שיטת Aggregation Cell יעילה וגמישה עבור הפקת 3D אליפטית

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים של תאים באמצעות צבירת תאים. זה מותאם בקלות לסוגי תאים מרובים ומתאים לשימוש במגוון יישומים כולל נדידת תאים, פלישה או מבחני אנויקיס, ולהדמיה וכימות אינטראקציות בין תאים-מטריצות.

Abstract

תרבית תאים חד שכבתי כראוי אינו מודל ההתנהגות in vivo של רקמות, אשר כרוך אינטראקציות תאים תאים ותא-מטריצה מורכבת. תלת ממדי (3D) תא טכניקות תרבות הם חידוש אחרון פותח כדי לענות על החסרונות של תרבית תאים חסידה. בעוד מספר טכניקות ליצירת אנלוגים רקמות במבחנה פותחו, שיטות אלה הן מורכבים לעתים קרובות, יקרים להקים, דורשות ציוד מיוחד, והם מוגבלים בדרך כלל על ידי תאימות עם סוגי תאים מסוימים בלבד. כאן אנו מתארים פרוטוקול מהיר וגמיש לאיסוף תאים לתוך spheroids 3D רב-תאיים של גודל עקבי תואמת צמיחה של מגוון רחב של גידולי שורות תאים נורמלים. אנו מנצלים ריכוזים שונים של תאית בסרום מתיל (MC) לקדם דור אליפטית-עצמאית למעגן ולמנוע היווצרות של monolayers התא באופן מאוד לשחזור. תנאים אופטימליים indivשורות תאים idual יכולה להיות מושגת על ידי התאמת MC או ריכוזים בסרום בטווח הבינוני היווצרות אליפטית. הספרואידים 3D שנוצרו ניתן לאסוף לשימוש במגוון רחב של יישומים, כולל איתות תא או ביטוי במחקרי גן, הקרנת סמים מועמדת, או בחקר תהליכים תאיים כגון פלישת תאים סרטניים והגירה. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids המשובט מתאים יחידים, והוא יכול להיות מותאם על מנת להעריך צמיחה למעגן-עצמאי-התנגדות anoikis. בסך הכל, הפרוטוקול שלנו מספק שיטה וניתנת לשינוי להפקה וניצול spheroids תאי 3D כדי לשחזר את המיקרו-סביבת 3D של רקמות מודל צמיחת vivo של תאים נורמלים גידולים.

Introduction

ביולוגית רלוונטית הערכת התנהגות תאים הסרטניים היא מאתגר באמצעות דו ממדים מסורתיות (2D) מתודולוגיות תרבית תאים, בין שאר משום אלה אינם משקפים באופן נאות את המיקרו-הסביבה הניידת שנמצאה in vivo. גישות חלופיות שילוב רכיבים תאים מטריקס לתוך התרבות (למשל, מבחנים קאמריים בוידן) מייצגות פיסיולוגי יותר של סביבת רקמות in vivo. עם זאת, הם יכולים להיות מוגבלים הערכת התנהגות תאים בודדת, ואינו לשחזר את המורכבות בצירופי vivo של אינטראקציות התא-מטריקס תאי תאים תורמים לצמיחת רקמות או גידול ^{1, 2, 3.}

שימוש spheroids הרב התאי הוא גישה אחרונה יותר משחזרת את הארכיטקטורה הקומפקטית של צמיחת תאי vivo ב ^1,4. Spheroids יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא-מטריצה של תאים נורמלים, אבל יכול לשמש גם אנלוגים גידול מודל מאפיינים של התקדמות גידול, כגון צמיחה גרורתי או סמי התנגדות ^4.

Spheroids עלול להיוצר על ידי ההתפשטות של תאים בודדים משוקעים בתוך גוש ^5, או יותר במהירות, על ידי קידום הצבירה של מספר תאים כדי ליצור אשכול תא בודד (למשל, ירידה תלויה, שיטות צנטריפוגה) ^{6, 7.} טכניקות צבירת תא קיימות מסוימות עשויות לדרוש חומרים יקרים או ציוד מיוחד. בנוסף, יש spheroids אלה מגוון רחב של גדלי מורפולוגיות ועלול להיות קשה לייצר בכמויות גדולות, לערוך השוואות בין תנאי גידול או טיפולים קשים. לבסוף, spheroids המיוצרים בשיטות אלה יכול להיות קשה לבודד מן extracel חלבונייםמטריקס lular שבה הם משובצים לשימוש ביישומים אחרים.

