שיטות ויטרו להשוואת יעד מחייב CDC אינדוקציה בין נוגדנים טיפוליים: יישומים ניתוח Biosimilarity

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ההשוואה חוץ גופייה של שני מאפיינים פונקציונליים מפתח של rituximab: היעד מחייב ולהשלים תלוי רעיל לתאים (CDC) אינדוקציה. השיטות הועסקו לקבלת השוואה מפורטת ל-צדדי בין rituximab הפניה ו biosimilar rituximab. מבחנים אלה יכולים להיות מועסקים במהלך פיתוח biosimilar או כמו בקרת איכות בייצור שלהם.

תקציר

נוגדנים חד שבטיים טיפוליים (מבז) רלוונטיים לטיפול בפתולוגיות שונה, לרבות סרטן. ההתפתחות מבז biosimilar ידי חברות תרופות היא הזדמנות בשוק, אבל זה גם אסטרטגיה להגדלת נגישות תרופה ולהפחית עלויות הקשורות בטיפול. הפרוטוקולים המפורטים כאן לתאר את ההערכה של יעד מחייב ואינדוקצית CDC ידי rituximab בתאים דאודי. שני תפקידים אלה דורשים אזורים מבניים שונים של הנוגדנים והן רלוונטיים האפקט הקליני מושרה על ידי rituximab. הפרוטוקולים מאפשרים מצד אל צד השוואה של rituximab הפניה ו biosimilar rituximab משווקים. המוצרים העריכו הראו הבדלים הוא יעד מחייב ואינדוקצית CDC, דבר המצביעים על כך שיש הבדלי physicochemical בסיסיים הדגשת הצורך לנתח את ההשפעה של הבדלים אלה במסגרת הקלינית. השיטות דיווחו כאן מהווים פשוט וזול במבחנה </ Em> מודלים להערכת הפעילות של biosimilars rituximab. לכן, הם יכולים להיות שימושיים במהלך פיתוח biosimilar, כמו גם עבור בקרת איכות בייצור biosimilar. יתר על כן, השיטות שהוצגו ניתן להסיק על מבז טיפולי אחר.

מבוא

נוגדנים טיפוליים הם נוגדנים מונוקלונליים רקומבינלים (mAB) שפותחו לטיפול בפאתולוגיות שונות, כולל סרטן, מחלות אוטואימוניות וכרוניות, הפרעות נוירולוגיות ועוד. נכון לעכשיו, ה- FDA נתן אישור ליותר מ 40 mBbs טיפולית, ועוד צפויים להגיע לשוק בשנים הבאות.

Rituximab הוא נוגדנים חד-כיווניים חד-כיווניים מסוג IgG1, שאושרו לטיפול ב- CD20 ⁺ B ללא לימפומה שאינה הודג'קין (NHL), CD20 ⁺ NHL פוליקולרי, לוקמיה לימפוציטית כרונית ודלקת מפרקים שגרונית ^{2 , 3} . ההכרה של CD20, אשר overexpressed ב B תאים, על ידי rituximab גורם אפופטוזיס; הפעלה משלימה; ואת תאי נוגדנים התאים בתיווך cytotoxicity (ADCC) ³ . פטנטים של תרופה זו פג באירופה ובארצות הברית בשנים 2013 ו 2016, בהתאמה. לפיכך, חברות תרופות ברחבי העולם מפתחים rituximab biosimilars. כמו בכל תרופה אחרת עבור הצריכה האנושית, biosimilars דורשים אישור מסוכנויות רגולטוריות. הנחיות בינלאומיות מראות כי עבור mBbs, biosimilarity צריך להיות מוכח על ידי השוואת המאפיינים הפיזיוכימיים, פרמקוקינטיקה, יעילות, ובטיחות של מוצרים חדשים התייחסות ⁵ .

לפיכך, המתודולוגיות המשמשות להשוואה זו חייבות להעריך את המאפיינים המבניים והתפקודיים של ה- MBBS, במיוחד אלו עם רלוונטיות קלינית. לשם כך, מבחני מבחנה מראים מספר יתרונות בניסויי vivo (שנבדקו ב- Chapman et al. ) ⁵ : i) במחקרים חוץ גופית רגישים יותר להבדלים בין הביוסימלר המוצע לבין מוצר הייחוס; Ii) במחקרים vivo חייב להתבצע מינים רלוונטיים, אשר עבור mAB רביםפרימטים לא אנושיים; ו iii) מאז מנגנון הפעולה, דוח הרעלים פרה-קליניים, ואת ההשפעות הקליניות של המוצר הפניה ידועים, במחקרים vivo עם biosimilars לא יכול לספק מידע שימושי נוסף. בהתאם לכך, ההנחיה של האיחוד האירופי עבור biosimilars מאפשרת מועמדים להיכנס לניסויים קליניים מבוססים על חזקה בנתונים במבחנה לבד ^6.

