך זה הופך את גוף הזחל מבפנים החוצה.
      הערה: שלב זה ניתן לדלג לנתיחה של 1 st instar הזחלים.
    3. חזור על שלבי 1.2.1-1.2.2 עם זחלים נוספים למשך 5-10 דקות.
      הערה: מספר הזחלים צריך להיות שווה או פחות מ 20 כדי לחסוך זמן לנתיחה.
  3. דיסקציה פילה של זחלים
    הערה: שיטה זו מאפשרת שמירה על מעמדה של רקמות להישאר ללא פגע.
    1. השאר זחלים במים רק 1 h. הזחלים הם משותקים כתוצאה מחנק.
    2. שים בצד הגבה זחל עד לירידה של PBS על סיליקון מצופהצלחת, עם למעלה בצד הגבי שלה.
      הערה: הצד הגבי יש 2 צינורות לקנה הנשימה ריצה אורכית.
    3. תחת מיקרוסקופ לנתח, להכניס סיכה חרקה לתוך הקצה הקדמי של הזחל באמצעות מלקחיים. מתח את גוף הזחל אל הצד האחורי ולשים סיכה שנייה לתוך הקצה האחורי של הזחל.
      הערה: בנוסף סיכות חרקים, מחט עשוי תיל טונגסטן יכול להיות שימושי 21. מחט יכול להיות מוטבע קצה פיפטה באמצעות חימום לשימוש בתור איזמל מנתחים.
    4. תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך קטן ליד הזנב עם מספריים מיקרו. מן החתך, לחתוך לציפורן הגב אורכית לאורך קו האמצע הגב לכיוון הראש. היזהר לא לפגוע ברקמות תחת לציפורן.
    5. למתוח את העור מת bodywall בכל צד ומקום 4 סיכות בכל פינה של bodywall הגזור.
    6. סור חלק גוף שומן קדמי עם מלקחיים, לחשוף את ג המוח-RGomplex להיחשף על פני השטח. הסר זוג בלוטות הרוק, במידת הצורך.
  4. קיבוע וצביעת רקמות עם אימונוהיסטוכימיה
    1. שים את השליש הקדמי של גופי הזחל (שלב 1.2.2) לתוך microtube 1.5 מיליליטר מלא 500 μL הפתרון לתקן (paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS). תקן פחות מ 20 דגימות בעת ובעונה אחת, אחרת PBS מצורפת דגימות הקבועות עלולים לגרום לדילול שלילי של המקבע. לנתיחת פילה, להסיר ירידה של PBS ולאחר מכן להוסיף טיפה של פתרון לתקן.
      הערה: פתרון תיקון, או 3.7% פורמלדהיד או 4% paraformaldehyde עשוי לשמש.
    2. דגירת הרקמות הגזורות פתרון התיקון 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או לחלופין עבור 2 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. החלף את הפתרון לתקן עם 500 μL PBS ובמהירות לשטוף דגימות 3 פעמים. שטפו את דגימות עם 500 PBT 0.3% μL (ethoxylate octylphenol PBS + 0.3%) עבור 15 דקות על כיסא נדנדה ב Rט לנתיחה פילה, להסיר את הסיכות חרקים ולהעביר דגימות לתוך microtube 1.5 מ"ל.
      הערה: להגדלת החדירות של נוגדנים לתוך רקמות, דגימות מטופלים עם 500 μL 2.0% PBT במשך 1-2 שעות על כיסא נדנדה ב RT.
    4. החלף PBT עם 500 μL פתרון לחסימת (2% אלבומין בסרום שור ב PBT). דגירה דגימות עבור 1.5 h על כיסא נדנדה ב RT.
    5. החלף את הפתרון החוסם עם 50 μL פתרון הנוגדן הראשוני, הנוגדנים כלומר מדולל הפתרון החוסם.
    6. דגירת דגימות לילה על כיסא נדנדה ב 4 ° C..
    7. החלף את פתרון הנוגדן הראשוני עם 500 μL 0.3% PBT ובמהירות לשטוף הדגימות 5 פעמים. שטפו את דגימות 3 פעמים עם 500 0.3% PBT μL עבור 15 דקות כל אחד על כיסא נדנדה ב RT.