כאן אנו מתארים מתודולוגיה צבירת תא חזקה ובקלות לשינוי להיווצרות של spheroids תא בגודל העקבי באמצעות זמינים מסחריים U-תחתונות צלחות תא-דוחה מטריצת קידום הידבקות אינרטי, תאי מתיל. מרגע היווצרותם, spheroids רב-תאיים אלה מבודדים בקלות לשימוש במגוון רחב של יישומים. הפרוטוקול גם להתאים בקלות ליצור spheroids באמצעות שגשוג תאים, אשר ניתן להשתמש כדי להעריך תהליכי תאים אחרים. כאן, אנו מציגים מבחני פלישת תא, לכמת ידי מכתים immunofluorescence, וכן assay anoikis, כמו יישומים לדוגמא של שני אלה פרוטוקולי היווצרות אליפטית שונים.

Protocol

הערה: כל ריאגנטים מתכלים מפורטים חומרים רשימה.

1. ייצור אליפטית באמצעות אגרגציה נייד

1. פתרון תאי מתיל: כן 100 מיליליטר של 100 מ"ג / תאית מתיל מיליליטר.
   1. מחממים 50 מ"ל ultrapure H ₂ O עד 80 מעלות צלזיוס. הוסף 10 גרמו מתיל תאי אבקה להתסיס עד חלקיקים מפוזרים באופן שווה.
   2. מביא נפח סופי עם H ultrapure הקר ₂ O ומערבב על 4 מעלות צלזיוס עד הפתרון הופך ברור, קש בצבע, ואין בה שום מוצקים גלויים.
   3. לעבור דרך מסנן 0.45 מיקרומטר להסיר מוצקים שלא נמס. פתרון מוכן ניתן aliquoted ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך עד 12 חודשים.
      הערה: תאית מתיל משמש כסוכן הלא ציטוטוקסיות, אינרטי, השעיית כדי לשפר את הידבקות תאים תאים ולהניא היווצרות של monolayer תא חסיד. תאית מתיל ברומיד הוא מסיס במים וניתן נשטף הבאים spherדור OID.
2. בינוני היווצרות אליפטית
   הערה: כן בינוני היווצרות אליפטית מייד לפני השימוש. אין לאחסן.
   1. לדלל פתרון תאית מתיל כדי 1-5 מ"ג / מ"ל ​​במדיום המתאים תרבות.
   2. לעבור דרך מסנן 0.22 מיקרומטר לעקר ולהסיר מוצקים שלא נמס.
3. בופר פוספט של Dulbecco (PBS)
   1. לדלל את 1x ולהעביר דרך פילטר 0.45 מיקרומטר לפני השימוש. פתרון מוכן עשוי להיות מאוחסן ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר.
4. ייצור אליפטית תא (איור 1)
   הערה: יש להכין את כל ריאגנטים מראש. חשוב כדי למנוע זיהום של פתרונות על ידי אבק, סיבים או חלקיקים מסיסים אחרים. הנוכחות של מזהמים אלה תשפיע היווצרות אליפטית לרעה. בינוני תרבות ופתרונות אחרים צריך להיות עבר דרך פילטר 0.45 מיקרומטר להסיר חלקיקים אלה כאשר possible. יש להימנע משימוש טפטפות-מסונן כותנה בעת העברת פתרונות כמו אלה יכולים להציג סיבים נוספים.
   1. monolayers תא תרבות מפגש 70% בתרבות המתאימה בתוספת בינונית עם סרום 10%. מדיום התרבות לשאוב ולשטוף עם 1x PBS כדי להסיר שאריות. הוסף 3 מ"ל של טריפסין EDTA (0.05% טריפסין) חיץ דיסוציאציה לצלחת תרבית תאים 10 ס"מ, ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   2. בדוק תאים תחת מיקרוסקופ ב 10X הגדלה כדי לאשר ניתוק. לנטרל חיץ ניתוק עם 7 מ"ל של מדיום תרבות-בתוספת בסרום.
