מאמר שיטה

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55536

⸱

3 ביולי 2017

 ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.

תקציר

הדמיה פלואורסצנטית של רכיבים סלולריים היא כלי יעיל לחקור אינטראקציות מארח פתוגן. פתוגנים יכולים להשפיע על מאפיינים שונים של תאים נגועים, כולל אולטרה אולטרה, ארגון רשת cytoskeletal, כמו גם תהליכים סלולריים כגון גרגר מתח (SG) היווצרות. האפיון של כמה פתוגנים לחתר תהליכים מארח הוא חלק חשוב ואינטגרלי של השדה הפתוגנזה. בעוד שפנוטיפים משתנים עשויים להיות גלויים לעין, הניתוח המדויק של ההבדלים האיכותיים והכמותיים במבנים הסלולאריים הנגרמים על ידי אתגר הפתוגן הוא הכרחי להגדרת הבדלים משמעותיים בין דגימות ניסוייות ובקרה. גיבוש SG הוא תגובת מתח משמרת אבולוציונית המוביל לתגובות אנטי ויראליות ונחקרה זמן רב תוך שימוש בזיהומים ויראליים 1 . גיבוש SG משפיע גם מפלי איתות עשוי להיות conseq אחרים עדיין לא ידוע2 . אפיון תגובה זו ללחץ לפתוגנים, מלבד וירוסים, כגון פתוגנים חיידקיים, הוא כיום תחום מחקר חדש. לעת עתה, ניתוח כמותי ואיכותי של היווצרות SG עדיין לא נעשה שימוש שגרתי, גם במערכות ויראלי. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה עבור גרימת ואפיון SG המבנה בתאי נגוע ובתאים נגועים פתוגן חיידקי cytosolic, אשר משפיע על היווצרות של SG בתגובה למתח אקסוגני שונים. ניתוח של היווצרות SG והרכב מושגת באמצעות מספר סמנים שונים SG גלאי נקודה התוספת של ICY, כלי ניתוח קוד פתוח התמונה.

מבוא

ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח ניתן לנתח בו זמנית ואחד אינו מוגבל לסוג תא מסוים. החיסרון הוא רק תצוגת סטטי ניתן ללכוד כמו ניתוח immunofluorescence מחייב fixat תא המארחיוֹן. עם זאת, יתרון חשוב של הדמיה immunofluorescence היא שזה בקלות משאיל את עצמו הן ניתוח איכותי וכמותי. זה בתורו יכול לשמש כדי להשיג הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כדי לספק תובנות חדשות אינטראקציות מארח פתוגן.

ניתוח פלורסנט תוכניות ניתוח הם כלי ניתוחי רב עוצמה לביצוע 3D ו 4 D ניתוח. עם זאת, העלות הגבוהה של התוכנה ותחזוקה שלה לעשות שיטות המבוססות על תוכנות קוד פתוח חינם יותר אטרקטיבי. ניתוח תמונה זהיר באמצעות ביו ניתוח תוכנה הוא בעל ערך כפי שהוא מבסס ניתוח ויזואלי, כאשר הקצאת משמעות סטטיסטית, מגביר את הביטחון בנכונות פנוטיפ נתון. בעבר, SGs נותחו באמצעות תוכנת ImageJ חינם, אשר מחייב זיהוי ידני של SGS 4 בודדים. כאן אנו מספקים פרוטוקול אינדוקציה וניתוח של SG SG הסלולר בהקשר של bacזיהומים טרליים באמצעות קוד פתוח חופשי ניתוח תמונה תוכנה ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). תוכנת ניתוח ביו התמונה יש מובנית גלאי נקודה תוכנית כי הוא מתאים מאוד לניתוח SG. זה מאפשר כוונון עדין של תהליך זיהוי אוטומטי באזורים ספציפיים של ריבית (ROIs). זה מתגבר על הצורך בניתוח ידני של SGs הפרט מסיר הטיה הדגימה.

רבים סביבתיים מדגיש לגרום היווצרות של SGS, שהם שלב cytosolic צפופה שלב, מבנים שאינם קרום של 0.2 - 5 מיקרומטר בקוטר 5 , 6 . תגובה סלולרית זו נשמרת בצורה אבולוציונית בשמרים, בצמחים וביונקים, והיא מתרחשת כאשר תרגום החלבון העולמי מעוכב. זה כרוך צבירה של מתחמי היזום התרגום נתקע לתוך SGs, אשר נחשבים מקומות החזקת עבור mRNAs translationally-inactive, המאפשר תרגום סלקטיבי של קבוצת משנה של mRNAs הסלולר.עם הסרת הלחץ, SGs לפזר את שיעורי הגלובלית של סינתזת החלבון לחדש. SGs מורכבים תרגום התארכות גורמים הארכה, חלבונים המעורבים RNA מטבוליזם, RNA מחייב חלבונים, כמו גם חלבונים פיגומים וגורמים המעורבים תא המארח איתות 2 , למרות ההרכב המדויק יכול להשתנות בהתאם ללחץ מוחל. גורמים סביבתיים אשר מעוררים היווצרות SG כוללים רעב חומצות אמינו, קרינה UV, הלם חום, הלם אוסמוטי, מתח reticulum endoplasmic, היפוקסיה וזיהום ויראלי 2 , 7 , 8 . התקדמות רבה נעשתה בהבנת האופן בו וירוסים מעוררים וגם מערערים את מבנה ה- SG, בעוד שרק מעט ידוע עדיין על האופן שבו פתוגנים אחרים, כגון פתוגנים, חיידקים פטרייתיים או פרוטוזנים, משפיעים על תגובת המתחים הסלולרית 1 , 7 .