    8. חלף PBT 0.3% עם 50 μL פתרון נוגדנים משני (הנוגדנים מצומדות צבע מדולל הפתרון החוסם). מכתים גרעיני, 0.5 μL 4' , 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.1 מ"ג / מ"ל ​​פתרון המניות) מתווסף 50 פתרון μL. דגירת הדגימות על כיסא נדנדה עבור 2 שעות ב RT ולחלופין על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: שמור את הדגימות בחושך.
    9. החלף את פתרון הנוגדן עם 500 μL 0.3% PBT ולשטוף 5 פעמים. שטפו את דגימות 3 פעמים עם 500 0.3% PBT μL עבור 15 דקות כל אחד ב RT.
  5. דיסקציה פיין של המתחם המוח-RG המכיל את PG ו הרכבה
    1. השתמש pipet פנויה להעביר דגימות immunostained לצלחת מלאה 0.3% PBT.
      הערה: כדי למנוע בועות נוחות במהלך דיסקציה ההרכבה, 0.3% PBT יכול להיות מוחלף עם PBS.
    2. תחת מיקרוסקופ לנתח, להחזיק את הקרס לציפורן או פה עם זוג אחד של מלקחיים. באמצעות מחט 27 G מצורפת מזרק מיליליטר 1 בתור "סכין", לחתוך את הקצה הקדמי של דיסקי ושט עין כדי להסיר את מורכבות דיסק המוח-RG-עין מן לציפורן גוף.
    3. SEPAלדרג הוושט בטן מהמתחם דיסק המוח-RG-העין עם מלקחיים. מאז הוושט עובר דרך המוח מעל חוט עצב הגחון (VNC), לשלוף את המעיים אל הצד האחורי.
      הערה: כדי להסיר דיסקים דמותי תוספת ממדגמים, לחתוך את הקשרים בין המוח, דיסקי עין, ואת דיסקי רגל עם סכין מחט.
    4. חזור על השלבים 1.5.1-1.5.4 עבור דוגמאות אחרות.
      הערה: כדי למנוע פסולת רקמות תידבק הדגימות, להעביר כל דגימה השלימה לצלחת נקיה שונה מלאה 0.3% PBT או PBS.
    5. העברת דגימות במרכז שקופית זכוכית נקייה עם micropipette.
      הערה: 2 nd או 3 rd instar הזחלים, סוף טיפ micropipette יש קטום עם סכין גילוח.
    6. תחת מיקרוסקופ לנתח, ליישר דגימות בודדות עם הצד הגבה שלהם עד באמצעות מלקחיים.
      הערה: RG ממוקמת בצד הגבי של המוח (איור 2 א). יישור זה מקל על המפרט של דגימות בודדות במהלך ההדמיה.
    7. הטה שקופית זכוכית לקנח כמה שיותר PBT עודף ככל האפשר. שים טיפת ריאגנט הרכבה בצד של השקופית. מניחים את קצה להחליק כיסוי מהצד השני של טיפה ולשים את הפתק לכסות על דגימות לאט עם מלקחיים.
      הערה: הליך זה מונע את הדגימות מן נע מחוץ להחליק את המכסה.
    8. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור את הדגימות בחושך.

2. דיסקציה של השחלה ב נשים בוגרות

  1. הכנת נשים בוגרות
    1. נקבת עדכוני טס עם אוכל לטוס שמרים / קמח תירס רגיל במשך 3-4 ימים כדי לפטם את השחלה. שמרו על 25 מעלות צלזיוס.
  2. דיסקציה של השחלה הנקבה הבוגרת
    1. נקבה להרדים טס עם גז CO 2 ו לערוף ראשים שלהם.
    2. עבר גופי זבוב בצלחת 3 סנטימטריםמלא PBS.