   3. צנטריפוגה השעית תא XG ב 500 במשך 10 דקות לתאי גלולה בעדינות.
   4. הסר supernatant. גלולה תא גלולה במדיום היווצרות אליפטית 1 מ"ל בעזרת פיפטה P1000 עם הפילטר.
      הערה: השעיית התא צריכה להיות חופשית של גושים.
      1. כדי triturate גלולה תא, הקש על קצה פיפטה נגד התחתון של הצינור בזווית קלה תוךpipetting גזירת תא גלול. הימנע triturating יותר מ -3 - 5 פעמים כמו זה יכול לגרום נזק לתאים. פיפטה לאט לא לגרש כל התוכן של קצה פיפטה כדי למנוע יצירת בועות.
   5. ספירת תאים באמצעות hemocytometer ו לדלל השעית תא 1 x 10 ⁴ תאים / מיליליטר.
      הערה: יכול להיות מותאם מספר התא כדי ליצור spheroids בגדלים שונים. מכתים Trypan הכחול של תאים פגומים ניתן להשתמש כדי לאשר כדאיות של תאי resuspended.
   6. העברת השעית תא אל מאגר פיפטה רבה סטרילית ונטול אבק ולהשתמש טיפים מסננים לוותר 100 μL לבאר כל צלחת תא דוחה 96-היטב U-תחתונה.
      1. מאגר לשטוף עם O ultrapure H ₂ מסונן כדי להסיר אבק וסיבים.
      2. מערבבים את ההשעיה תא מעת לעת תוך זריעת כדי למנוע מתאי שיקוע לתחתית של המאגר. כדי להימנע מיצירת בועות, להשתמש בטכניקה pipetting הפוכה תוך ערבוב dispensinז.
   7. העברת צלחות בתרבית רקמה חממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂₎ ולבדוק יומי להיווצרות אליפטית. תאים צריכים ליישב לתחתית של כל טוב בתוך 6 שעות ובדרך כלל לצבור לתוך אליפטית בתוך 24-48 שעות (איור 2).
   8. לקבלת אישור של היווצרות אליפטית מוצלחת, השתמשו טיפ P10 ו פיפטה בעדינות בינונית מעל אליפטית תוך התבוננות במיקרוסקופ בהגדלה 10X. spheroids נוצר כראוי יתנדנד מצלחת אנד רול, המאשר המבנה 3D שלהם.
      הערה: תאית מתיל וריכוזי נסיוב צריך להיקבע על ידי טיטרציה עבור כל קו התא להניב היווצרות אליפטית אחת לכל טוב. תנאי מותאם בצורה זו על שורות תאים שנבחרו מוצגים בלוח 1, ודוגמאות של spheroids נוצר באיור 2B. Spheroids עלול להיות מבוגר למשך זמן ארוך יותר מכפי שצוין אך כאשר הם הופכים גידולים גדולים יותר ויותר קשהלטפל ללא פיצול. אם התאים יוצרים monolayer, spheroids הלוויין, או לא מצליחים ליישב לתחתית הבאר, ריכוז תאית מתיל בסרום ייתכן שיהיה צורך מותאם יותר להיווצרות אליפטית אופטימלי (איור 3 ב). אין להשתמש spheroids המכילים מזהמים כגון סיבים או אבק (איור 3 א). spheroids מראש יצר יכול להיות מטופלים עם תרכובות של עניין, כגון גורמי גדילה, כתמי תא חיים, או מעכבים לניתוח.

