מאמר שיטה

במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

DOI:

10.3791/55529

⸱

21 במרץ 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GnRH-I ניאון שכותרתו סלקטיבי, -II ו -III נגזרים הם כלי אמין עבור מעקב וכימות ספיגת הסלולר שלהם. כתב יד זה מציג ניסויים כדי להמחיש, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH אלה שורות תאים שונות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנלוגים של GnRH הם moieties מיקוד יעיל ומסוגל לספק סוכני נגד סרטן באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר מאוד קולטני GnRH מפורשת. עם זאת, ניתוח כמותי של ספיגת הסלולר 'אנלוגים של GnRH ואת סוגי התאים נחקרו מערכות אספקת סמי GnRH המבוסס מוגבלים בשלב זה. בעבר הציגו, ניאון שכותרתו סלקטיבי GnRH לי, -II ו -III נגזר לספק detectability הגדול, ויש להם תכונות כימיות מתאימות לניסוי לשחזור ויציב. גם מצאנו כי שיטות עַדכָּנִי המתאימות עם אנלוגים של GnRH שכותרתו אלה יכולים להציע מידע רומן על מערכות אספקת סמים מבוססים GnRH. כתב יד זה מציג כמה ניסויים פשוטים ומהירים לגבי ספיגת הסלולר של [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-II ו [ליס 8 (FITC)] - GnRH -III על EBC-1 (ריאות), את BxPC-3 (לבלב) ועל t ממאיר דטרויט-562- (הלוע)תאי umor. במקביל conjugates GnRH-FITC הללו, הרמה פני התא של קולטני GnRH-נבדקה גם על שורות תאים אלה לפני ואחרי טיפול GnRH ידי מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal. ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC הייתה לכמת ידי מיון תא מופעל קרינה. בניסויים אלו הבדלים קלים בין אנלוגים של GnRH ואת ההבדלים עיקריים בין סוגי תאים נצפו. ההבדלים המשמעותיים בין שורות תאים מתואמים עם הרמה המובחנת של קולטני תא משטח GnRH-I. הניסויים הציגו לכלול שיטות מעשיות לדמיין, לכמת ולהשוות את היעילות הספיגה של conjugates GnRH-FITC בתוך הזמן- ואופן ריכוז-תלויים בתרביות תאים חסידות שונות. תוצאות אלו יכולות לחזות את יעילות מיקוד התרופה של conjugates GnRH על תרבית תאים הנתונה, ומציעות בסיס טוב עבור ניסויים נוספים בבדיקת מערכות אספקת סמים מבוסס GnRH.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פפטיד מערכות מבוססות שיגור תרופות הפכו פיתוח מהיר תחום מבטיח בטיפול בסרטן על 1 בשנים האחרונות, 2. סוג קולטן גונדוטרופין אדם ההורמון משחרר לי (GnRH-IR) ממוקם בעיקר בבלוטת יותרת המוח אך הוא מופיע גם בכמה רקמות אחרות אשר אחראים עצמי רבייה 3. GnRH-IR מתבטא גם במספר רקמות סרטן, הקשורים או שאינם קשורים במערכת הרבייה 4, 5. הביטוי הגבוה של GnRH-IR בכמה תאים סרטניים ממאירים לעומת רקמות בריאות מספק הזדמנות עבור טיפול ממוקד 5, 6.

הורמון גונדוטרופין משחררים רב (GnRH) אנלוגים פותחו בעשורים האחרונים, אשר יכול לשמש מיקוד moietiesf "> 7, 8, 9. פפטידים אלה מסוגלים לספק סוכנים אנטי סרטניים עם סלקטיביות גבוהה לתוך תאים סרטניים ממאירים אשר על-Express 6 GnRH-IR. תרופות אנטי סרטניות מספר מצומדות GnRH עם סלקטיביות גבוהה ויעיל יותר מאשר מקביל unconjugated תרופה ללא תשלום דווחה 7, 8, 9.

