אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים
במאמר זה
סיכום
תקציר
הדמיה פלואורסצנטית של רכיבים סלולריים היא כלי יעיל לחקור אינטראקציות מארח פתוגן. פתוגנים יכולים להשפיע על מאפיינים שונים של תאים נגועים, כולל אולטרה אולטרה, ארגון רשת cytoskeletal, כמו גם תהליכים סלולריים כגון גרגר מתח (SG) היווצרות. האפיון של כמה פתוגנים לחתר תהליכים מארח הוא חלק חשוב ואינטגרלי של השדה הפתוגנזה. בעוד שפנוטיפים משתנים עשויים להיות גלויים לעין, הניתוח המדויק של ההבדלים האיכותיים והכמותיים במבנים הסלולאריים הנגרמים על ידי אתגר הפתוגן הוא הכרחי להגדרת הבדלים משמעותיים בין דגימות ניסוייות ובקרה. גיבוש SG הוא תגובת מתח משמרת אבולוציונית המוביל לתגובות אנטי ויראליות ונחקרה זמן רב תוך שימוש בזיהומים ויראליים 1 . גיבוש SG משפיע גם מפלי איתות עשוי להיות conseq אחרים עדיין לא ידוע2 . אפיון תגובה זו ללחץ לפתוגנים, מלבד וירוסים, כגון פתוגנים חיידקיים, הוא כיום תחום מחקר חדש. לעת עתה, ניתוח כמותי ואיכותי של היווצרות SG עדיין לא נעשה שימוש שגרתי, גם במערכות ויראלי. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה עבור גרימת ואפיון SG המבנה בתאי נגוע ובתאים נגועים פתוגן חיידקי cytosolic, אשר משפיע על היווצרות של SG בתגובה למתח אקסוגני שונים. ניתוח של היווצרות SG והרכב מושגת באמצעות מספר סמנים שונים SG גלאי נקודה התוספת של ICY, כלי ניתוח קוד פתוח התמונה.
מבוא
ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח נ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חיידקים ותאים מארחים
- העברה 12 או 14 מ"מ מכסה זכוכית מחליק גם 24 או 12 צלחות היטב, בהתאמה, עם פינצטה סטרילית, לספור אחד לכל תנאי הניסוי. לעקר אלה על ידי טיפול UV ברדס תרבות רקמה במשך 15 דקות.
הערה: לכלול בארות בקרה לאתגר חיידקי עבור אינדוקציה SG ידי מדדים אקסוגניים. - לקבלת צלחת 24 גם עם coverslips 12 מ"מ, זרע 1 x 10 5 תאים יונקים ( למשל, תאים הלה) על coverslips; לחץ על coverslips למטה עם קצה פיפטה סטרילית. בואו תאים לדבוק לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להסביר ולהמחיש את הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, אנו מאופיין את התמונה של clotrimazole- המושרה SGS ב תאים hella נגוע או לא עם הפתוגן cytosolic S. flexneri . מתווה של הנוהל מוצג בתרשים 1 , וכולל נגיפי ואכזרית ס. Flexneri מפוספס על קונגו צלחות אדומות, הכנת חיידקים, זיהום, תוספת של מתח סביבתי, קיבוע מדגם מכתים, הדמיה מדגם quantitation, כמו גם ניתוח תמונה . מספר לחצים שונים עשויים לשמש כדי ליצור גיבוש S.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את אינדוקציה, לוקליזציה וניתוח של SGS בתאים שאינם נגועים ותאים נגועים הפתוגן cytosolic S. flexneri בנוכחות או היעדר הלחץ אקסוגני. באמצעות תוכנת הדמיה חופשית, פרוטוקולים מאפשר ניתוח איכותי וכמותי מדויק של היווצרות SG לזהות וכתובת סטטיסטית ההבדלים פנוטיפים נתון.