2. Assay הפלישה אליפטית (איור 4)

1. קולגן מנוטרל
   1. מגניב כל הנוזלים עד 4 מעלות צלזיוס וחזקות על קרח כשעובד עם קולגן כדי למנוע פילמור רצויה.
   2. הכן טרי 0.1 M ו- 0.01 M פתרונות של NaOH ורענן 0.1 M HCl ב ultrapure H ₂ O. Pass כל פתרונות באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים.
   3. מערבבים שור סוג 1 קולגן (3.1 מ"ג / מ"ל ​​המניות), 0.01 M NaOH ו 10x PBS (8: 1יחס 1 לפי נפח) ולהתאים את ה- pH 7.4 באמצעות 0.1 M NaOH ו HCl קר:. הריכוז הסופי של קולגן הוא 2.5 מ"ג / מ"ל.
   4. הכינו מספיק קולגן לנטרל למלא את כלי הדמיה עד לעומק של 2-3 מ"מ. מינימום של 100 μL נדרש עבור כל טוב של השקופית קאמרית בתרבית רקמה 8-גם המפורטים חומרים רשימה.
2. Embedding spheroids קולגן (איור 4)
   1. מעיל התחתון של כל טוב של שקופית קאמרית בתרבית רקמה 8-גם עם מינימום של 50 μL לנטרל קולגן.
      1. השתמש בטכניקת pipetting לאחור כדי להימנע מיצירת בועות קולגן. השתמש קצה פיפטה להפיץ את הקולגן שווה על פני השטח היטב.
         הערה: שכבת בסיס קולגן זה תחזיק spheroids השעיה היא בדרך כלל 1-2 מ"מ עובי. שכבת הבסיס ממזערת היווצרות של המניסקוס על שכבת קולגן העליונה. אם את שכבת הבסיס היא רזה מדי, spheroids יכול ליצור קשר עם החלק התחתון של השקופית הקאמריתיוצרים monolayer התא.
   2. מניח את השקף הקאמרי, וכן צלחת תרבות 35 מ"מ רקמה מלאה ultrapure H ₂ O, בצלחת בתרבית רקמת 10 סנטימטרים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד הוא polymerized קולגן, בדרך כלל 1 h. חנות הנותרת לנטרל קולגן על קרח.
      הערה: מלא מים 35 מ"מ צלחת תספק לחות למנוע התייבשות. השקופית הקאמרית צריכה להישאר בתא לחות זה לאורך כל assay. שכבת בסיס קולגן ניתן להשאיר לפלמר הלילה. incubations יותר בדרך כלל לגרום ג'ל נוקשה יותר.
   3. בעזרת קצה מסנן p1,000, לאסוף spheroids מראש יצר (שלב 1.4.7) מהתא דוחה U-תחתונה 96-גם הצלחת 1.5 מיליליטר צמד צינורות עליונים. פיפטה לאט ולהימנע חוזרות או pipetting נמרצת כדי למזער-גז נוזלי של spheroids. spheroids מרובות ניתן אספו בתוך שפופרת אחת להעברה גם אחד של השקופית קאמרית בתרבית רקמה 8-היטב.
   4. צנטריפוגה spheroids שנאסף tabletop microcentrifuge XG ב 2000 במשך 2-5 שניות ולהסיר supernatant בעזרת פיפטה p200. הימנע צנטריפוגה למשך זמן ארוך מהנדרש, מכיוון שהדבר עלול לגרום spheroids להישבר או גוש ביחד.
      הערה: לאחר pipetting את רוב supernatant, הצינור יכול להיות הפוך בזהירות מעל מגבת נייר נקייה כדי הפתיל משם נוזל עודף. אל תאפשר spheroids להתייבש.
   5. בעזרת קצה p200 נשא רחב, resuspend spheroids בעדינות 50 μL לנטרל קולגן. האם זה עבור כל שפופרת של spheroids שנאסף לפני כל spheroids מועבר לתוך השקופית הקאמרית. שמור spheroids כי כבר resuspended ב קולגן מנוטרל על הקרח עד מוכן להעברה לשקופיות קאמרית.
   6. סר שקופיות קאמריות מן החממה בזהירות פיפטה את תערובת קולגן אליפטית על גבי שכבת בסיס קולגן. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד הוא polymerized קולגן.
      1. אין לוותר כל התוכן של פיפטה כדי למנוע יצירת בועות. Dropwpipetting ISE מפחית את הסיכויים של מטריד את שכבת בסיס קולגן.
   7. לאט לאט להוסיף מינימום של 100 μL חממו בינוני תרבות המכיל chemoattractants רצוי, מעכבים, או טיפולים אחרים היטב בכל השקופית הקאמרית. הספרואידים המכיל שכבת קולגן עלולים להיקרע אם הנוזל הוא pipetted על זה יותר מדי במרץ. בינוני תרבות ניתן לוותר לאט למטה בצד של באר להימנע משיבוש קולגן.
   8. תא שקופיות לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ כדי לאפשר פלישת תא. פלישה סלולרית לתוך קולגן שמסביב ותהיה גלוי הדמית brightfield או קרינה לכמת על ידי מגוון של שיטות באמצעות epifluorescence, confocal או במיקרוסקופ גיליון אור.