שיגLla flexneri הוא גרם שלילי pathulative cytosolic הפתוגן של בני האדם ואת הגורם הסיבתי של שלשולים חמורים או shigellosis. Shigellosis הוא נטל בריאות הציבור העיקרי ומוביל 28,000 מקרי מוות בשנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 של 9 , 10 . ס flexeneri מדביק את אפיתל הקולוני ומתפשט תא לתא ידי חטיפת המרכיבים cytoskeletal של המארח 11 , 12 . זיהום של אפיתל תומך שכפול של ס flexeneri בתוך cytosol אבל מקרופאגים נגועים למות דרך תהליך דלקתיות המוות הנקרא pyroptosis. זיהום מוביל לגיוס מסיבי של נויטרופילים ודלקת חמורה המלווה בחום, מתח חמצוני והרס רקמות. לכן, בעוד תאים נגועים כפופים ללחצים פנימיים המושרה על ידי זיהום, כגון הפרעות Golgi, מתח genotoxic ו סידור מחדש של cytoskeletalS, תאים נגועים הם גם נתון ללחץ סביבתי עקב תהליך דלקתי.

אפיון ההשפעה של זיהום S. flexneri על היכולת של תאים להגיב על מדגיש סביבתי באמצעות מספר סמנים SG הוכיח כי זיהום מוביל הבדלים איכותיים כמותיים הרכב SG 3 . עם זאת, מעט ידוע על פתוגנים חיידקים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה של זיהום של תאים המארח עם הפתוגן cytosolic S. flexneri , הדגשת תאים עם מדגיש סביבתי שונים, תיוג של רכיבי SG, ואת ניתוח כמותי וכמותי של SG הרכב והרכב בהקשר של נגוע ותאים שאינם נגועים. שיטה זו מיושמת באופן נרחב פתוגנים חיידקים אחרים. בנוסף, ניתוח התמונה של היווצרות SG עשוי לשמש זיהומים על ידי וירוסים או פתוגנים אחרים. זה יכול לשמש כדי לנתח SGהיווצרות זיהום או השפעת זיהום על היווצרות SG בתגובה ללחץ אקסוגני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת חיידקים ותאים מארחים

  1. העברה 12 או 14 מ"מ מכסה זכוכית מחליק גם 24 או 12 צלחות היטב, בהתאמה, עם פינצטה סטרילית, לספור אחד לכל תנאי הניסוי. לעקר אלה על ידי טיפול UV ברדס תרבות רקמה במשך 15 דקות.
    הערה: לכלול בארות בקרה לאתגר חיידקי עבור אינדוקציה SG ידי מדדים אקסוגניים.
  2. לקבלת צלחת 24 גם עם coverslips 12 מ"מ, זרע 1 x 10 5 תאים יונקים ( למשל, תאים הלה) על coverslips; לחץ על coverslips למטה עם קצה פיפטה סטרילית. בואו תאים לדבוק לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 תרבות רקמה חממה בינוני בינוני מתאים לכל סוג התא.
    הערה: תאים צלחת כך מפגש של תאים הוא בין 40-60% למחרת.
    1. עבור תאים Hella, דגירה ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) עם לא חיוניים חומצות אמינו (NEAA) ו 10% decomplemented עוברית עגל בסרום (FCS).Decomplement FCS ידי חימום במשך 30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס אמבט מים, מסתחרר את הסרום פעם אחת אחרי 15 דקות.
  3. כדי לפצח את החיידקים, השתמש קצה פיפטה סטרילית להסיר כמות קטנה ממלאי גליצריול חיידקי (20% גליצרול) מאוחסנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס ומניחים אותו על צלחת שכותרתו. השתמש בלולאה סטרילית להפיץ את החיידקים על כ 10% של הצלחת. השתמש לולאה סטרילית חדשה לגרור אותו דרך למרוח לעשות 3 שורות מקבילות, חצי צלחת ארוכה. פס דרך שורות אלה מכסה את שאר הצלחת. דגירה צלחת O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
    1. בחר מושבה חיידקים אחת ( למשל, ס 'flexneri ) מהצלחת טרי- out. הימנע עבודה עם מושבות חיידקים מעל 1 בשבוע.
    2. עבור ס. Flexneri זן M90T, לחסן מושבה אדומה מ טרי מפוספס החוצה אגר סויה טריפטית-0.1% קונגו צלחת אגר אדום לתוך 8 מ"ל של מרק סויה טריפטית בצינור 15 מ"ל; להדק את המכסה דגירה רועד ב 222 סל"ד O / N ב 306; ג.
      זהירות: אין להשתמש מושבות גדולות לבן כפי שהם איבדו את ארסיות פלסמיד והם שאינם זיהומיות.