פרסומים קודמים על פפטידים GnRH ואת הקולטנים שלהם דיווחו כי GnRH-IR ניתן להניח תצורות שונות אשר יש סלקטיביות שונה עבור GnRH אנלוגים 10. GnRH-IR משתנה מאוד יש מסלולי איתות מורכבים ומגוונים ניחן פעילות שונים נגד ליגנדים טבעיים ומלאכותיים שלהם 11. עובדות אלו הופכות חקירה של מערכות מבוססות GnRH מאתגרת. מצד שני, את y בעלי פוטנציאל טיפולי מבטיח. כמה ניסויים עם פפטידים radiolabeled GnRH דווחו בעבר 12, 13, 14, 15, אך ניסויים שבהם שכותרתו fluorescently אנלוגים של GnRH שימשו עדיין מוגבל. בעוד סימון הרדיואקטיבי מציע רגישות גבוהה, תיוג פלורסנט יש יתרונות נוספים, למשל טיפול הקל, ואת יכולת counterstain עם fluorophores השונה. שלושה אנלוגים של GnRH נפוצה אשר שימשו בהצלחה עבור משלוח הסמים הם [D-ליס 6] -GnRH-I, [D-ליס 6] -GnRH-II ו- GnRH-III, אך האפקטיביות של פפטידים אלה moieties מיקוד לעתים רחוקות לעומת 16, 17. מצד השני, תוצאות מניסויים נפרדים שבו תאים סרטניים שונים אנלוגים של GnRH שמשו מגוונת.

ntent "> בהתבסס על שיקולים אלה, התמקדנו הגידול מיקוד ופוטנציאל משלוח סמים של פפטידים GnRH אלה, מסונתז ובכך ואפיין את [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-ליס 6 (FITC ]) - GnRH-II ו [8 ליס (FITC)] - conjugates פפטיד GnRH-III 18 אנלוגים אלו מסומנים באופן סלקטיבי עם FITC על שרשרת הצד של ליס או D-ליס (פפטיד-FITC שלהם יחס 1: 1 בכל. המצומד). הרעיון היה כי תיוג פלורסנט סלקטיבי יכול להציע מידע רומן על פפטידים אלה, ומאפשר מעקב שלהם טוב וכימות אמין. יש הטיות אלה טיפול בטוח ויכולת גילוי אמין, אשר עושים את זה קל יותר להשוות יעילות מיקוד הגידול שלהם, ואת הקרנת סוגים רבים של תאים סרטניים ממאירים. אנו מקווים כי עד-כדי ניסויי תאריך עם conjugates פפטיד אלה יכולים לתרום להתפתחות של סרטן רומן מיקוד conjugates סמי GnRH, ולעזור לזהות זפת טיפולית חדשהמקבל גם כן.

כתב היד הנוכחי מדגים כמה ניסויים לשחזור מהיר גם עם conjugates GnRH-FITC. הביטוי שטח פני התא של GnRH-R הוא מצב מכריע לגבי ספיגת GnRH, ולכן אנחנו במקביל בודקים את הרמה פני התא של GnRH-IR על שורות תאים הנבדקות. אנו לנגד עיניו את conjugates GnRH-IR ו- GnRH-FITC ידי מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) לכמת את ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת תרביות תאים ריאגנטים