3. כימות הפלישה: מיקרוסקופית Brightfield

1. במרווחי זמן קבועים, תמונה קולגן מוטבע spheroids בהגדלה 10X באמצעות מיקרוסקופ brightfield (שלב 2.2.8).
   הערה: לקבלהלטווח ארוך ניסויים לחיות תאים, הבמה מיקרוסקופ מחוממת קאמרי CO ₂ מוסדר יכולים לשמש כדי לשמור על spheroids ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ תוך הדמיה.
2. לכמת הפולשנות באמצעות תוכנה כגון ImageJ למדוד את מספר התאים הפולשים לתוך קולגן שמסביב ואת המרחק הממוצע פלשו בכל נקודת זמן.

4. כימותי הפלישה: מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם כתם תא חי

1. בעקבות צעד 2.2.8, להשלים את מדיום השקופיות הקאמריות עם כתם ניאון כגון DAPI, Calcein AM, או תרכובת מעקב תאים אחרת מתאימה הקו הסלולרי בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: לקבלת כימות הפולשנות, מכתים הומוגנית ברחבי אליפטית אינו הכרחי. עבור יישומים הדורשים חדירה עמוקה יותר של כתם, incubations יותר (> 3 ח) עשוי להיות נחוץ.
2. הסר את הכתם ולהחליף עם 500 μL חם 1x PBS. בcubate ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות כדי להסיר את הכתם עודף. חזור על מינימום של שתי פעמים.
3. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לרכוש חלקים אופטיים דרך spheroids הפולש.
   הערה: חשיפה ממושכת לאור הלייזר צריך להיות ממוזער במהלך ההדמיה חוזרות להגביל phototoxicity ואת photobleaching.
4. השתמש בתוכנה כגון ImageJ ליצור השלכה-Z, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לכמת את השטח הכולל של אליפטית, מספר רב של תאים פולשים, והמרחקים פלשו לתוך המטריצה ​​קולגן.
5. כדוגמה, לכמת הפלישה, להתאים את הסף התמונה לכלול רקע, הדגשת רק אליפטית לבין פולשים לתאים, ולמדוד באזורם. האזור של אליפטית המקורי ניתן מופחתי הטוטאלי הזה לכמת הפולשנות.

5. כימות של הפלישה: Immunofluorescence

הערה: כל פתרונות המאגרים יועברו דרך פילטר 0.45 מיקרומטר לפני השימוש כדי רםve פסולת, אשר יכול להשפיע באופן שלילי מכתים.