כאן, אנו מציגים שני מהר, כלכליים, ואת מבחנים פשוטים להעריך את הפעילות הביולוגית של rituximab באמצעות CD20 ⁺ תאים בתרבית. מבחנים אלה יכולים להיכלל במסגרת תרגיל ההשוואה למועמדי biosimilar rituximab.

פרוטוקול

1. הערכת יעד מחייב על ידי cytometry זרימה

1. הכנת חומרים ביולוגיים וריאגנטים
   1. הפוך 500 מ"ל של המדיום תרבות RPMI בתוספת 10% חום- inactivated עוברית בסרום עוברי (H-IFBS).
   2. התרבות של דודי Burkitt של לימפומה (דאודי) תאים דאודי GFP ⁺ תאים באמצעות RPMI ו 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות. לשמור על תרבויות על 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO ₂ humidified עד שהם מגיעים 6 - 9 x 10 ⁵ תאים / מ"ל.
   3. הפוך 50 מ"ל של חיץ מכתים על ידי דילול 1/100 H-IFBS ב PBS; זה חיץ יציב ב 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך חודש לפחות.
   4. הכן את פתרונות הבדיקה עבור התייחסות ו biosimilar mBbs. הפוך עשר 1: 2 דילולים סדרתי (500 μL כל) במאגר מכתים, החל מ 5 מיקרוגרם / מ"ל.
   5. השתמש חיץ מכתים לדלל אדם IgG (בקרת isotype) עד 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו- PE-Cy5 העכבר אנטי אנושי IgG (נוגדנים משני) כדי conסנט הציע על ידי היצרן.
   6. הכן paraformaldehyde 4% ב PBS (חיץ קיבעון).
2. כריכה מכוונת
   1. איסוף דאודי דאודי GFP ⁺ תא המתלים מן 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות ולהעביר אותם צינור צנטריפוגות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 400 במשך 5 דקות.
   2. שטפו את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של PBS ו centrifuging ההשעיה התא ב XG 400 במשך 5 דקות.
   3. Resuspend התאים PBS ולבצע ספירת תאים ניתוח הכדאיות עם כחול trypan. שימוש בתרבויות עם רמות הכדאיות התא ≥ 95% לניתוח.
   4. לדלל את ההשעיה התא עד 4 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ​​עם חיץ מכתים קרים.
   5. ב 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge, להוסיף 50 μL ההשעיה התא 100 μL של ריכוזי הבדיקה שונים של התייחסות או mBbs biosimilar. כלול משכפל עבור כל תנאי הניסוי.
   6. הכן צינורות נוספים עבוראלוטיפ (IgG1 האנושי במקום rituximab) ובקרה שלילית (נוגדנים משני ללא נוגדן ראשוני).
   7. לדגור על C 4 ° עבור 20 - דקות 30.
   8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה תא 400 XG במשך 5 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
   9. להשעות את התאים 100 μL של נוגדנים משני דגירה במשך 20 - 30 דקות ב 4 ° C, מוגן מפני אור.
   10. פעמיים לשטוף את התאים עם PBS ו להשעות אותם 200 μL של חיץ קיבעון.
   11. נתח את התאים על cytometer זרימה.
       הערה: האות נשאר יציב במשך כמה ימים אם הדגימות נשמרות ב 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור.
3. רכישת נתונים
   1. dot-חלקות פתוחות שתי בגיליון של הזרימה cytometer תוכנת הפעלה. הגדר את-A FSC לעומת FSC-H ב הראשון ואת-A FSC מול-A SSA בשנייה. פתח היסטוגרמה עבור ערוץ PE-Cy5.
   2. בשנתי ה FSC-A לעומת עלילת FSC-H, לבצע שער (R1) אירועי גופיית בחירה (איור 1A).
   3. הגדר את אוכלוסיית R1 ב-A FSC לעומת SSA-בתלקה נקודה ולאחר מכן לבצע שער חדש (R2) בחירת תאי יעד (איור 1B). הגדר את אוכלוסיית R2 בהיסטוגרמה עוצמת PE-Cy5 כדי להציג את התפלגות התדירות של התאים.
   4. כוון את עוצמת הקרינה נמוכה (FI) מגבלה עבור ערוץ PE-Cy5 באמצעות השלט שלילי אלוטיפ (איור 1C).
   5. רכישת 10,000 אירועים בתוך R2 מן המדגם עם הריכוז הגבוה של מוצר הפנייה. FI של מדגם זה צריך להיות צפוי הגבוה ביותר (איור 1C).
   6. רוכש את שאר הדגימות.
   7. עבור כל דגימה, לקבל את עוצמת הקרינה החציונית (MFI) בערוץ PE-Cy5.
   8. לקבלת דוגמיות עם הפניה או מב biosimilar, לחשב את ההבדל בין מדגם MFI ושל אלוטיפ (ΔMFI).

