כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.
מבוא
הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או "מתמידים". 1 , 2 המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. 3 , 4 מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. 5 , 6 שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. ב assay במבחנה כי אמצעים מחייב סמים exum case vivo לשעבר תוכנן. מחייב זה נמצא בקורלציה הפוכה עם חדירת סמים גרנולומה במקרה, ומכאן, הואהמשמש כלי ניבוי. 7
שיווי המשקל דיאליזה נחשבת כגישה זהב רגיל למחקרים חלבון פלזמה מחייב. דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) המכשיר מספק מהיר, קל לשימוש מערכת אמינה לביצוע מבחנים כאלה. 8 המכשיר מורכב משני מרכיבים: תוספות חד פעמיות, חד פעמיות המורכבות משני תאים המופרדים על ידי גליל אנכי של קרום חדיר למחצה; ואת לוחות בסיס לשימוש חוזר שיכול להכיל עד 48 מוסיף בכל פעם. קרום דיאליזה יש 8 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) כי הוא אידיאלי עבור מחקרים מקרומולקולה תרופה. היחס בין שטח השטח לנפח גדול של תא הממברנה מאפשר דיאליזה מהירה ושיווי משקל. הן התוספות והן צלחת הבסיס אומתו עבור מחייב מינימלי שאינו ספציפי. השילוב של המכשיר האדום עם טכניקות bioanalytical מספק הערכות מדויקות של שברים unbound של תרופות pLasma. 8 , 9
למרות תוכנן במקור למדוד מחלב פלזמה מחייב, המכשיר האדום כבר בשימוש במספר מחקרים מחייב רקמה באמצעות homogenates. 10 , 11 בפרוטוקול זה, אנו מודדים את התרופה מחייב caseum, פסולת נקרית נכרת מן נגעים נמק חללים של שפעת נגועים ארנבות. האופי ואת לא כלי הדם של חומר caseous עושה את זה קל homogenize לתוך ההשעיה הומוגנית התואמת assay.
בהתחשב בכך caseum מייגע לייצר וקשה לבוא, הפרוטוקול יש גם תוקף לשימוש עם מטריצה פונדקאית כי הוא מוכן מקרופאגים מקציף. THP-1 מונוציטים הנגזרות מקרופאגים הם המושרה עם חומצה אולאית לצבור מספר רב של גופים השומנים המעניקים להם את המראה "מקציף" שלהם. תאים אלה טעון שומנים נקצרים ומעובד כדי לייצר מטריצה שאנחנו משתמשים בתור תחליף כדי caseum. מחקר זה הוכיח כי התרופה קשורה מטריקס זה פונדקאי מתואם היטב עם מחייב caseum, ביעילות מחקה את תהליך vivo כי מעכב חדירת סמים הליבה המקרה של גרנולומות וחללים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3).
1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף
- להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. 12, 13 אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16 שבועות. שלווים ארנבים עם 35 מ"ג / ק"ג קטמין 5 מ"ג / ק"ג xylazine לשריר, להרדים את הארנבים עם 0.22 מ"ל / ק"ג נתרן ו פניטואין נתרן pentobarbital לווריד ולהמשיך עם necropsies.
- באמצעות פינצטה אזמל, להסיר ריאות מן ca החזה. מכל אונה ריאה, לנתח את חללים בודדים גרנולומה נמקית גדולה באמצעות איזמל. בזהירות לגרד את caseum מן החלל ואת הקירות גרנולומה. לשקול, להקליט דגימות החנות ב 2 מ"ל בורג כתרים צינורות ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.
- Gamma- להקרין את דגימות caseum זיהומיות ב 3 MegaRad על קרח יבש כדי להפוך אותם חסרי ובטוח לשימוש במעבדה BSL-2.
2. בשנת הדור גזרתי של Caseum פונדקאי THP-1 תאים
- לגדול THP-1 מונוציטים ב RPMI 1640 בינוני (2 מ"מ L- גלוטמין 10% בסרום עוברי בסרום) ב T175 צלוחיות תרבות התא (80 מ"ל / בקבוק). דגירה את צלוחיות באווירה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
- צנטריפוגה התרבות מבקבוק T175 בשני צינורות 50 מ"ל חרוטי ב 150 xg במשך 5 דקות. מחק supernatant ו להשעות את גלולה 10 מ"ל של התקשורת 1640 RPMI.
- פיפטה 5 μL של תרבות זו לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 45 μL של tכחול. מערבבים היטב לפי pipetting. העברה 10 μL כדי hemocytometer ולספור את מספר monocytes THP-1 קיימא (ללא כתם) באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה 10X). חישוב מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות. לדלל אותו עם התקשורת RPMI לצפיפות הסופית של 1.25 x 10 6 תאים / מ"ל.