1. הכן חיץ לשטוף PBS ^+. כן 1x PBS ולהוסיף CaCl ₂ ו MgCl ₂ לריכוז סופי של 0.1 מ"מ. אל חיטוי חיץ לאחר CaCl ₂ ו MgCl ₂ מתווספים. הפתרון עשוי להיות מעוקר מסנן ומאוחסנים בטמפרטורת החדר.
2. כן ניטראלי שנאגר פורמלין חיץ קיבעון (NBF). הוסף 5 טיפות של 1 M NaOH 0.6 paraformaldehyde גרם. מביאים 20 מ"ל עם PBS ⁺ לדגור על 60 מעלות צלזיוס עד paraformaldehyde נמס (כ 1 ח). מצננים לטמפרטורת החדר כדי להתאים את pH 7.4 עם 1 M HCl.
   הערה: חיץ קיבעון NBF צריך להיות מוכן מייד לפני השימוש.
3. כן אלבומין בסרום שור (BSA) חיץ חסימה. ממיסים BSA ב PBS ⁺ ב 3% w / v. הפתרון עשוי להיות מעוקר מסנן ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים, אבל המוכנות ביותר טריים. אין לחמם.
4. כן Permeabilization חיץ. לדלל טריטון X-100כדי v / v 0.2% ב PBS ^+.
   הערה: Permeabilization חיץ צריך להיות מוכן מיד לפני השימוש.
5. לחלופין, להכין הרכבה בינונית Mowiol. שלב 2.4 גרם Mowiol, 6 גליצרול גרם, ו -6 מ"ל ultrapure H ₂ O. מערבבים למשך 3 שעות ב מסובבי בטמפרטורת החדר. להוסיף 12 מ"ל 0.2 M טריס-Cl (pH 8.5). דגירה עם ערבוב על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   1. צנטריפוגה ב 5000 XG במשך 15 דקות עד גלולת חומר מסיס. להוסיף חומר נוגד-לבן, כגון 2.5% DABCO. חנות ב 500 aliquots μL ב -20 ° C.
6. מכתים immunofluorescence של spheroids (איור 5)
   הערה: השתמש פיפטה להוסיף לאט או להסיר נוזלים משקופית קאמרית. יש להימנע משימוש של aspirator, מכיוון שהדבר עלול לשבש את שכבת קולגן.
   1. כן spheroids להטביע שקופיות קאמריות מלא קולגן, כמפורט בסעיפי 1 עד 2.
      הערה: autofluorescence קולגן ניתן למזער באמצעות שכבות דקיקות או כמויות קטנות של גollagen.
   2. סר כמו מדיום תרבות ככל האפשר מן כל שקופית קאמרית.
   3. בקצרה לשטוף שכבת קולגן עם 500 μL PBS ⁺ לשטוף חיץ כדי להסיר בינוני שיורית.
   4. הוספת 500 μL חיץ PBS ⁺ לשטוף טרי זה טוב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשטוף spheroids. חזור פעמיים.
   5. החלף חיץ PBS ⁺ לשטוף עם 500 חיץ קיבעון μL NBF. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 - דקות 25.
   6. הסר חוצץ קיבעון NBF ולשטוף עם 500 חיץ לשטוף μL PBS ^+. שטפו במשך 5 דקות עם טרי PBS ⁺ חיץ לשטוף מינימום של 3 פעמים.
      הערה: spheroids קבוע ניתן לאחסן ב 4 ° C במאגר טרי PBS ⁺ לשטוף במשך כמה ימים. 0.01% אזיד הנתרן ניתן להוסיף למאגר לשטוף ומעכבים התפתחותם של חיידקים במהלך האחסון.
   7. החלף PBS ⁺ לשטוף חיץ עם 500 μL חיץ permeabilization. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות.
   8. החלף חיץ permeabilization עם 500 μL BSA חסימת חיץ דגירה בטמפרטורת החדר 1 ח.