2. אתגר בקטריאלי של תאים המארח

  1. הכן חיידקים למקסם פוטנציאל ההדבקה.
    1. עבור S. flexneri , חיידקים תת-תרבויות על ידי הוספת 150 μL O / N התרבות כדי 8 מ"ל סויה אגר טריפטית דגירה רועד 222 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס לשלב מאוחר מעריכי (~ 2 שעות) כדי לגרום ביטוי גנים ארסיות ולשפר את הזיהום.
      1. כאשר התרבות היא בצפיפות אופטי בין 0.6 ו 0.9 (נמדד ב 600 ננומטר), להעביר 1 מ"ל של התרבות לתוך צינור 1.5 מ"ל. חיידקים גלולה עבור 2 דקות ב 8,000 xg ו resuspend בזיהום בינוני (DMEM עם NEAA, חסר FCS) ב OD 600 = 1. לכן, אם 600 OD הוא 0.85, resuspend μL 850.
        הערה: עבור S. flexneri, ב OD 600 = 1, יהיו 8 x 10 8 חיידקים לכל מ"ל כאשרמתורבת בינוני 8 מ"ל. ריבוי זיהום (משרד הפנים) של 20 הוא מתאים. עבור פתוגנים אחרים, מספר החיידקים לכל מ"ל ב OD 600 ואת משרד הפנים המתאים צריך להיקבע באופן אמפירי.
    2. כדי לשפר את האינטראקציה בין חיידקים ומארחים, חיידקים עם פולי-ליזין (PLL).
      הערה: טיפול PLL של S. flexneri לא השפיע על הדינמיקה SG. פתוגנים אחרים צריכים להיות מוערכים עבור amenability שלהם לטיפול PLL.
      1. כדי חיידקים המעיל עם PLL, צנטריפוגות 1 מ"ל של תרבות חיידקים במשך 2 דקות ב XG 8000 ולאחר מכן resuspend גלולה ב 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​PLL ב-מלחץ שנאגרו פוספט (PBS) ב OD 600 = 1.
      2. מוסיפים את הפתרון החיידקי למאכל קטן, כמו גם בתוך צלחת 12 גם, ו דגירה ב RT (~ 20 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה על צלחת שייקר.
      3. חיידקים גלולה עבור 2 דקות ב XG 8000, להסיר את PLL עודף. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל PBS אד לחזור על שלב כביסה פעמיים. לאחר לשטוף הסופי, resuspend בזיהום בינוני ב OD 600 = 1.
        הערה: כאן, בינוני זיהום עבור S. flexneri הוא בינוני תא המארח עם 20 מ"מ HEPES w / o FCS.
  2. הכן תאים לאתגר חיידקי.
    1. הסר בינוני מ תאים יונקים יונקים באמצעות משאבת שאיבה. הוספת 500 μL RT המדיום תא hela לשטוף את התאים, מערבולת, להסיר בינוני באמצעות משאבת יניקה, ולהחליף עם בינוני μL RT בינוני זיהום ( למשל , בינוני תא המארח עם 20 מ"מ HEPES w / o FCS).
    2. הערה: עבור כל השלבים כביסה, לעבוד במהירות ולעבד רק עד 4 coverslips בכל פעם, כדי למנוע ייבוש של התאים.
  3. האתגר הכין תאים HeLa עם חיידקים להדביק 20 - 50% של התאים.
    הערה: הזמן המתאים משרד הפנים צריך להיקבע עבור כל מיני חיידקי. בדרך כלל, התחלה טובה היא 30 דקות ב 37° C עם משרד הפנים של 10.
    1. עבור S. flexneri, האתגר תאים תאים HeLa באמצעות אחת משתי השיטות (שלב 2.3.1.1 או 2.3.1.2).
      1. ספין שאינם PLL שטופלו חיידקים (20 μL של OD 600 = 1 / טוב של צלחת 24 גם במדיום 500 μL) על תאים 10 דקות ב 13000 x גרם.
      2. הוסף חיידקים מצופים PLL (15 μL של OD 600 = 1 / טוב של צלחת 24 גם במדיום 500 μL) במשך 15 דקות ב RT כדי לאפשר חיידקים להתיישב על תאים.
    2. אפשר זיהום להתרחש על ידי הצבת תאים עם חיידקים התיישבו לתוך 37 ° C רקמות תרבות חממה במשך 30 דקות.
      הערה: עבור נקודות זמן קצרות, לסנכרן זיהום S. flexneri ידי הצבת צלחות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים במשך 15 דקות במקום בחממה תרבות רקמות.
  4. עצור זיהום על ידי שטיפת תאים.
    1. כדי לשטוף תאים ולהסיר חיידקים עודפים, להסיר את המדיום באמצעות משאבת שאיבה, להוסיף 1 מ"לPrewarmed טריים (37 מעלות צלזיוס) בינוני תרבות הלה (DMEM, FCS 10%, NEAA). מערבולת בינוני, להסיר ולהחליף בינוני טרי. לחזור פעמיים ולהשאיר בינוני טרי על התאים.
      1. עבור S. flexneri , או חיידקים תאיים אחרים, לאחר ההדבקה של תאים Hella ו שוטף, להחליף בינוני עם בינוני רגיל רקמת התרבות המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין להרוג חיידקים תאיים ולמנוע הפלישה תא נוסף.
        הערה: אין להוסיף אנטיביוטיקה במדיום עבור חיידקים תאיים.
  5. דגירה חיידקים עם תאים עבור הכמות הרצויה של זמן בחממה תרבות רקמות.
    הערה: עבור S. flexneri , זיהום עשוי להיות כל עוד 6 שעות בהתאם לסוג התא. עבור תאים Hella, בואו זיהום להמשיך 1.5 - 2 שעות לפני הוספת מדגיש אקסוגניים כדי לגרום היווצרות SG. עבור זיהומים Caco-2, בהם Shigella מתפשט תא לתא, להדביק במשך 30 דקות עד 6 שעות לפני הוספת מתח אקסוגני. לִספִירַת הַנוֹצרִיםLl יכול להיות קבוע בשלב זה מבלי להוסיף מדגיש אקסוגני כדי להעריך את היווצרות של SGs כתוצאה של זיהום חיידקי (במקרה זה, המשך סעיף 4).