- טען 40 מ"ל של התרבות על צלחת תרבות גדולה התא (50 x 10 6 תאים / צלחת). הוסף 40 μL של 100 מיקרומטר PMA (פורבול 12-myristate13 אצטט מוכן באתנול) ולאפשר לתאים לדבוק לילה בחממה.
הערה: הריכוז הסופי של PMA הוא 100 ננומטר. - מדולל חומצה אולאית טהורה (OA) (0.89 גרם / מ"ל) באתנול לריכוז של 0.1 M ( כלומר 31.7 OA μL ב 968.3 אתנול μL). לדלל את הפתרון הזה טריים מראש חימם מדיה RMPI לריכוז של 10 מ"מ. לדלל את ההשעיה OA ל 0.4 מ"מ (ריכוז עובד הסופי) בינוני RPMI מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את המדיה הקיימת ולא אתתאים -adhered מן צלחות תרבית תאים ולהוסיף בעדינות 40 מ"ל של 0.4 מ"מ OA אל מקרופאגים THP-1 (THP-M). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה לילה.
- שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה 40x חזותי לאשר הנוכחות של תכלילים גוף שומנים רבים בכל THP-M. הסר את כל מדיום RPMI מן צלחות תרבית תאים בעדינות לשטוף את התאים החסידים פעמים עם בופר פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגיות 50 מיליליטר.
הערה: גופים ליפידים להופיע קטן, ברור, מבנים כדוריים בציטופלסמה של THP-M. - להוסיף 40 מ"ל של 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS על כל צלחת. דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הפרידו את מקרופאגים מקציף (FM) על ידי pipetting מעלה שוב ושוב ושוב על פני השטח של צלחת כולו באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב ב XG 150 עבור 5 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של PBS (לשטוף PBS השלישי) אnd להעביר צינורות חרוטי טרום שקל 15 מ"ל. ספין למטה שוב ב XG 150 עבור 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה, נושא הפסולת סרולוגיות.
- הנושא את כדורי FM כדי 3 מחזורים להקפיא להפשיר כדי lyse תאי דגירה אותם 75 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לפגל חלבונים במטריצה. אחסן את כדורי נייר -20 ° C עד מוכן לשימוש.
Assay 3. דיאליזה ראפיד איזון (RED)
- כן 10 מניות פתרונות מ"מ של כל תרכובות בדיקת sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל את 500 מיקרומטר עובד פתרונות DMSO לפני כל assay.
- לשקול את הצינור המכיל את הגלולה הפונדקאית caseum. הפחת משקל הצינור הריק כדי לגזור את המשקל של הגלולה לבד. להוסיף 2-3 חרוזי מתכת לכל צינור ו, באמצעות homogenizer רקמות בבית 1200 משייכות / min 1 דק ', לשבש caseum או המטריצה הפונדקאית ב PBS (1: 9 w / v) כדי להשיג 10x השעיה מדוללת של כל מטריצה.
- ספייק 6.5 μL של 500ΜM הפתרון של המתחם הבדיקה לתוך 643.5 μL של homogenate כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤ 1% DMSO) ו מערבולת.
- מניחים את התוספות האדומות בצלחת הבסיס. הוסף 200 μL של מטריקס סמים ממוסגרת לתא התורם (טבעת אדומה) של כל הוספה אדום ו 350 μL של PBS לתוך כל חדר המקלט. הכן 3 מוסיף עבור כל מתחם הבדיקה (דגימות בשלושה עותקים). צלחת חותם עם דבק צלחת דבק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על thermomixer ב 200 סל"ד (1 xg) במשך 4 שעות.
- לאחר הדגירה, לערבב בעדינות את התוכן של התורם ו המקלט חדרים על ידי pipetting מעלה ומטה 2-3 פעמים. פיפטה 20 aliquots μL של homogenate מתאי התורם ולהוסיף 20 μL של PBS נקי בצינור 1.5 מ"ל (1: 1). באופן דומה, פיפטה 20 aliquots μL של דגימות PBS מתאי המקלט ולהוסיף μL 20 של homogenate נקי (התאמה מטריקס). 8
הערה: התאמת מטריקס מבטלת את neעבור 2 עקומות כיול נפרד (ב homogenate ו PBS) כדי להיעשות לצורך ניתוח כמותי. התוכן של החדר התורם עשוי משקעים לאורך זמן. בעדינות לערבב את התוכן על ידי pipetting לפני הסרת aliquots.