  1. שמירה על תרביות תאים במדיום המומלץ על ידי היצרן, בתוספת 10% (v / v) בסרום שור העובר ואנטיביוטיקה (בינוני מלא שנקרא). שמור את בקבוק culturing תא חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. בצע את ההתפשטות confluency של תאים על ידי מיקרוסקופ ההפוך (באמצעות מטרת 10X לעומת שלב).
  2. כאשר התאים מגיעים confluency נאותה, להסיר את המדיום, ולשטוף את תרבות עם 2-3 מ"ל, סטרילי פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). הסר את PBS ולהוסיף 0.5 מ"ל, פתרון 0.25% טריפסין-EDTA סטרילית התרבות התא לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק (כ -10 דקות).
  3. להשעות את התאים 3-4 בינוני מלא סטרילי מ"ל להפסיק טריפסין ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות סטרילי. צנטריפוגה התאים ב XG 150 עבור 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). בטל supernatant בזהירות להשעות את pellet 2-3 בינוני מלא סטרילי מ"ל.
  4. להוציא 100 μL של ההשעיה תא ומערבבים עם 100 μL 0.4% (V / m) trypan פתרון כחול, כדי להכתים את התאים המתים. טען 10 μL של תערובת זו לתוך hemocytometer ולקבוע את מספר תאי קיימא על ידי מיקרוסקופ ההפוך.
  5. לדלל את הכמות הנדרשת של השעית תא שהוכנה בשלב 1.3 עד 10 מיליליטר עם מדיום מלא סטרילי, המכילה 4 x 10 4 תאים / מיליליטר.
  6. הוסף 250 μL של השעית תא (מוכנות בשלב 1.5) לכל טוב (10 4 תאים / טוב) לשבע בארות של הכוס הראשונה השקופיות תחתונות 8-גם מיקרוסקופיות. השתמש שקופית זו בשיטה הספיגה GnRH.
  7. הוסף 250 μL של השעית תא (מוכנות בשלב 1.5) לכל טוב (10 4 תאים / טוב) לחמש בארות של השקופיות מיקרוסקופיות 8-גם השניות. שקופית זו תשמש בשיטת ביטוי GnRH-IR.
  8. הוסף 1 מ"ל של השעיה תא (מוכן בשלב 1.5) לכל טוב (4 x 10 4 תאים / טוב) לשבעה wells של צלחת 12-היטב. צלחת זה ישמש בשיטת כימות GnRH.
  9. בואו התאים לדבוק על שני השקופיות המיקרוסקופיות צלחת. דגירה אותם באינקובטור האווירה humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
  10. לאחר הדגירה לבדוק את התאים על ידי מיקרוסקופ ההפוך (באמצעות אובייקטיבי בניגוד שלב 10X). אם התאים בריאים מצורפים, המשך בביצוע השלבים הבאים.
  11. הכן 10 מ"מ GnRH-FITC פתרון המניות ב sulfoxide דימתיל (DMSO) מכל אחד משלושת conjugates 18. (השתמש ריכוזי דילול הבאות: 16.43 מיקרוגרם / μL [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-I, 16.97 מיקרוגרם / μL [D-ליס 6 (FITC)] - GnRH-II ו- 16.47 מיקרוגרם / μL [ליס 8 ( FITC)] - GnRH-III) שמור פתרונות מניות אלה במקום חשוך ב RT ולהשתמש אותם בתוך מספר שבועות.
  12. לדלל 1.7 μL כל אחד מהפתרונות המניה שלוש 10 מ"מ GnRH-FITC ב 1.7 בינוני מלא מ"ל. Shake הפתרונות הללו. (Thesדואר הם 10 מיקרומטר GnRH-FITC בטיפול התקשורת.) לדלל 150 μL כל אחד בינוני בטיפול שלוש 10 מיקרומטר GnRH-FITC ב 1.35 מ"ל בינוני מלא. Shake פתרונות אלה, כמו גם (אלה הם המדיום בטיפול 1 מיקרומטר GnRH-FITC).
    הערה: כל-FITC GnRH המכיל בינוני בטיפול צריך להיות מוגן מפני אור נגמר תוך כמה שעות.
  13. מחממים שש המדיום בטיפול GnRH-FITC (מוכן בשלב 1.12) ו -4 מ"ל בינוני מלא ל -37 מעלות צלזיוס.
  14. לדלל 3 μL של פתרון בדיקה ניאון 5 מ"מ (counterstain גרעיני המוזכרים רשימת חומרים) ב 3 מ"ל PBS עד 5 מיקרומטר. פתרון זה אמור להיות מוגן מפני אור, לשמור אותו ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.

