Method Article

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות תסיסנית

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצה קטנה של תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני, גרימת תגובה מערכתית כדי גידול ורבייה. בשנת חרקים, בלוטת prothoracic הזחל (PG) ואת התפקידים החיוניים השחלה משחק הנקבה הבוגרת ב biosynthesizing ההורמונים הסטרואידים העיקרי שנקרא ecdysteroids. אברי ecdysteroidogenic אלה מעוצבבים ממערכת העצבים, שדרכו עיתוי ביוסינתזה מושפעת לגירויים סביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמית איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם זחלים ומבוגרים של זבוב הפרות תסיסנית, אשר מספקת מערכת מודל מתאימה ללימוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. דיסקציה מיומנת מאפשרת לנו לשמור על העמדות של איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל המוח, חוט עצב הגחון, ורקמות אחרות. Immunostaining עםntibodies נגד אנזימי ecdysteroidogenic, יחד עם חלבוני קרינה מהונדסים מונעים על ידי יזמי רקמות ספציפיות, זמינה לתייג תאי ecdysteroidogenic. יתר על כן, innervations של איברי ecdysteroidogenic יכול גם להיות מתויג על ידי נוגדנים ספציפיים או אוסף של נהגי GAL4 בסוגים שונים של נוירונים. לכן, איברי ecdysteroidogenic והקשרים העצביים שלהם ניתן דמיינו בו זמנית על ידי immunostaining וטכניקות מהונדסות. לבסוף, אנו מתארים כיצד לחזות תאי גזע germline, אשר התפשטות ותחזוקה נשלטים על ידי ecdysteroids. שיטה זו תורמת להבנה מקיפה של ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולטורים העצבי שלו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצת תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני כי הוא חיוני לגוף כולו. כדי למלא את משימותיהם, בכל רקמה או איבר מבטא שורה של גנים הקשורים לתפקידם ומתקשרת עם רקמות אחרות לתזמר את פעילותם בהקשר של פיתוח. כדי לאפיין פונקציות הסלולר מיוחדות כגון ואינטראקציות בין-איבר, אנו צריכים לציין קבוצת התאים יחד עם סוגים אחרים של תאי אצלינו שלמים בארכיטקטורה הרבה-התאית.

דוגמא אחת של איברים מיוחדים כגון היא איבר steroidogenic, שבו אנזימי biosynthetic רבים לתווך שלבי ההמרה מכולסטרול להורמוני סטרואידים פעילים 1. רוב גני אנזימי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.

1. דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל (RG)

הערה: D. melanogaster, השייכת Diptera cyclorrhaphous, האחריות ההורית היא שבתוך איבר האנדוקרינית מורכב הנקרא בלוטת טבעת (RG, איור 2D). מאז היא בלתי ישימה כי PG מופרד בניתוח מסוגים אחרים של תאים (נדון בהמשך), מטרה מעשית היא לבודד RG שלם, שלא נפגעו לנתיחה.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להמחיש איברי steroidogenic ואיברים האינטרקטיוויים שלהם אצל נשי זחלי melanogaster ד ו בוגרת. בראייה הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1.

    RG, כולל PG (איור 2 ד), הוא קטן יותר ושקוף יותר במוח והוא ממוקם בצד-הגבה הקדמי של המוח (איור 2 א-ג ו 3A-E). כדי לתייג את תאי PG, מספר קבוצות יצרו סוגים שונים של נוגדנים כנגד אנזימי ecdysteroidogenic (כלומר.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    למדנו ביוסינתזה ecdysteroid מנגנון הרגולציה שלה ב ד melanogaster, ועבדתי פרוטוקול לנתיחת immunostaining. התזמון של ביוסינתזה ecdysteroid מושפע לגירויים סביבתיים באמצעות תשומות עצביות 33, כך שחיוני לשמר את העצבוב של איברי ecdysteroidogenic יחד עם המוח, VNC, ורקמות אחרות במהלך לנתיחה.