3. השראה גרגר מתח על ידי תוספת של אקסוגניים Stressors

  1. הסר את המדיום מ נגועים ולא נגועים תאים hella באמצעות משאבת שאיבה, להחליף בינוני עם 500 μL של המדיום המתאים עם או בלי הלחץ ו דגירה.
    הערה: התנאים המניבים מתח כוללים את הפעולות הבאות (ראה להלן). לטיפולים נוספים ראה Kedersha et al . 13 .
    1. לקבלת טיפול בהלם חום, להשתמש בינוני רגיל המכיל 20 מ"מ HEPES ומניחים את הצלחת לתוך אמבט מים 44 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. עבור clotrimazole (גורם ללחץ המיטוכונדריאלי), להשתמש בינוני רגיל ללא FCS עם clotrimazole 20 מיקרומטר ו דגירה של חממה תרבות רקמות עבור 1 ח.
      הערה: אחסן aliquots לשימוש יחיד של 20 מטרM clotrimazole המניות ב sulfoxide דימתיל (DMSO) ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 4 חודשים. השתמש ברכב DMSO לתאי בקרה.
    3. עבור ארסניט (גורם ללחץ חמצוני) טיפול, להשתמש בינוני רגיל עם ארסניט 0.5 מיקרומטר ו דגירה בתרבות רקמה חממה עבור 1 ח.
      הערה: חנות aliquots לשימוש יחיד של 0.5 מ"מ מלאי arsenite ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.
      זהירות: Clotrimazole ו ארסניט מזיקים ומסוכן לסביבה ויש להיפטר כראוי.
    4. עבור Des-Methyl Des-Amino (DMDA) טיפול פטמין (מעכבת ייזום תרגום אוקריוטים), להשתמש בינוני רגיל עם 50-200 ננומטר DMDA-pateamine ו דגירה בתרבות רקמה חממה עבור 1 שעות.
      הערה: חנות DMDA-pateamine ב -80 ° C. חנות ריאגנטים כמו aliquots קטן כדי למנוע הקפאה הפשרה.

4. קיבוע ו Immunofluorescence ניתוח של גרגר גיבוש

הערה: לעבד את הבקרה וCoverslips ניסיוני באותו זמן, כדי למנוע הבדלים מכתים שעלולות להשפיע על ניתוח התמונה בשלבים הבאים. דגימות הבקרה אינן כוללות זיהום עם וללא מתן טיפול ב- SG, ודגימות נגועות ללא וללא טיפול ב- SG.