ישנם מספר צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקול עבור הזיהום, SG- השראה חלקים הדמיה. עבור זיהום, חשוב אינטראקציה חיידקית עם תאים.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
נ.ב. היא נמענת של ביל ומלינדה גייטס גרנט האתגר הגדול OPP1141322. PV נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מוקדמות פוסטדוק ניידות מילגות רוסט-קנטאריני פוסט דוקטורט. PJS נתמך על ידי מענק HHMI ו- ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <נוגדנים חזקים>ראשוניים | |||
| eIF3b (N20), מקור עז | סנטה קרוז | sc-16377 | סמן SG חזק ונמצא בשימוש נרחב. צביעה ציטוזולית מאפשרת תיחום תאים. דילול 1:300 |
| eIF3b (A20), מקור עז | סנטה קרוז | sc-16378 | אותה מטרה כמו eIF3b (N20) ובידינו הייתה זהה ל-eIF3b (N20). דילול 1:300 |
| eIF3A (D51F4), ארנב מקור (MC: חד שבטי) | איתות תאים | 3411 | חלק מקומפלקס eIF3 מולטי-חלבון עם eIF3b. דילול 1:800 |
| eIF4AI, עז מקור | סנטה קרוז | sc-14211 | מומלץ על ידי (Ref # 13). דילול 1:200 |
| eIF4B, מקור ארנב | Abcam | ab186856 | סמן גרגירי מתח טוב בידינו. דילול 1:300 |
| eIF4B, מקור ארנב | איתות תאי | 3592 | מומלץ על ידי Ref # 13. דילול 1:100 |
| eIF4G, ארנב מקור | סנטה קרוז | sc-11373 | סמן SG בשימוש נרחב. (הפניה # 13): ייתכן שלא יעבוד טוב בשורות תאי עכבר. דילול 1:300 |
| G3BP1, ארנב מקור (MC: חד שבטי)BD | Biosciences | 611126 | סמן SG בשימוש נרחב. דילול 1:300 |
| Tia-1, מקור עז | סנטה קרוז | sc-1751 | סמן SG בשימוש נרחב. ניתן למצוא גם בגופי P כאשר SG נוכחים (Ref # 13). דילול 1:300 |
| <חזק>אלכסה מצומד נוגדנים משניים | |||
| A488 נגד עזים, חמור מוצא | תרמו פישר | A-11055 | קרוס נספג. דילול 1:500 |
| A568 נגד עזים, חמור מקור | Thermo Fisher | A-11057 | Cross נספג. דילול 1:500 |
| A488 נגד עכבר, חמור מקור | תרמו פישר | A-21202 | דילול 1:500 |
| A568 נגד עכבר, חמור מקור | תרמו פישר | A10037 | דילול 1:500 |
| A647 נגד עכבר, חמור מקור | תרמו פישר | A31571 | דילול 1:500 |
| A488 נגד ארנב, חמור מקור | תרמו פישר | A-21206 | דילול 1:500 |
| A568 אנטי ארנב, חמור מקור | Thermo Fisher | A10042 | דילול 1:500 |
| <חזק>ריאגנטים אחרים< | |||
| em>Shigella flexneri | זמין במעבדות שונות על פי בקשה | ||
| מרק טריפטון קזאין סויה (TCS) BD | Biosciences | 211825 | מדיום גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | אגר גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים |
| קונגו אדום | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | כלי דיסטרימינציה לשיגל שאיבדו את פלסמיד האלימות, יישום - גידול חיידקים |
| פולי-L-ליזין (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | שימושי לציפוי חיידקים להגברת זיהום, יישום - זיהום |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | הרג סלקטיבי של חיידקים חוץ-תאיים אך לא ציטוזוליים, יישום - זיהום |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | מאגר PH שימושי כאשר תאים מודגרים ב-RT, יישום - תרבית |
| תאים מדיום הנשר השונה (DMEM) Life | Technologies | 31885 | מדיום תרבית סטנדרטי לתאי HeLa, יישום - תרבית תאים |
| סרום עגל עוברי (FCS) | Biowest | S1810-100 | תוסף 5% המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים |
| חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) | Life Technologies | 11140 | דילול 1:100 המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | מדלל ריאגנט, יישום - תרבית תאים |
| נתרן ארסניט | Sigma-Aldrich | S7400 | משרה גרגירי מתח חזק (הערה: רעיל מאוד, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | משרה גרגירי מתח חזק (הערה: סכנה בריאותית, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA משמש לקיבוע סטנדרטי של תאים, יישום - קיבוע |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | משמש ב-0.03% לחדירות של תאי מארח לפני צביעה אימונופלואורסצנטית, יישום - חדירות |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | דילול הוא ב-1:40, עדיף להוסיף במהלך צביעת נוגדנים משנית, יישום - צביעת |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | צביעת חומצת גרעין המשמשת להמחשת גרעין המארח והחיידקים, יישום - צביעת |
| סרט פרפין | Parafilm Sigma-Aldrich | BR701501 | שימושי לצביעה אימונופלורסנט של כיסויים, יישום - צביעה |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | אמצעי הרכבה חזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | מדיום הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה |
| של צלחת תרבית תאים 24 בארות | Sigma-Aldrich | CLS3527 | לוחות תרבית רקמות סטנדרטיים, יישום - תרבית תאים |
| 12 מ"מ כיסויי זכוכית | NeuVitro | 1001/12 | תמיכה בתרבית תאים ליישומים אימונופלואורסצנטיים, יישום - מלקחיים לתמיכה בתא |
| Sigma-Aldrich | 81381 | אמצעי הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה | |
| <חזקה>תוכניות וציוד | |||
| Prism | תוכנת | ניתוח נתונים ותוכנית גרפים עם אפשרויות בדיקה סטטיסטיות חזקות, יישום - ניתוח נתונים | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | מיקרוסופ קונפוקלי, יישום - תמונה רכישה | |
| Imaris | Bitplane | תוכנה מקצועית לניתוח תמונה, אפליקציה - ניתוח נתונים | |
| אקסל | מיקרוסופט | תוכנה לניתוח נתונים וגרפים, אפליקציה - ניתוח נתונים |
מקורות
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