2. מיקרוסקופית סריקת לייזר Confocal (CLSM)

  1. שיטה ספיגה GnRH
    1. קח את השקופית המיקרוסקופית הראשונה מוכנה בשלב 1.6 ו פיפטה את המדיום המלא מפני כל אחד מהשבע היטב. הוסף 250 μL של Medi המלא שחומם מראשאממ לתוך הבאר הראשונה. השתמש באפשרות זו כביקורת שלילית. הוסף 250 μL של GnRH-FITC שחומם מראש בטיפול תקשורת (מ 1.13) לכל אחד משש הבארות הבאות (3 בארות עם 1 מיקרומטר ו -3 עם 10 מיקרומטר). דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
    2. פיפטה את המדיום מבאר כל ולשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של פתרון תיקון (10% נייטרלי שנאגרו פורמלין) לתוך זה היטב דגירה את השקופית ב RT, במשך 10 דקות.
    3. פיפטה את פתרון תיקון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל 5 פתרון בדיקת ניאון מיקרומטר מוכן בשלב 1.14 לבאר כל דגירת השקופיות ב RT, במשך 10 דקות.
    4. פיפטה את פתרון בדיקת ניאון מכל טוב, לשטוף את התאים פעמים עם 250 μL PBS בזהירות. להוסיף 3-4 טיפות של הרכבה בינונית לתוך כל טוב, סוף סוף. שמור את השקופית בחושך ב RT, עד ההדמיה.
  2. שיטת ביטוי GnRH-IR
    1. קח את השקופית המיקרוסקופית 8-גם השני מוכן בשלב 1.7 ו פיפטה את המדיום המלא מפני כל אחד מחמש הבארות.
    2. הוסף 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש לתוך הבאר הראשונה, להשתמש בשם זה כביקורת שלילית. הוסף 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש לתוך הבאר השנייה מדי, להשתמש בזה כדי לבחון ביטוי GnRH-IR לפני טיפול GnRH.
    3. הוסף 250 μL כל אחד בתקשורת בטיפול השלוש שחוממו מראש 10 מיקרומטר GnRH-FITC לשלוש הבארות הבאות. להשתמש בבארות אלה כדי pretreat את התאים עם conjugates GnRH-FITC לפני בחינת ביטוי GnRH-IR. דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    4. פיפטה את המדיום בטיפול מכל אחת משלוש הבארות אשר ישמש לבחון ביטוי GnRH-IR לאחר הטיפול GnRH ולשטוף בארות אלה עם 250 μL של בינוני מלא שחומם מראש. הוסף 250μL של שחומם מראש בינוני מלא לתוך כל אחת משלוש הבארות. דגירת השקופיות בתוך חממת אווירת humidified, 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    5. פיפטה את המדיום מכל אחת חמש בארות לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של תיקון פתרון זה לתוך זה היטב דגירה את השקופית ב RT, במשך 10 דקות.
    6. פיפטה את פתרון תיקון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL של PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל אלבומין 5% שור (BSA) פתרון חסימת לבאר כל דגירה שקופיות ב RT עבור 1 שעות.
    7. מדולל 10 μL של נוגדן ראשוני GnRH-IR ב 1 מ"ל PBS (1 ל -100 יחס). שמור את זה ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.
    8. פיפטה את הפתרון החוסם BSA מבאר כל פרט הבקרה השלילית (גם ראשון). שוטפים את התאים עם 250 μL PBS (למעט הביקורת השלילית היטב). הוסף 250 μL של PBS המכיל נוגדן ראשוני GnRH-IR מוכן בשלב 2.2.7 לתוך EACגם שעות (למעט השליטה השלילית). דגירת השקופיות ב RT עבור 1 שעות, במקום חשוך.
    9. לדלל 2.5 μL של נוגדנים משני שכותרתו אלקסה -546 1.25 מ"ל PBS (1: 500 יחס).
      הערה: פתרון זה אמור להיות מוגן מפני אור, לשמור אותו ב RT ולהשתמש אותו תוך מספר שעות.
    10. פיפטה פתרונות מכל אחת חמש בארות לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל AF 546 נוגדנים משני שכותרתו מוכנה בשלב 2.2.9 לבאר כל אחד. דגירת השקופיות ב RT עבור 1 שעות בחושך.
    11. פיפטה את הפתרון מכל טוב לשטוף את התאים עם 250 μL PBS. הוסף 250 μL של PBS המכיל 5 פתרון בדיקת ניאון מיקרומטר מוכן בשלב 1.14 לבאר כל דגירת השקופיות עבור 10 דקות, ב RT.
    12. פיפטה את פתרון בדיקת ניאון מכל טוב לשטוף את התאים פעמים עם 250 μL PBS בזהירות. להוסיף 3-4 טיפות של תקשורת הרכבה לתוך כל טוב, לאחר מכן. שמור את השקופית כההב RT עד ההדמיה המיקרוסקופית.
  3. הַדמָיָה
    1. תמונה התאים על ידי מיקרוסקופ סורק לייזר confocal הפוכה (באמצעות טבילה אובייקטיבי שמן 63X)
      1. השתמש אורכי גל פליטת עירור / הבא. conjugates GnRH: 488/514 ננומטר, נוגדן שכותרתו Alexa 546: 488/546 ננומטר (שימוש רק עבור שיטת ביטוי GnRH-IR), בדיקה ניאון Draq5: 633/680 ננומטר.
      2. הגדר את הפרמטרים הדמיה באמצעות תאי בקרה שלילית. שימוש בפרמטרים האלה בתאים שטופלו תמונה (איור 3). Re-להתאים את פרמטרי הדמיה על כל שקופית מיקרוסקופית בתחילת הניתוח. תמונות כוונן ייצוא עם התוכנה המסופקת על ידי היצרן במידת הצורך.