  1. הסר בינוני לחלוטין באמצעות משאבת שאיבה לתקן דגימות על ידי הוספת 0.5 מ"ל RT 4% paraformaldehyde (PFA) ב PBS. דגירה של 30 דקות ב RT.
    זהירות: PFA מזיק למפעיל ולסביבה. קח מידה נאותה כדי להגן על המטפל ולהשליך עם פסולת כימית.
    הערה: לחלופין, לתקן במשך 15 דקות ולאחר מכן להחליף עם -20 מעלות צלזיוס מתנול prechilled למשך 10 דקות כדי לשמור על לוקליזציה cytoplasmic יותר של סמנים SG 13 .
  2. הסר את PFA עם פיפטה והשליך את הנוזל במיכל פסולת המתאים. לשטוף את coverslip עם 1 מ"ל טריס, שנאגרו מלוחים (כפות: 25 מ"מ טריס, pH 7.3, 15 mM NaCl). דגירה coverslip במשך 2 דקות עם רעד עדיןעל צלחת שייקר במהלך כביסה.
  3. הסר כפות לחלוטין באמצעות משאבת יניקה ולהוסיף 500 μL 0.3% Triton-X100 ב כפות במשך 10 דקות permeabilize התאים.
  4. הסר פתרון permeabilizing עם משאבת שאיבה. החלף עם 1 מ"ל TBS, מערבולת צלחת בעדינות, להסיר כפות ידי יניקה, ולהוסיף פתרון 1 מ"ל חסימת (5 FCS ב TBS) במשך שעה 1 ב RT.
  5. הכן את הפתרון נוגדן העיקרי (דילול 1: 300) ב FCS 5% ב TBS. חישוב 50 μL לכל 12 coverslip מ"מ ולעשות מספיק עבור כל coverslips אצווה אחת.
    הערה: הנוגדנים העיקריים הנפוצים המשמשים את היעד G3BP1, eIF3b ו- TIA1.
  6. ספוט 50 μL של תערובת הנוגדן העיקרי על סרט פרפין פלסטיק (parafilm) מוקלט היטב על הספסל או החדר.
    הערה: רשימה של סמנים SG קנוני מסופקים בטבלה של חומרים , אבל הרכב SGs עשוי להיות תלוי בלחץ מוחל. סמנים אחרים של SG מפורטים Kedersha et al. 13 תוצאות צפויות עבור מספר סמנים SG עבור זיהום S. flexneri המפורטים בטבלה 1 .
  7. להרים את coverslip עם פינצטה, dab קצה coverslip על הרקמה, לשחרר בקצרה את פינצטה כדי להסיר נוזלים עודפים, בעדינות במקום הפנים כלפי מטה על הירידה. דגירה coverslips עבור 1.5 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר לח.
    הערה: כדי להכין תא לח, במקום רקמות prewetted לאורך הקצוות של החדר סגור היטב עם שורות parafilm פלסטיק.
  8. העברת coverslip כל עם פינצטה לתוך באר של צלחת חדשה 24 גם מלא 1 מ"ל TBS; דגירה עם רעד עדין על צלחת שייקר במשך 5 דקות. יניקה את הכפות בכל היטב באמצעות משאבת שאיבה, להחליף עם 1 מ"ל TBS ומניחים בחזרה על צלחת שייקר במשך 5 דקות. חזור לשטוף פעם נוספת.
    הערה: שימוש חוזר parafilm ידי הסרת הנוזל עודף עם רקמה לשטוף את פני המים עם מים. ודא את הסרט פרפין יבש לחלוטין לפני usinG עבור שלב מכתים הבאים.
  9. הכן את הפתרון נוגדנים משני ב כפות (דילול 1: 500 - 1: 2,000). כדי הכתם את הגרעין ואת החיידקים, להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI לתערובת. כדי הכתם actin, להוסיף phalloidin פלואורסצנטי. פיפטה 50 μL משניים נוגדנים משני על הסרט פרפין פלסטיק.
    הערה: שימוש נוגדנים משני חוצה מטוהרים מאוד חמור סופג מומלץ ללימודי שיתוף לוקליזציה של סמנים שונים SG כאשר G3BP1 (נוגדנים עז) משמש. בחר נוגדנים משני שכותרתו fluorescently עם ספקטרה שאינם חופפים. EIF3b בבירור מכתים את הציטופלסמה של תאים ולכן הוא סמן טוב לתאים תאים. הכתם אקטין נוספת מסייעת לתא תאים באתרי תא אל תא ואזורים של כניסת חיידקים.
  10. להרים את coverslip עם פינצטה, dab קצה coverslip על הרקמה, משחרר בקצרה את פינצטה, כדי להסיר עודף נוזלים. בעדינות במקום coverslip פניו כלפי מטה על ירידה ו דגירה coverslipsבחושך במשך שעה אחת ב RT.
  11. השתמש פינצטה למקום coverslip בחזרה לתוך צלחות 24 גם מלא טרי 1 מ"ל PBS. ודא coverslip מכוסה במלואו על ידי PBS. שטפו את התאים 3x עם רעד עדין במשך 5 דקות כל אחד.
    הערה: שמור את הצלחת במהלך הכביסה מתחת לכסות כדי להגן מפני האור כמו fluorophores של הנוגדנים משני הם רגישים לאור.
  12. בקצרה לטבול את coverslip לתוך מים deionized להסיר את המלח, dab יבש מהקצה על רקמה ואת הר coverslip על 5 μL של המדיום הרכבה פלואורסצנטי על שקופית זכוכית. חותם את coverslip לפני הדמיה באמצעות לק. שמור שקפים על 4 מעלות צלזיוס לטווח קצר (שבוע) או ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך (חודש).
    הערה: הימנע מבעיות אוויר בעת איטום, מכיוון שהדבר יפגע באיכות התמונה.

5. פלואורסצנטי הדמיה

הערה: עיין במדריך למשתמש של המיקרוסקופ לאופטימיזציה של המערכת.

  1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ confocal באמצעות או 40 או 63X שמן טבילה העדשה. בחר את ערוצי הניאון הרצוי לרכישת תמונות. בעת שימוש במספר ערוצי ניאון, בחר במצב רכישה עוקבת.
    הערה: התחל עם דגימות ניסיוני שבו SGs כבר המושרה החזק ביותר כדי למנוע overexposure על דגימות הבאות. הקפד לא להיות overexposed SGs לאורך כל עומק התא.
    1. הגדר גודל סיביות של 12 או גבוה יותר בתוך הגדרות מיקרוסקופ כדי להבטיח דיוק של ניתוח התמונה.
    2. הגדר את ערימות התמונה כדי לכסות את כל עומק התא. בדוק את הערוצים השונים עבור סמנים שונים SG כדי להבטיח את כל טווח כלול. הגדר את תחילת הערימה בבסיס התאים ואת החלק העליון של ערימות בגובה בחלק העליון של התאים שבו לא עוד סמנים SG נצפים.
    3. לרכוש את הערימה. שמור את גובה המחסנית זהה לכל התמונות.
      הערה: אל תעשה זאתלשנות את הגדרות הרכישה בין שליטה דגימות ניסיוני שישמש להשוואה הבאה.