    3. תחת מיקרוסקופ לנתח, להחזיק את החזה בצד הגבה באמצעות מלקחיים. תפוס את A5 קטע הבטן או A6 עם המלקחיים האחרים לקלף לציפורן הבטן כלפי הצד האחורי. לקנח לציפורן הדביקה מקצה המלקחיים.
    4. צביטת oviduct ולהוציא את השחלה מהגוף.
    5. מסרק להפיץ את הטיפים של השחלה עם מלקחיים.
      הערה: פעולה זו משפרת את היעילות של immunostaining.
  3. דיסקציה של המוח הנשי הבוגר, VNC ועל איברי הרבייה.
    הערה: שיטה זו מאפשרת העצבוב של השחלה כדי להישמר ללא פגע.
    1. להרדים הנשי טס עם גז CO 2 ולהעבירם צלחת מצופה סיליקון מלא PBS.
    2. תחת מיקרוסקופ לנתח, להחזיק את החוטם לקלף את העור מת הראש כדי לחשוף את המוח עם מלקחיים. הסר את קנה הנשימה המחובר למוח.
      הערה: brain הוא מבנה לבן מעוגל. המוח מתחבר VNC בבית החזה.
    3. החזק את החזה בצד הגבה ולנתק את הרגליים וכנפיים עם זוג אחד של מלקחיים. באמצעות הזוג האחר של מלקחיים, לקלף את העור מת חזה גחון מבסיסי הרגליים. לאחר VNC חשוף, להסיר את העור המת הגב שיורית השרירים המחוברים באמצעות מלקחיים VNC. היזהר שלא לפגוע בקשר בין המוח לבין VNC.
    4. שימוש במלקחיים לקלף לציפורן הבטן ולחשוף את השחלה והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל נוירונים, היבול, במעיים, השחלה, הרחם, ואת בלוטת accessary.
    5. הסר את הרקמות שיורית כולל קנה הנשימה וגוף השומן באמצעות מלקחיים.
  4. קיבוע וצביעת רקמות עם אימונוהיסטוכימיה
    1. העבר כ 8-10 זוגות של השחלות אל microtube 1.5 מ"ל מלא 250 μL הפתרון לתקן (4% paraformaldehyde ב PBS) דגירה דגימות עבור 30 דקות ב RT.
    2. החלף את הפתרון לתקן עם 500 μL PBS ובמהירות לשטוף דגימות 3 פעמים.
    3. שטפו את דגימות 2 פעמים עם 500 μL 0.1% PBT במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
    4. החלף PBT עם 50 μL חסימת פתרון. דגירה דגימות עבור 1 h על כיסא נדנדה ב RT.
    5. החלף את הפתרון החוסם עם 50 μL פתרון הנוגדן הראשוני.
    6. דגירת דגימות לילה על כיסא נדנדה ב 4 ° C..
    7. החלף את פתרון הנוגדן הראשוני עם 500 μL 0.1% PBT. שטפו את דגימות 3 פעמים עם 500 0.1% PBT μL עבור 15 דקות כל אחד על כיסא נדנדה ב RT.
    8. חלף PBT 0.1% עם 50 μL פתרון נוגדנים משני. מכתים גרעיני, להוסיף 0.5 μL DAPI כדי 50 μL הפתרון. דגירה דגימות עבור 2 h על כיסא נדנדה ב RT.
    9. החלף את הפתרון נוגדנים משני עם 500 μL 0.1% PBT. שטפו את דגימות 3 פעמים עם 500 PBT 0.1% μL עבור 15 דקות כל אחד על כיסא נדנדה ב RT.
      הערה: הליך הכביסה יכול להיעשות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. שמור את הדגימות בחושך.
  5. הרכבת הדגימות בשקפי זכוכית
    1. העברת דגימות שקופית זכוכית עם 0.1% PBT באמצעות micropipette.
      הערה: כדי למנוע בועות נוחות במהלך דיסקציה ההרכבה, 0.1% PBT יכול להיות מוחלף עם PBS.
    2. עבור השחלה, להפריד בין מחרוזות של ovarioles זה מזה עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתח. לא לפצוע את העצות של ovarioles המכיל את germaria. למתחם איבר המוח-VNC-רבייה, להסיר את העור המת שיורית ולסדר את העמדה בשקופית זכוכית.