4. כימות LC-MS וניתוח נתונים
- הוסף 160 μL של 1: 1 מתנול: אצטוניטריל המכיל 500 ng / מ"ל diclofenac או 10 ng / מ"ל verapamil (תקן פנימי) על כל צינור ו מערבולת כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות למשקע משקע והעברת supernatants לתוך 96 היטב טוב צלחות היטב עבור ניתוח כרומטוגרפי נוזלי ספקטרומטריית מסה (LCMS). 7
- בניית עקומות כיול מ 1-1,000 ננומטר עבור כל מתחם הבדיקה תוך שמירה על הרכב מטריקס זהה הדוגמאות לעיל. לכמת את הריכוז של מתחם הבדיקה בדגימות של התורם ו המקלט חדרים באמצעות שיטה LC-MS.
- חישוב החלק השבריר ( f u ) oF התרופה במטריצה מדוללת באמצעות משוואה 1. חשבה את f u במטריצה חייה באמצעות משוואה 2 (D = דילול פקטור של 10). 14
- בדוק את ההתאוששות (מאזן מסה) של כל מתחם באמצעות משוואה 3 לזהות תרכובות עם יציבות / המטבוליזם / בעיות כריכה הלא ספציפיות.
הערה: שחזור בדרך כלל נופל בין 70% ו 130%. 15
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השיגו איזון בין שני התאים. מולקולות קטנות המאוגדים מקרומולקולות כגון חלבונים או שומנים כלואות בתוך התורם גם. ניתוח כמותי של דגימות משני תאים ומאפשר לחשב את השבר מאוגד (ו u)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. 16 נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם חשוב של יעילות התרופה שחפת. לפני כניסתם לתוקף של פרוטוקול זה, לא היו זמינים טכניקות במבחנה שיכול לחזות את ההפצה של תרכובות גילוי תרופות בנגעים caseous. כתוצאה מכך, ההערכה של הפצת סמי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים ל- Johnson & Johnson, ל- TB Alliance, ל- Astra Zeneca, ל- Rib-X ול- Trius Therapeutics על אספקת bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ו- tedized, בהתאמה. ברנדן פרידו, מתיו צימרמן, סטיבן ג'וזווין, אמה ריי-ג'וראדו, ננסי רואל, ליאן לי ודניאלה ויינר סיפקו תמיכה בניתוח MALDI, בשיטות ביואנליטיות, בהכנת תחליף המקרה, בסינתזה כימית ובבידוד של ארנבת ארנבת. עבודה זו התקיימה במימון של קרן ביל ומלינדה גייטס, פרס # OPP1044966 ו OPP1024050 ל V. Dartois, NIH משותפת Instrumentation גרנט S10OD018072, כמו גם מימון משותף של קרן ביל ומלינדה גייטס וולקום Trust עבור מרכז מצוינות עבור אופטימיזציה של עופרת למחלות העולם המתפתח ל P. Wyatt.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ארנבות לבנות ניו זילנדיות | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| קטתזיה (קטמין) 100 מ"ג/מ"ל C3N | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 56344 | |
| אנסד (קסילזין) 100 מ"ג/מ"ל | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 33198 | |
| תמיסת Euthasol (פנטוברביטל נתרן ופניטואין נתרן | Virbac | 710101 | |
| THP-1 קו תאים מונוציטי | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 ס"מ² בקבוק מטופל TC (T175) | פישר סיינטיפיק | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 מדיה ללא גלוטמין | פישר סיינטיפיק | MT-15-040-CV | |
| Hyclone סרום בקר עוברי, גמא מוקרן | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-גלוטמין, צלחת 200 מ"מ | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC, 145 מ"מ x 20 מ"מ, מאוורר | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| חומצה אולאית | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device לוחית בסיס לשימוש חוזר | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| מוסיף מכשיר Pierce RED, 50/קופסה | פישר סיינטיפיק | PI-89809 | |
| כלי להסרת הכנסת פירס אדום | פישר סיינטיפיק | 89812 | |
| חותם צלחת דבק | פישר סיינטיפיק | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 מ"ל (גיבקו) | טכנולוגיות חיים | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| אצטוניטריל | סיגמא | 34998 | |
| מתנול | סיגמא | 34860 | |
| ורפמיל הידרוכלוריד | סיגמא | V4629 | |
| מלח נתרן דיקלופנק | סיגמא | 93484 | |
| תמיסת טריפן כחולה, 0.4% | פישר סיינטיפיק | 15-250-061 | |
| אתנול, 200 הוכחה | פישר סיינטיפיק | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| אביזר הומוגנייזר טחנת חרוזים, חרוזי מתכת בתפזורת | פישר סיינטיפיק | 15-340-158 | |
| 484R קובלט 60 Irradiator | JL שפרד | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip חד פעמי Hemacytometers | פישר סיינטיפיק | 22-600-100 | |
| מיקרוסקופ אור זקוף | Leica | DM1000 | |
| מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בינארית | Agilent | 1260 | |
| ספקטרומטר מסה | AB Sciex | 4000 |
מקורות
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