6. ניתוח תמונה

הערה: כאן, ניתוח SG על התמוטטות ערימות באמצעות ICY תוכנה חופשית מתואר. ניתוח תמונה של שחזור 3D עשוי להיעשות גם באמצעות תוכנות מיוחדות אחרות. זיהוי SG יכול להתבצע באמצעות זרימת עבודה אוטומטית לחלוטין שהוקמה עבור פרוטוקול זה (זמין ב http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). כדי להשתמש בפרוטוקול זה, הגרעינים צריכים להיות מוכתמים בכתם דנ"א עבור התוכנה כדי למצוא את המרכז של כל תא, ואת הקצוות התא צריך להיות מסומנת על ידי סמן cytoplasmic (כגון eIF3b) או כתם actin עבור התוכנה כדי לזהות את גבולות התאים. זרימת העבודה האוטומטית יכולה לשמש לאימות תוצאות נגזרות באופן ידני או ישירות לניתוח כאשר גבולות התאים מזוהים בביטחון גבוה,Stly תלוי בצפיפות של תאים ואת סמן המשמש כדי לזהות את גבולות התאים.

  1. באמצעות ImageJ או פיג 'י, לכווץ את ערימות התמונה (תמונה> ערימות> תחזית Z) ולשמור כקובצי .tiff.
    הערה: צור תיקייה חדשה עבור כל תמונה כמו תוכנת ניתוח התמונה יהיה קישור התוצאות שלה לאתר של התמונה המקורית.
  2. טען תמונה ניסויית ותמונה ניסיונית לפלטפורמת ניתוח התמונה (File> Open). עבור אל החלון רצף. גלול מטה את "Lookup Table" לפרמטרים של הערוץ.
  3. בטל את כל הערוצים על ידי לחיצה על תיבת הסימון של כל כרטיסיות הערוץ. לחץ על ערוץ 0 ולאחר מכן בחר את הצבע המועדף על ידי לחיצה על פס הצבע לעיל. הגדל את עוצמת הערוץ לפי הצורך כדי לראות את כל המבנים על ידי לחיצה והעברה של הקו בשדה האינטנסיביות. חזור על זה לכל הערוצים.
    הערה: בטל ערוצים שאינם נדרשים למשימה מסוימת כדי למזער את ההטיה בניתוח המדגם.
  4. גְלִילָהלמעלה ובתוך הכרטיסייה בד, התקרב ל -10 תאים לכל שדה על-ידי התאמת לשונית הזום.
  5. השתמש בכלים של מצולע (בסרגל העליון) כדי להגדיר גבולות תאים של תאים בתמונה. השתמש בכתם אקטין או סמן cytosolic עבור התיחום גבול התא ( למשל eIF3b).
    1. לחץ על הפונקציה פוליגון בתוך "קובץ & החזר ההשקעה" כלים. התחל סימון על ידי לחיצה על התא ולאחר מכן להאריך את הקו על ידי יצירת עוגנים באמצעות לחיצה חוזרת סביב הגבול התא. כדי לסיים את החזר ה- ROI, לחץ שוב על פונקציית המצולע בתוך כלי "קובץ והחזר ROI".
      הערה: זיהוי תת אוכלוסיות של תאים מסומן כי הם נגועים. המדגם מורכב מתערובת של תאים נגועים ולא נגועים. כדי לזהות חיידקים, או להשתמש כתם DAPI או חיידקים ניאון (כגון חיידקים להביע GFP). להגביר את האינטנסיביות כדי להבטיח כי כל החיידקים נראים.
    2. כדי לתת החזר ROI, עבור לחלון ההחזר על ההשקעה מימין ומשמאלCk על התא עניין של התמונה. פעולה זו תדגיש את החזר ה- ROI המתאים בכרטיסייה החזר ROI. לחץ פעמיים על שם החזר ROI ולשנות את השם ( למשל תא נגוע # 1).
      הערה: אם יש להשתמש בתמונה אחת כדי לנתח תאים נגועים ולא נגועים, קל יותר לשמור את התמונה בשתי תיקיות נפרדות ולסמן את התאים הנגועים והבלתי נגועים בנפרד, תוך יצירת שני גיליונות אלקטרוניים שונים, דבר שיאפשר ניתוח יותר מאוחר.
  6. פתח את יישום גלאי נקודה בתוך "איתור & מעקב" הכרטיסייה (פס עליון). בכרטיסייה קלט, התמונה הנוכחית תיבחר. אל תשנו דבר. בכרטיסייה עיבוד מראש, בחר את הערוץ שיש לנתח.