      1. לחלופין, הסר חוצץ חסימת BSA. באמצעות אזמל או מספריים, spheroids הבלו ואזור 3 מ"מ x 3 מ"מ שמסביב מהשכבה קולגן. בעזרת קצה p1000 נישא רחב, לעקור את הגוש הניכר של קולגן על ידי שטיפה בעדינות עם חיץ חסימה טרי BSA. העבר לחסום קולגן 1.5 צינור מ"ל.
      2. צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 2 דקות ולהסיר supernatant. הצינור יכול להיות הפוך בזהירות מעל מגבת נייר נקיה כדי פתיל משם נוזל עודף.
   9. הוסף נוגדן ראשוני spheroids דגירה בטמפרטורת החדר 1 ח. הוספת נפח מספיק של נוגדן ראשוני כזה כי שכבת קולגן כולו שקועה באופן שווה. השלבים האופציונליים לעיל (5.6.8.1-5.6.8.2) בדרך כלל להתיר את שימוש כמויות קטנות יותר של נוגדנים.
   10. לצלול שקופיות קאמרית במיכל עם 10 לפחות מ"ל PBS ⁺ לשטוף buffer במשך 10 דקות לשטוף. חזור על מינימום של שתי פעמים.
       1. אופציונלי, אם spheroids היו נכרת משכבה קולגן בעבר (שלב 5.6.8.1), להוסיף מינימום של 1 מ"ל PBS ⁺ לשטוף הצפת אל צינור 1.5 מ"ל ו להתסיס בעדינות. אפשר להשרות למשך תקופה מינימלית של 10 דקות.
       2. סר כמו חיץ PBS ⁺ לשטוף ככל האפשר וחזור כביסה עם PBS ⁺ חיץ לשטוף מינימום של שתי פעמים. צנטריפוגה XG ב 2000 במשך כמה דקות עד גלולה לחסום קולגן.
          הערה: משטחים מחוץ נקיים של השקופית הקאמרית על ידי מנגב עם אתנול 70% לפני השריית חיץ לשטוף.
   11. חזרו על שלבי 5.6.9-5.6.10 באמצעות נוגדנים משני מתאימים.
       הערה: אם spheroids הוכתמו ישירות כלי הדמיה, המשך לשלב 5.6.13.
   12. אופציונאלי, אם spheroids היה ניכר משכבת קולגן בעבר (שלב 5.6.8.1), שקופיות זכוכית נקיות coverslips מיקרוסקופיה התואמת confocal עם 70% אתנול.
       1. סר כמו חיץ לשטוף ככל האפשר מגוש קולגן ו resuspend ultrapure H ₂ O. בצע פעולה זו באופן מיידי לפני ההרכבה. אל תשאירו בלוקים מוכתמים השריה במים.
       2. שימוש בסדר מלקחיים הטו, לתפוס קצה של בלוק קולגן והעברת שקופיות זכוכית.
       3. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את הקולגן במקום, השתמש במקלון צמר גפן נקי פתיל נוזל עודפת מגוש קולגן, מוודא שלא לגעת קולגן ישירות.
          הערה: אם קולגן הופך דבוק מקלון צמר גפן ניתן להסירו בעדינות או באמצעות מלקחיים, או על ידי השריית במים.
   13. באמצעות טכניקה pipetting הפוכה, לוותר 100 הרכבה בינונית μL Mowiol על לחסום את הקולגן coverslip מקום על המדגם.
       1. השתמש מקלון צמר גפן או מגבת נייר כדי פתיל הרכבה בינוני Mowiol עודף מים מתחת coverslip.
       2. אפשר המדיום גובר Mowiol להקשיח לילה ב 4 °ג חותם קצוות של coverslip עם לק.
   14. Spheroids התמונה מוכתם באמצעות מיקרוסקופיה confocal או פלואורסצנטי להתבונן לוקליזציה של חלבונים של עניין, היווצרות של מבנים פולשניים, וכו '(5B הדמוי, 5C).
       הערה: ויטראז spheroids צריך להיות מוגן מפני אור כדי למנוע photobleaching.