קרינה מופעלת 3. Cell מיון (FACS)

  1. שיטת כימות GnRH
    1. קח את הצלחת מוכנה בשלב 1.8 ו פיפטה את הבינוני המלא מבית EAch של שבע בארות. הוסף 1 מ"ל של מדיום מלאה שחומם מראש לתוך הבאר הראשונה. השתמש באפשרות זו כביקורת שלילית. הוסף 1 מיליליטר כל אחד מהשישה שחומם מראש בטיפול מדיה (3 בארות עם 1 מיקרומטר ו -3 בארות עם 10 מיקרומטר) לתוך שש הבארות הבאות. דגירה את הצלחת חממת אווירת humidified, 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות.
    2. פיפטה את המדיום מבאר כל. שוטפים את התאים פעמיים עם 2 מ"ל PBS בזהירות. הוספת 500 μL של פתרון טריפסין-EDTA לתוך כל בארות. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס עד תאי לנתק (כ -10 דקות).
    3. הוסף 1 מ"ל של מדיום מלאה לתוך כל טוב לעצור טריפסין. לנער את הצלחת. להשעות את התאים בעדינות עם טפטפת, ולהעביר את ההשעיה מבאר כל לתוך צינורות FACS. בצנטריפוגה צינורות ב XG 150 למשך 4 דקות, ב 4 ° C..
    4. יוצקים את supernatants בקפידה, עם מהלך אחד. הוספת 500 μL של PBS קר כקרח לתוך צינור אחד FACS בעדינות מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות על קרח עד הסוףשל הניסוי.
  2. ניתוח וחישוב
    1. לנתח את התאים על ידי cytometry הזרימה. עבור עירור, השתמש לייזר באורך גל 488 ננומטר ארגון ו לגילוי להשתמש 530 ננומטר אורך גל. הגדר את זרימת cytometer פרמטרים על ידי הפעלת תאי בקרה שלילית. שימוש בפרמטרים אלה לנתח תאים שטופלו (איור 4 א). להעריך את הנתונים עם תוכנה של היצרן, לקבוע עוצמת פלורסנט חציון ערכי (MFI), ולחשב את הערכים MFI יחסית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונות מתקבלות על ידי מיקרוסקופ סריקת ליזר confocal (CLSM) להציע מידע מרהיב על הספיגה של conjugates GnRH-FITC על תרבית תאים הנתונה בתוך זמן ואופן ריכוז תלוי. במקביל conjugates GnRH-FITC אלה, הנוכחות של GnRH-IR על פני התא לאימות גם על ידי הניסוי CLSM. יתר על כן, באמצעות בדיקת ניאון מכתים DNA מרחיקה אדומה, אפשר counterstain הגרעינים של תאים מלבד GnRH ו GnRH-IR. עם זאת, בעוד תמונת confocal אינה ניתנת לכימות, "שיטת ספיגת GnRH" הפשוטה יכולה להעריך בקלות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניסויים שתוארו במסמך להשתמש אנלוגים של GnRH שכותרתו סלקטיבי עבור חסיד ההקרנה בתרביות תאים במבחנה. מיקרוסקופיה Confocal וזרימת cytometry שיטות יכולות לשמש למעקב לכימות ספיגת הסלולר של conjugates GnRH-FITC אלה בתוך זמן ואופן ריכוז תלוי. יש ניסויים אלה השלבים הקריטיים הבאים: 1) לשמור על תרבית תאים סטריליים, בריאה; 2) פפטידים GnRH חייבים להיות באיכות גבוהה; 3) ריכוזים סבירים פעמי דגירה חייבים להיות מלווה; 4) צעדים לטיפול כביסה; 5) טובי-הסתגלות גדרות מכשירות.