    הערה: ניתן לנתח רק ערוץ אחד בכל זמן נתון. ניתוח אצווה ניתן לבחור כאן אם אחד משתמש רצף ניתוח אוטומטי לחלוטין אשר הפרמטרים נבדקו כדי לתת תוצאות מספקות.
    1. בתוך הכרטיסייה גלאי, בחר "Deכתמים בהירים על רקע כהה ", ולאחר מכן בחרו את הסולם והרגישות המתאימים, ועשו זאת על ידי בדיקה של הגדרות שונות ובדיקה חוזרת של זיהוי נקודה הן בבקרה והן בדגימות הניסוי.
      הערה: לקבלת תמונה עם רזולוציה של 2,048 x 2,048 וגודל פיקסלים של 0.12 מיקרומטר 2 , סף ברמה 2 עם רגישות של 25 עד 100 מתאים בדרך כלל, אך כל סמן SG צריך להיבדק באופן אמפירי. הגדרת זיהוי נקודה כך במדגם בקרת הלא מטופלים, כתמים לא מזוהים, ואילו במדגם ניסיוני עם SGS, כל SGs קטנים וגדולים נספרים.
    2. בכרטיסייה החזר ROI, בחר את ההחזר על ההשקעה המוצע מתוך רצף. בכרטיסייה סינון, בחר ללא סינון. בכרטיסייה פלט, בחר את הפלט המתאים.
      הערה: בחירה באפשרות אפשר קובץ ספציפי מסייעת לשמירת תנאי זיהוי שונים או ערוצים שונים. בחירה כדי לייצא את התמונה הבינארית ואת התמונה המקורית עם החזרים ROI וזיהוי הוא helPful עבור ניתוח בקרת איכות.
    3. בחר "הסר כתמים קודמים שניתנו כחזרי ROI". בחר את התיקייה לשמירת הקובץ על ידי לחיצה על הלחצן "ללא קובץ נבחר". בתוך הכרטיסייה תצוגה, בחר את האפשרויות הרצויות.לחץ על "התחל גילוי".
      הערה: תיקייה עם השם והמיקום שנבחר תיווצר המכילה את אפשרויות ההדמיה המיוצאות. תמונות אלה יחליפו עבור כל מצב חדש שנבדק. כדי לשמור את התמונות, או לשנות את שם התיקייה כך תיקייה חדשה תיווצר או להעביר את התמונות מתיקייה שמירה לתיקייה חדשה. לקבלת בקרת איכות של התמונות, כדאי לבחור סימן זיהוי תצוגה, מספר זיהוי החזר ROI ומספר החזר ROI ושם.
  7. לאחד ולשמור את הנתונים עבור הפרמטרים השונים באמצעות גיליון אלקטרוני שנוצר עבור כל תמונה או מצב נבדק.
    הערה: הפרמטרים לניתוח כוללים את מספר ה- SGs לכל החזר ROI, את פני השטח של SG, ואת המקסימום של SG, ממוצע ועוצמות מינימום.
  8. להעביר את הנתונים ולנתח באמצעות תוכנית ניתוח מסוגל לנתח, גרפים וקביעת המשמעות סטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להסביר ולהמחיש את הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, אנו מאופיין את התמונה של clotrimazole- המושרה SGS ב תאים hella נגוע או לא עם הפתוגן cytosolic S. flexneri . מתווה של הנוהל מוצג בתרשים 1 , וכולל נגיפי ואכזרית ס. Flexneri מפוספס על קונגו צלחות אדומות, הכנת חיידקים, זיהום, תוספת של מתח סביבתי, קיבוע מדגם מכתים, הדמיה מדגם quantitation, כמו גם ניתוח תמונה . מספר לחצים שונים עשויים לשמש כדי ליצור גיבוש S...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את אינדוקציה, לוקליזציה וניתוח של SGS בתאים שאינם נגועים ותאים נגועים הפתוגן cytosolic S. flexneri בנוכחות או היעדר הלחץ אקסוגני. באמצעות תוכנת הדמיה חופשית, פרוטוקולים מאפשר ניתוח איכותי וכמותי מדויק של היווצרות SG לזהות וכתובת סטטיסטית ההבדלים פנוטיפים נתון.

ישנם מספר צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקול עבור הזיהום, SG- השראה חלקים הדמיה. עבור זיהום, חשוב אינטראקציה חיידקית עם תאים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לגלות.