6. Assay Anoikis

הערה: פרוטוקול היווצרות אליפטית מותאם בקלות לכמת צמיחה למעגן-עצמאי והתנגדות anoikis במגוון סוגי תאים.

1. זריעת תאים עבור assay anoikis (איור 6)
   1. עקוב אחר ההוראות לייצור אליפטית בסעיף 1.4 אלא להשתמש מינימום של 30 מ"ג / תאית מתיל מ"ל להכין מדיום היווצרות אליפטית.
      הערה: כאשר מחומם, 30 מ"ג / מ"ל ​​מתיל תאית צריך לייצר ג'ל סמיך שמחזיק התאים בתרחיף.
   2. דגירת תאים במשך כמה ימים עד שבועות ובמשערת קבועה בהגדלה 10X באמצעות מיקרוסקופ. תאים להתנגד anoikis צריכים להתרבות וליצור מושבות.
   3. לכמת anoikis ידי מדידת כמות וגודל מושבות נוצרו בכל טוב.
      הערה: לאחר מושבות נוצרות, הם עלולים להישטף להסיר את התאית מהתיל המשמשים מבחנים מבוססי אליפטית, כמתואר.

Results

אנו מתארים שיטה גמישה ויעילה כדי ליצור spheroids הבדיד באמצעות צלחות תא דוחים ומדיה היווצרות אליפטית השלימה עם MC. תחת התנאים המתאימים של MC וסרום, תאים בודדים להתיישב לדבוק יחד במרכז הבאר כדי ליצור spheroids עם דבקות מזערית על קרקעית הבאר. שימוש בפרוטוקול זה, spheroids נוצרו מתוך מגוון של שורות תאים (תרשים 2B). טיטרציה של MC וריכוזי נסיוב נדרשה עבור כל קו תא לזהות תנאים אופטימליים שבו אליפטית אחת בלבד נוצרה כי היא איתנה מספיק כדי ...

Discussion

אנו מציגים שיטה מהירה וגמישה להפקת spheroids תאי 3D מודל הארכיטקטורה של רקמות in vivo באמצעות ריאגנטים זול וזמין באופן נרחב. הפרוטוקול שלנו מנצל את המאפיינים הלא-ציטוטוקסיות וקידום-הידבקות של ^{8 MC, 9} לתווך צבירת תא ולמזער היווצרות monolayer התא. בניגוד מטריצות מבוססי חלבון מבודד מן החי, MC הוא אינרטי, אינו מכיל גורמי גדילה, והיא מוסרת בקלות על ידי שטיפה, המאפשר בידוד של spheroids לשימוש במגוון יישומים ללא נוכחות ש...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<חזק>חוצצים
10x פוספט חוצץ מלח	תרמו פישר סיינטיפיק	AM9625
תמיסת סידן כלוריד	סיגמא-אולדריץ'	21114	משמש למאגר כביסה PBS+; אין לבצע חיטוי של מאגר כביסה PBS+ בתוספת
תמיסת סידן כלוריד מגנזיום כלוריד	Sigma-Aldrich	M1028	המשמש למאגר כביסה PBS+; אין לבצע חיטוי של מאגר הכביסה PBS+ בתוספת מגנזיום כלוריד
שם	Company	Catalog	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	לתרבית קווי תאים SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	לטיפוח קו תאי TT
מסנן סרום בקר עוברי	Sigma-Aldrich	F1051	לפני השימוש להסרת מזהמים חלקיקים
מתיל צלולוז	Sigma-Aldrich	M7027	הכנה במים ל-100 מ"ג/מ"ל
מכון הזיכרון רוזוול פארק בינוני	סיגמא-אולדריץ'	R8758	לתרבית HCT-116, קווי תאים BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific		12605028 Dissociation buffer
שם<	strong>חברה	מספר קטלוגי	Comments
>For Invasion Assay
בקר סוג I קולגן	קורנינג משולב	354231	מלאי 3.1 מ"ג/מ"ל; יש לשמור על קרח בעת השימוש
ב-DMEM פנול אדום ללא גלוקוז נמוך	תרמו פישר סיינטיפיק	11054-20	פחות פלואורסצנטי רקע בהשוואה לפנול אדום בתוספת
בינונית קו תאי גליה נגזר גורם נוירוטרופי	פפרוטק	450-10	כימואטרקטורנט
<חזק>שם<	חזק>חברה	<חזק>מספר קטלוגי	<חזק>הערות
<חזק>למיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית
#1.5 מדעי	מיקרוסקופיית אלקטרונים	72225-01	להרכבת ספרואידים כרותים
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	משמש להכתמת אקטין בשעה 1:200
סרום בקר אלבומין	ביושופ קנדה משולב	ALB001	משמש במאגר חסימת BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	נוגד דהייה
גליצרול	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	בשימוש בתוכנה חופשית של תוכנת ImageJ בינונית להרכבה של MOWIOL
	, NIH-משמש		לניתוח תמונה
Microslides	VWR International	48312-024	להרכבת ספרואידים כרותים
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	בשימוש במדיום הרכבה MOWIOL
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	משמש במאגר קיבוע
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	משמש במאגר חדירות