<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרויקט נתמך על ידי קרן המחקר הלאומית OTKA (K 104045).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
EBC-1JCRB בנק תאיםJCRB0820קרצינומה של תאי קשקש ריאה אנושית
BxPC-3ATCCCRL-1687אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי
דטרויט-562ATCCCCL-138קרצינומה של הלוע
האנושי RPMI-1640 מדיום עם L-גלוטמיןלונזהBE12-702Fמדיום תרבית לתאי BxPC-3
המינימום החיוני של הנשר בינוני LonzaBE12-611Fלתאי EBC-1, ומשלים עם 0.1% נתרן פירובט לתאי דטרויט-562
סרוםבקר עוברי Euro CloneECS0180Lמשלים את מדיום התרבות
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012משלים את מדיום התרבית (אנטיביוטיקה)
צלוחיות תרבית תאים בקו סטנדרטיVWR10062-872לספק סביבת גידול עקבית וסטרילית לתאים
תערובת טריפסין-EDTA LonzaBE17-161Eהסר תאים מחוברים
מלח פוספט חוצץ (PBS)LonzaBE17-516Fממס
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'D8418-100MLממס
טריפן כחול תמיסה, 0.4%תרמו פישר מדעי15250061משמש לספירת תאים
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-Iתוצרת אותנו- טוהר וגימור; 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-IIמיוצר על ידינו-Purity≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-IIIמיוצר על ידינו-Purity≥ 98% (HPLC)
תחתית זכוכית 8 בארות שקופית מיקרוסקופיתIbidi80826שימוש בניסוי CLSM
צלחת תרבית תאים קורנינג קוסטאר 12 בארSigma-AldrichCLS3513-50EAשימוש בניסוי FACS
תמיסת קיבוע (10% פורמלין ניטרלי)Bio-Optica01V60Pתיקון תאים דבקים
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A7906-10Gלמנוע קשירה לא ספציפית של הנוגדנים
GnRHR נוגדןProteintech19950-1-APמגיב אימונוציטוכימיה, נקשר לקולטני GnRH מסוג I אנושיים
נוגדן משני, Alexa Fluor 546 מצומדThermo Fisher ScientificA11035מגיב אימונוציטוכימיה, נקשר לנוגדנים העיקריים
תמיסת בדיקה פלואורסצנטית (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254גרעיני כתמים נגדיים
Fluoromount הרכבה מימית בינוניתסיגמא-אולדריץ'F4680-25MLשימוש בניסוי CLSM, שימור מיקרוסקופ פלואורסצנטי
הפוך Elektro-Optika Ltd. אלפא XDS-2Tבדוק את הפנוטיפ והמפגש של תרביות תאים
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוךZeissLSM-710שימוש בניסוי CLSM
ציטומטר זרימהBD BiosciencesBD FACSשימוש בקליבורבניסוי FACS
מדיום תרבית מי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

מאמרים קשורים