2. הערכה של ה- CDC

1. הכנת חומרי ריאגנטים ביולוגיים
   1. הכן תרבות בינוני תרבית תאים דאודי ו דאודי GFP ⁺ תאים כמתואר לעיל (צעדים 1.1.1 - 1.1.2).
      הערה: בנוסף, assay CDC דורש RPMI סרום ללא.
   2. לדלל השלמה בסרום אדם נורמלי (NHSC) 1: 2 עם RPMI סרום ללא. כן 2.5 מיליליטר.
   3. הכן 1 מ"ל של חום מומת (30 דקות / 56 מעלות צלזיוס) NHSC מדולל 1: 2 עם RPMI.
   4. כן סטים של פתרונות בדיקות עבור ההתייחסות מבז biosimilar ב RPMI סרום ללא. הפוך עשרה דילולים (200 μL כל) החל מ 1 כדי .025 מיקרוגרם / מ"ל.
2. assay CDC
   1. אוסף את תאי דאודי ו דאודי GFP ⁺ מן התרבויות ולכמת את כדאיות התא (ראה צעדים 1.2.1 - 1.2.3).
   2. כן השעית תא עם 4 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר ב RPMI סרום ללא.
   3. לְהוֹסִיף50 μL של השעית תא 50 μL של כל הפניה או ריכוז מבחן מב biosimilar ב 96-היטב חרוטים (V) -bottom microplates. כלול משכפל עבור כל תנאי הניסוי.
   4. הכן בארות נוספות עבור הביקורת השלילית (כלומר, בלי מב), בקרת מות בסיס (כלומר, חום מומת NHSC בנוכחות מב), ובקרת מכתים חיובית (כלומר, תאים נחשפים 50 μL של 70% EtOH).
   5. דגירה התאים למשך 20 - 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified 5% CO _2.
   6. להוסיף 50 μL של NHSC (מדולל 1: 2) זה טוב דגירה התאים opsonized עבור 2.5 שעות ב 37 ° C באווירה humidified 5% CO _2. השתמש NHSC חום מומת בבארות מלאות מוות הבסיסיות.
   7. צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות ב 10 מעלות צלזיוס. בטל supernatant.
   8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 150 μL של PBS ו צנטריפוגה ההשעיה תא עבור 5 דקות ב 400 XG ו 10 מעלות צלזיוס. discard supernatant.
   9. כתם דגימות עם 7-aminoactinomycin (7-AAD), כפי שתוארו לעיל ^{7, 8.}
   10. נתח את התאים על cytometer הזרים באותו היום.
3. רכישת נתונים
   1. dot-חלקות פתוחות שתי בגיליון של הזרימה cytometer תוכנת הפעלה. גדר אלה חלקים כמו צעדים 1.3.1 - 1.3.3 (איור 2 א-ב). צור עלילה שלישית כי היא מזימה-נקודה עבור GFP לעומת 7-AAD על אוכלוסיית R2.
   2. הגדר את גבולות FI הנאותים באמצעות תאי דאודי, תאי דאודי GFP ^+, ומות ביקורת חיובית (איור 2C).
   3. עבור כל דגימה, למדוד את אחוז 7-AAD ⁺ תאי יעד. לרכוש לפחות 5000 אירועים מ R2.
   4. חשב את הרעילויות לתאים מב-induced המבוקשים על ידי הפחתת שיעור 7-AAD ⁺ בבקרת המוות הבסיסית מן האחוז שנמצא בדגימות עם הנבדליםריכוז ent של mAB ( איור 2 ד ).

3. ניתוח biosimilarity

1. הזן את ערכי הריכוז והתגובה לתוכנת גרפים.
2. ליצור גרפים ולחשב רגרסיות לא ליניאריות עם השיקולים הבאים: i) להשתמש ביומן השינוי של ריכוז mAb כמו "X"; ) 2 השתמש במודל המשתנה המתמטי של השיפוע (תגובה מינימלית של Y = (תגובה מקסימלית - תגובה מינימלית) / 1 + 10 ^ ((לוגק _{50 -} X *) גבעה)); ו iii) להגביל את הערכים התחתונים לאפס, מאז התגובה הבסיסית כבר מופחת.
   הערה: עקומות עם צורה סיגמואידית סימטרי צפויים.
3. השווה הן לא ליניארי מתאים עם התאמה גלובלית באמצעות F-test (תוכנות גרפים רבים כוללים תכונה זו).
   הערה: בדיקות אלה קובעות כי השערת האפס כי התגובה המקסימלית, logec ₅₀ , ואת המדרון גבעה זהים עבור שני מערכי הנתונים, אשר תואם אתהשאלה הביולוגית שנועדה לטפל בה.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקולים שתוארו לעיל, למקד מחייב ואת אינדוקצית CDC של rituximab ההתייחסות הושוותה במקביל לאלו של rituximab biosimilar פיק למסחרי אסיה.