תודות

נ.ב. היא נמענת של ביל ומלינדה גייטס גרנט האתגר הגדול OPP1141322. PV נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מוקדמות פוסטדוק ניידות מילגות רוסט-קנטאריני פוסט דוקטורט. PJS נתמך על ידי מענק HHMI ו- ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<נוגדנים חזקים>ראשוניים
eIF3b (N20), מקור עז סנטה קרוזsc-16377סמן SG חזק ונמצא בשימוש נרחב. צביעה ציטוזולית מאפשרת תיחום תאים. דילול 1:300
eIF3b (A20), מקור עז סנטה קרוזsc-16378אותה מטרה כמו eIF3b (N20) ובידינו הייתה זהה ל-eIF3b (N20). דילול 1:300
eIF3A (D51F4), ארנב מקור (MC: חד שבטי)איתות תאים3411חלק מקומפלקס eIF3 מולטי-חלבון עם eIF3b. דילול 1:800
eIF4AI, עז מקור סנטה קרוזsc-14211מומלץ על ידי (Ref # 13). דילול 1:200
eIF4B, מקור ארנבAbcamab186856סמן גרגירי מתח טוב בידינו. דילול 1:300
eIF4B, מקור ארנבאיתות תאי3592מומלץ על ידי Ref # 13. דילול 1:100
eIF4G, ארנב מקורסנטה קרוזsc-11373סמן SG בשימוש נרחב. (הפניה # 13): ייתכן שלא יעבוד טוב בשורות תאי עכבר. דילול 1:300
G3BP1, ארנב מקור (MC: חד שבטי)BDBiosciences611126סמן SG בשימוש נרחב. דילול 1:300
Tia-1, מקור עז סנטה קרוזsc-1751סמן SG בשימוש נרחב. ניתן למצוא גם בגופי P כאשר SG נוכחים (Ref # 13). דילול 1:300
<חזק>אלכסה מצומד נוגדנים משניים
A488 נגד עזים, חמור מוצאתרמו פישרA-11055קרוס נספג. דילול 1:500
A568 נגד עזים, חמור מקורThermo FisherA-11057Cross נספג. דילול 1:500
A488 נגד עכבר, חמור מקורתרמו פישרA-21202דילול 1:500
A568 נגד עכבר, חמור מקורתרמו פישרA10037דילול 1:500
A647 נגד עכבר, חמור מקורתרמו פישרA31571דילול 1:500
A488 נגד ארנב, חמור מקורתרמו פישרA-21206דילול 1:500
A568 אנטי ארנב, חמור מקורThermo FisherA10042דילול 1:500
<חזק>ריאגנטים אחרים<
em>Shigella flexneriזמין במעבדות שונות על פי בקשה
מרק טריפטון קזאין סויה (TCS) BDBiosciences211825מדיום גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים
TCS agarBD Biosciences236950אגר גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים
קונגו אדוםSERVA Electrophoresis GmbH27215.01כלי דיסטרימינציה לשיגל שאיבדו את פלסמיד האלימות, יישום - גידול חיידקים
פולי-L-ליזין (PLL)Sigma-AldrichP1274שימושי לציפוי חיידקים להגברת זיהום, יישום - זיהום
GentamicinSigma-AldrichG1397הרג סלקטיבי של חיידקים חוץ-תאיים אך לא ציטוזוליים, יישום - זיהום
HEPESLife Technologies15630-056מאגר PH שימושי כאשר תאים מודגרים ב-RT, יישום - תרבית
תאים מדיום הנשר השונה (DMEM) LifeTechnologies31885מדיום תרבית סטנדרטי לתאי HeLa, יישום - תרבית תאים
סרום עגל עוברי (FCS)BiowestS1810-100תוסף 5% המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)Life Technologies11140דילול 1:100 המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים
DMSOSigma-AldrichD2650מדלל ריאגנט, יישום - תרבית תאים
נתרן ארסניטSigma-AldrichS7400משרה גרגירי מתח חזק (הערה: רעיל מאוד, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח
ClotrimazoleSigma-AldrichC6019משרה גרגירי מתח חזק (הערה: סכנה בריאותית, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח
Paraformaldehyde (PFAElectron Microscopy Scences157144% PFA משמש לקיבוע סטנדרטי של תאים, יישום - קיבוע
Triton X-100Sigma-AldrichT8787משמש ב-0.03% לחדירות של תאי מארח לפני צביעה אימונופלואורסצנטית, יישום - חדירות
A647-phalloidinThermo FisherA22287דילול הוא ב-1:40, עדיף להוסיף במהלך צביעת נוגדנים משנית, יישום - צביעת
DAPISigma-AldrichD9542צביעת חומצת גרעין המשמשת להמחשת גרעין המארח והחיידקים, יישום - צביעת
סרט פרפיןParafilm Sigma-AldrichBR701501שימושי לצביעה אימונופלורסנט של כיסויים, יישום - צביעה
Prolong GoldThermo Fisher36930אמצעי הרכבה חזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה
MowiolSigma-Aldrich81381מדיום הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה
של צלחת תרבית תאים 24 בארותSigma-AldrichCLS3527לוחות תרבית רקמות סטנדרטיים, יישום - תרבית תאים
12 מ"מ  כיסויי זכוכיתNeuVitro1001/12תמיכה בתרבית תאים ליישומים אימונופלואורסצנטיים, יישום - מלקחיים לתמיכה בתא
Sigma-Aldrich81381אמצעי הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה
<חזקה>תוכניות וציוד
Prismתוכנתניתוח נתונים ותוכנית גרפים עם אפשרויות בדיקה סטטיסטיות חזקות, יישום - ניתוח נתונים
Leica SP5Leica Microsystemsמיקרוסופ קונפוקלי, יישום - תמונה רכישה
ImarisBitplaneתוכנה מקצועית לניתוח תמונה, אפליקציה - ניתוח נתונים
אקסלמיקרוסופטתוכנה לניתוח נתונים וגרפים, אפליקציה - ניתוח נתונים
GraphPad

מקורות

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788(2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

G3BP1EIF3BHeLaShigella flexneri

מאמרים קשורים