    3. לקנח כמו הרבה עודף PBT ככל האפשר לשים טיפה של ריאגנט הרכבה במרכז הדגימות. במקום להחליק לכסות באמצעות מלקחיים לאט.
    4. אחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס. שמור את הדגימות בחושך.
"> 3. הדמיה עם מיקרוסקופ סורק לייזר Confocal

  1. שים דגימות תחת מיקרוסקופ ולהביא את האיברים steroidogenic בתחום הראייה. לאחר מבט קבוע, להחליף את מערכת ההדמיה למצב רכישת התמונה.
    הערה: 10-20X העדשות האובייקטיביות נועדו כדי להשיג את התמונות של מתחם המוח-RG או כל השחלה. לחלופין, 40-63X העדשות האובייקטיביות (מים או טבילת שמן) משמשות לדמיין את לוקליזציה subcellular של חלבונים ב GSCs או innervations העצבית של PG ואת השחלה.
  2. הגדרת הפרמטרים של רכישת תמונה על התוכנה המצורפת. בחר את השילוב של קרינה (GFP למשל ו RFP). על ידי הליך סריקה מהירה, להתאים את כוח לייזר, הרגישות של גלאי (רווח / אופסט), ואת גודל של חריר.
    הערה: כדי לרכוש תמונות באיכות גבוהה, כוח לייזר סריקה ואת הרגישות של גלאי (רווח) צריך להיות מותאם עבור כל דגימה. כדי לשרטט את הצורהשל הרקמות, תמונת אור מועבר ניתן לקחת בנוסף תמונת פלורסנט.
  3. קח ערימות Z של תמונות. במהלך סריקה מהירה מתמשך, להזיז את מישור המוקד עם כונן מוקד מיקרוסקופ ולהגדיר את נקודת ההתחלה ואת עמדת הקצה. מספר הפרוסות ומרחק המרווח בין הפרוסות מותאמים בהתאם.
  4. בחר את מהירות הסריקה, שיטת הסריקה, ואת מצב סריקה דו כיוונית.
  5. "התחל את הסריקות האמיתיות" לרכישת תמונה.
  6. שמור את התמונה עם הפורמט של התוכנה המצורפת.
    הערה: קבצי התמונה המקוריים להכיל את המידע של פרמטרי רכישת תמונה וקשקשת. תמונות מיוצאות יכולות להיות מעובד באמצעות תוכנת עיבוד תמונה במחשב 22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להמחיש איברי steroidogenic ואיברים האינטרקטיוויים שלהם אצל נשי זחלי melanogaster ד ו בוגרת. בראייה הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.

RG, כולל PG (איור 2 ד), הוא קטן יותר ושקוף יותר במוח והוא ממוקם בצד-הגבה הקדמי של המוח (איור 2 א-ג ו 3A-E). כדי לתייג את תאי PG, מספר קבוצות יצרו סוגים שונים של נוגדנים כנגד אנזימי ecdysteroidogenic (כלומר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למדנו ביוסינתזה ecdysteroid מנגנון הרגולציה שלה ב ד melanogaster, ועבדתי פרוטוקול לנתיחת immunostaining. התזמון של ביוסינתזה ecdysteroid מושפע לגירויים סביבתיים באמצעות תשומות עצביות 33, כך שחיוני לשמר את העצבוב של איברי ecdysteroidogenic יחד עם המוח, VNC, ורקמות אחרות במהלך לנתיחה.