בתאים דאודי, הוא מבז כבול CD20 באופן ריכוז תלוי (האיור 1D). רגרסיות שאינו לינארי של נתונים מחייב הפגינה r ² של 0.978 ו 0.848 לעיון ו rituximab biosimilar, בהתאמה (איור ...

דיון

הפטנט הפטנט של mAb טיפולית מקדמת את הפיתוח של biosimilars. לכן, יש צורך בשיטות פשוטות אשר יכולים לזהות הבדלים בפעילות רלוונטית קלינית של מוצרים אלה. CD20 ⁺ תאים מתורבתים הועסקו להערכת שני מאפיינים תפקודיים מרכזיים של rituximab: מחייב יעד אינדוקציה CDC. הפעילות הראשונה דורשת הכרה של CD20 על ידי אזור פאב של mBb, ואילו האחרון תלוי בעיקר על האינטראקציה של אזור Fc עם משלימה שלה ⁹ . לכן, מבחני אלה מספקים דרך לקשר את המאפיינים המבניים והתפקודיים של mBbs...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI-1640 בינוני	ATCC	30-2001	שנה את התרבית בהתאם לקו התאים
תמיסת טריפאן כחול	סיגמא	T8154	0.4%, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית
תאים תאי הלימפומה של דאודי בורקיט	ATCC	CCL-213	אתה יכול לשנות את קו התאים בהתאם לנוגדנים המעניינים
סרום בקר עוברי (FBS)	GIBCO	16000-044	ניתן לשנות את מקור הסרום בהתאם לדרישות קו התאים
משלים סרום אנושי רגיל	Quidel	A113	לכן הוא מתאים לשימוש בניסויי תאימות ביולוגית כולל פיתוח תרופות, בדיקת ביו-חומרים ויישומים אחרים
7AA-D	BDPharmigen	559925	אתה יכול להשתמש במגוון רחב של אפשרויות צבע, התואמות לרוב תצורות המכשירים לניתוח כדאיות.
PECy5 עכבר אנטי אנושי IgG	BDPharmigen	551497	שנה פלואורוכרום בהתאם למסנן וללייזר של ציטומטר הזרימה שלך
בקרת איזוטיפ IgG אנושית	ThermoFisher Scientific	07-7102	שינוי בהתאם ל-mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	מאגר קיבוע ציטומטריית זרימה (1 - 4% פורמלדהיד או פרפורמלדהיד)
PBS pH 7.4 10x (מאגר פוספט תמיסה)	GIBCO	70011-044	פוספטמפר ללא Ca2+/Mg2+ [137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8 מ"מ Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] וללא אנדוטוקסין.
צלחות תרבית תאים 96 באר, קורנינג תחתון V		29442-068	מבחנות תחתונות עגולות 12 x 75 מ"מ או לוחות מיקרוטיטר תחתונים V או U 96 באר
MabThera (Rituximab)	Roche	—	מוצר עזר
ריטוקסימאב	אינדיאני	—	מוצר ביוסימילר
צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 או 50 מ"ל	קורנינג	430290 או 430052	—
טיפים לפיפטה	Eppendorf	—	יש צורך בתצורות נפח מרובות
פיפטות	Eppendorf	—	יש צורך בפיפטות בנפח מתכוונן
צנטריפוגה 5430/5430R דגם	Eppendorf	—	צנטריפוגה במהירות משתנה בקירור (4 עד 25 מעלות; ג) במהירויות הנעות בין 10 ל-30,130 פעמים; g
ציטומטר זרימה	BD Dickinson	—	BD FACSAria III או ציטומטר זרימה אחר
מיקרוסקופ אופטי ואור אולימפוס	Olympus	—	לכמת ולהעריך את צמיחת התאים
חממת	SANYO	—	אינקובטור לבקרת טמפרטורה ו-CO2 לתרבית תאים
ארון בטיחות ביולוגי	CHC BIOLUS&	mdash;	ארון בטיחות ביולוגי המשמש להגנה על החוקר, המוצר והסביבה.