    כפי שתואר לעיל, ד melanogaster PG יוצר RG איבר האנדוקרינית מורכבת עם allata corpora (CA) ו.......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    אנו מודים רייקו כסא ו Tomotsune Ameku לתמיכה הטכנית שלהם עבור עבודה זו. אנחנו גם מודה Kei איטו, אולגה Alekseyenko, אקיקו קוטו, מסאיוקי מיורה, מרכז במלאי Bloomington תסיסנית, קיוטו לניירות מרכז (DGRC), והבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma עבור מניות ריאגנטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים YSN מן JSPs KAKENHI גרנט מספר 16K20945, קרן נאיטו, ו Inoue מדע ומחקר פרס; ועל ידי מענק RN מ MEXT KAKENHI גרנט מספר 16H04792.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    <צלחת >איסוף ביצים >
    תרבית רקמות חזקות (55 מ"מ)AS ONE1-8549-02  לכוס איסוף צלחות אגר מיץ ענבים
    HIKARI KAGAKU
    ממרח שמריםיבשים מזרחיים, טוקיו
    100% מיץ ענביםWelch Food Inc.
    <זחלי גידול חזקים>
    קטנים (12 מ"ל, 40 פעמים; 23.5 מ"מ, נ.ב)SARSTEDT58.487
    לולאה חד פעמיתAS ONE6-488-01
    מזון  הקבל אותנו באתר האינטרנט של מרכז המניות של בלוינגטון.
    מיקרוסקופ <חזק>דיסקציה
    חיתוךקרל זייססטמי 2000-C
    מיקרוסקופ ניתוחLeicaS8 AP0
    צלחת תרבית רקמות (35 x 10 מ"מ, לא מטופל)IWAKI1000-035
    סילגארדTORAYסיליקון קוארטינג בתוך כלים
    מחט טרומו (27 גרם, 0.40 x 19 מ"מ) TERUMONN-2719S"סכין" לחיתוך מלקחיים לרקמות
    , Inox, #5Dumont, שוויץ
    סיכת חרקים (קוטר 0.18 מ"מ)מותג Shigaלמספריים מיקרו לחיתוך פילה
    NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. MB-50-10
    <חזק>קיבוע
    אולטרה-טהוריםMerck Millipore
    phosphate Buffered Salt (PBS)
    FormaldehydeNacalai tesque16222-65
    ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
    Triton-X100Nacalai tesque35501-15
    מיקרו-צינורות (1.5 מ"ל)INA OPTIKACF-0150
    <חזק>דגירה
    כמערבל סוויסט אחד TM-300 (נדנדה)כאחדנדנדהTM-300
    בקר סרום אלבומיןSIGMA9048-46-8
    <נוגדן חזק>ראשוני
    anti-Sro (שרקן ניסיונות), 1:1000
    anti-GFP (ארנב), 1:1000בדיקות מולקולריותA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
    anti-GFP (עכבר mAb, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
    anti-5HT (ארנב), 1:500SIGMAS5545
    anti-Hts 1B1 (עכבר)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה (DSHB)1B1
    anti-DE-cadherin (חולדה), 1:20DSHBDCAD2
    anti-nc82 (עכבר), 1:50DSHBnc82
    <נוגדן חזק>משני
    עז נגד ארנב IgG (H+L), Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesA-11008
    נוגדן משני IgG (H+L) נגד עכבר עיזים, Alexa Fluor 488 מצומדLife TechnologiesA-11001
    נוגדן משני נגד עכברים IgG (H+L), Alexa Fluor 546 ConjugateLife TechnologiesA-11081
    נוגדן משני נגד חזיר ניסיונות IgG (H+L), Alexa Fluor 555 מצומדLife TechnologiesA-21435
    Alexa Fluor 546 פלואידין מצומדבצבע חיים טכנולוגיותA-22283
    <ריאגנטים חזקים>הרכבה
    מיקרוזכוכית Matsunami Glass Ind., Ltd.SS7213
    כיסוי מיקרוסקופ מרובע זכוכיתMatsunami Glass Ind., Ltd.מגיב C218181
    FluorSave (מגיב הרכבה)Calbiochem345789
    העברת פיפטה 1 מ"ל (טפטפת חד פעמית)WATSON5660-222-1S
    <חזק>הדמיה
    LSM700 מערכת מיקרוסקופ סריקת לייזרקרל זייסהפוכה Axio Observer. Z1 SP שמאל
    <חזק>עיבוד תמונה
    LSM700 ZENCarl Zeissזהו ממשק משתמש מיוחד המבוסס על מערכת ההפעלה 64 סיביות Microsoft Windows7
    ImageJ
    Fly stocks
    w; GMR45C06-GAL4  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#46260)
    כטב"מים– GFP; כטב"מים– mCD8::GFPמתנות מ-K. Ito, אוניברסיטת טוקיו.
    w[1118]
    w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
    w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4ראה ב-Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & קרביץ, א. א. (2010)
    w; UAS-mCD8::GFP  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#32188)
    yw;; nSyb-GAL4  ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#51941)
    חזקות זבובים סטנדרטי

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
    2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell.....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Drosophila MelanogasterSteroidogenic OrgansImmunostaining ProtocolLarval DissectionOvary VisualizationBrain Ring GlandEcdysteroid BiosynthesisGermline Stem CellsNeuronal InnervationFluorescent Labeling

    Related Articles