שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההשוואה חוץ גופייה של שני מאפיינים פונקציונליים מפתח של rituximab: היעד מחייב ולהשלים תלוי רעיל לתאים (CDC) אינדוקציה. השיטות הועסקו לקבלת השוואה מפורטת ל-צדדי בין rituximab הפניה ו biosimilar rituximab. מבחנים אלה יכולים להיות מועסקים במהלך פיתוח biosimilar או כמו בקרת איכות בייצור שלהם.

Abstract

נוגדנים חד שבטיים טיפוליים (מבז) רלוונטיים לטיפול בפתולוגיות שונה, לרבות סרטן. ההתפתחות מבז biosimilar ידי חברות תרופות היא הזדמנות בשוק, אבל זה גם אסטרטגיה להגדלת נגישות תרופה ולהפחית עלויות הקשורות בטיפול. הפרוטוקולים המפורטים כאן לתאר את ההערכה של יעד מחייב ואינדוקצית CDC ידי rituximab בתאים דאודי. שני תפקידים אלה דורשים אזורים מבניים שונים של הנוגדנים והן רלוונטיים האפקט הקליני מושרה על ידי rituximab. הפרוטוקולים מאפשרים מצד אל צד השוואה של rituximab הפניה ו biosimilar rituximab משווקים. המוצרים העריכו הראו הבדלים הוא יעד מחייב ואינדוקצית CDC, דבר המצביעים על כך שיש הבדלי physicochemical בסיסיים הדגשת הצורך לנתח את ההשפעה של הבדלים אלה במסגרת הקלינית. השיטות דיווחו כאן מהווים פשוט וזול במבחנה </ Em> מודלים להערכת הפעילות של biosimilars rituximab. לכן, הם יכולים להיות שימושיים במהלך פיתוח biosimilar, כמו גם עבור בקרת איכות בייצור biosimilar. יתר על כן, השיטות שהוצגו ניתן להסיק על מבז טיפולי אחר.

Introduction

נוגדנים טיפוליים הם נוגדנים מונוקלונליים רקומבינלים (mAB) שפותחו לטיפול בפאתולוגיות שונות, כולל סרטן, מחלות אוטואימוניות וכרוניות, הפרעות נוירולוגיות ועוד. נכון לעכשיו, ה- FDA נתן אישור ליותר מ 40 mBbs טיפולית, ועוד צפויים להגיע לשוק בשנים הבאות.

Rituximab הוא נוגדנים חד-כיווניים חד-כיווניים מסוג IgG1, שאושרו לטיפול ב- CD20 ⁺ B ללא לימפומה שאינה הודג'קין (NHL), CD20 ⁺ NHL פוליקולרי, לוקמיה לימפוציטית כרונית ודלקת מפרקים שגרונית ^{2 , 3} . ההכרה של CD20, אשר overexpressed ב B תאים....

Protocol

1. הערכת יעד מחייב על ידי cytometry זרימה

1. הכנת חומרים ביולוגיים וריאגנטים
   1. הפוך 500 מ"ל של המדיום תרבות RPMI בתוספת 10% חום- inactivated עוברית בסרום עוברי (H-IFBS).
   2. התרבות של דודי Burkitt של לימפומה (דאודי) תאים דאודי GFP ⁺ תאים באמצעות RPMI ו 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות. לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO ₂ humidified עד שהם מגיעים 6 - 9 x 10....

Results

באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, למקד מחייב ואת אינדוקצית CDC של rituximab ההתייחסות הושוותה במקביל לאלו של rituximab biosimilar פיק למסחרי אסיה.

בתאים דאודי, הוא מבז כבול CD20 באופן ריכוז תלוי (האיור 1D). רגרסיות שאינו לינארי של נתונים מחייב הפגינה r ² של 0.978 ו 0.848 לעיון ו rituximab biosimilar, בהתאמה (איור .......

Discussion

הפטנט הפטנט של mAb טיפולית מקדמת את הפיתוח של biosimilars. לכן, יש צורך בשיטות פשוטות אשר יכולים לזהות הבדלים בפעילות רלוונטית קלינית של מוצרים אלה. CD20 ⁺ תאים מתורבתים הועסקו להערכת שני מאפיינים תפקודיים מרכזיים של rituximab: מחייב יעד אינדוקציה CDC. הפעילות הראשונה דורשת הכרה של CD20 על ידי אזור פאב של mBb, ואילו האחרון תלוי בעיקר על האינטראקציה של אזור Fc עם משלימה שלה ⁹ . לכן, מבחני אלה מספקים דרך לקשר את המאפיינים המבניים והתפקודיים של mBbs.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 בינוני	ATCC	30-2001	שנה את התרבית בהתאם לקו התאים
תמיסת טריפאן כחול	סיגמא	T8154	0.4%, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית
תאים תאי הלימפומה של דאודי בורקיט	ATCC	CCL-213	אתה יכול לשנות את קו התאים בהתאם לנוגדנים המעניינים
סרום בקר עוברי (FBS)	GIBCO	16000-044	ניתן לשנות את מקור הסרום בהתאם לדרישות קו התאים
משלים סרום אנושי רגיל	Quidel	A113	לכן הוא מתאים לשימוש בניסויי תאימות ביולוגית כולל פיתוח תרופות, בדיקת ביו-חומרים ויישומים אחרים
7AA-D	BDPharmigen	559925	אתה יכול להשתמש במגוון רחב של אפשרויות צבע, התואמות לרוב תצורות המכשירים לניתוח כדאיות.
PECy5 עכבר אנטי אנושי IgG	BDPharmigen	551497	שנה פלואורוכרום בהתאם למסנן וללייזר של ציטומטר הזרימה שלך
בקרת איזוטיפ IgG אנושית	ThermoFisher Scientific	07-7102	שינוי בהתאם ל-mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	מאגר קיבוע ציטומטריית זרימה (1 - 4% פורמלדהיד או פרפורמלדהיד)
PBS pH 7.4 10x (מאגר פוספט תמיסה)	GIBCO	70011-044	פוספטמפר ללא Ca2+/Mg2+ [137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8 מ"מ Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] וללא אנדוטוקסין.
צלחות תרבית תאים 96 באר, קורנינג תחתון V		29442-068	מבחנות תחתונות עגולות 12 x 75 מ"מ או לוחות מיקרוטיטר תחתונים V או U 96 באר
MabThera (Rituximab)	Roche	—	מוצר עזר
ריטוקסימאב	אינדיאני	—	מוצר ביוסימילר
צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 או 50 מ"ל	קורנינג	430290 או 430052	—
טיפים לפיפטה	Eppendorf	—	יש צורך בתצורות נפח מרובות
פיפטות	Eppendorf	—	יש צורך בפיפטות בנפח מתכוונן
צנטריפוגה 5430/5430R דגם	Eppendorf	—	צנטריפוגה במהירות משתנה בקירור (4 עד 25 מעלות; ג) במהירויות הנעות בין 10 ל-30,130 פעמים; g
ציטומטר זרימה	BD Dickinson	—	BD FACSAria III או ציטומטר זרימה אחר
מיקרוסקופ אופטי ואור אולימפוס	Olympus	—	לכמת ולהעריך את צמיחת התאים
חממת	SANYO	—	אינקובטור לבקרת טמפרטורה ו-CO2 לתרבית תאים
ארון בטיחות ביולוגי	CHC BIOLUS&	mdash;	ארון בטיחות ביולוגי המשמש להגנה על החוקר, המוצר והסביבה.