כפי שתואר לעיל, ד melanogaster PG יוצר RG איבר האנדוקרינית מורכבת עם allata corpora (CA) ו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים רייקו כסא ו Tomotsune Ameku לתמיכה הטכנית שלהם עבור עבודה זו. אנחנו גם מודה Kei איטו, אולגה Alekseyenko, אקיקו קוטו, מסאיוקי מיורה, מרכז במלאי Bloomington תסיסנית, קיוטו לניירות מרכז (DGRC), והבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma עבור מניות ריאגנטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים YSN מן JSPs KAKENHI גרנט מספר 16K20945, קרן נאיטו, ו Inoue מדע ומחקר פרס; ועל ידי מענק RN מ MEXT KAKENHI גרנט מספר 16H04792.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<צלחת >איסוף ביצים >
תרבית רקמות חזקות (55 מ"מ)AS ONE1-8549-02  לכוס איסוף צלחות אגר מיץ ענבים
HIKARI KAGAKU
ממרח שמריםיבשים מזרחיים, טוקיו
100% מיץ ענביםWelch Food Inc.
<זחלי גידול חזקים>
קטנים (12 מ"ל, 40 פעמים; 23.5 מ"מ, נ.ב)SARSTEDT58.487
לולאה חד פעמיתAS ONE6-488-01
מזון  הקבל אותנו באתר האינטרנט של מרכז המניות של בלוינגטון.
מיקרוסקופ <חזק>דיסקציה
חיתוךקרל זייססטמי 2000-C
מיקרוסקופ ניתוחLeicaS8 AP0
צלחת תרבית רקמות (35 x 10 מ"מ, לא מטופל)IWAKI1000-035
סילגארדTORAYסיליקון קוארטינג בתוך כלים
מחט טרומו (27 גרם, 0.40 x 19 מ"מ) TERUMONN-2719S"סכין" לחיתוך מלקחיים לרקמות
, Inox, #5Dumont, שוויץ
סיכת חרקים (קוטר 0.18 מ"מ)מותג Shigaלמספריים מיקרו לחיתוך פילה
NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
<חזק>קיבוע
אולטרה-טהוריםMerck Millipore
phosphate Buffered Salt (PBS)
FormaldehydeNacalai tesque16222-65
ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
מיקרו-צינורות (1.5 מ"ל)INA OPTIKACF-0150
<חזק>דגירה
כמערבל סוויסט אחד TM-300 (נדנדה)כאחדנדנדהTM-300
בקר סרום אלבומיןSIGMA9048-46-8
<נוגדן חזק>ראשוני
anti-Sro (שרקן ניסיונות), 1:1000
anti-GFP (ארנב), 1:1000בדיקות מולקולריותA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (עכבר mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (ארנב), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (עכבר)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)1B1
anti-DE-cadherin (חולדה), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (עכבר), 1:50DSHBnc82
<נוגדן חזק>משני
עז נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesA-11008
נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 488 מצומדLife TechnologiesA-11001
נוגדן משני נגד עכברים IgG (H+L), Alexa Fluor 546 ConjugateLife TechnologiesA-11081
נוגדן משני נגד חזיר ניסיונות IgG (H+L), Alexa Fluor 555 מצומדLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 פלואידין מצומדבצבע חיים טכנולוגיותA-22283
<ריאגנטים חזקים>הרכבה
מיקרוזכוכית Matsunami Glass Ind., Ltd.SS7213
כיסוי מיקרוסקופ מרובע זכוכיתMatsunami Glass Ind., Ltd.מגיב C218181
FluorSave (מגיב הרכבה)Calbiochem345789
העברת פיפטה 1 מ"ל (טפטפת חד פעמית)WATSON5660-222-1S
<חזק>הדמיה
LSM700 מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזרקרל זייסהפוכה Axio Observer. Z1 SP שמאל
<חזק>עיבוד תמונה
LSM700 ZENCarl Zeissזהו ממשק משתמש מיוחד המבוסס על מערכת ההפעלה 64 סיביות Microsoft Windows7
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#46260)
כטב"מים– GFP; כטב"מים– mCD8::GFPמתנות מ-K. Ito, אוניברסיטת טוקיו.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4ראה ב-Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & קרביץ, א. א. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#51941)
חזקות זבובים סטנדרטי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32(2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778(2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806(2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila MelanogasterSteroidogenic OrgansImmunostaining ProtocolLarval DissectionOvary VisualizationBrain Ring GlandEcdysteroid BiosynthesisGermline Stem CellsNeuronal InnervationFluorescent Labeling

Related Articles