כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.
מבוא
הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או "מתמידים". 1 , 2 המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. 3 , 4 מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. 5 , 6 שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3).
1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף
- להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. 12, 13 אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השיגו איזון בין שני התאים. מולקולות קטנות המאוגדים מקרומולקולות כגון חלבונים או שומנים כלואות בתוך התורם גם. ניתוח כמותי של דגימות משני תאים ומאפשר לחשב את השבר מאוגד (ו u)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. 16 נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם חשוב של יעילות התרופה שחפת. לפני כניסתם לתוקף של פרוטוקול זה, לא היו זמינים טכניקות במבחנה שיכול לחזות את ההפצה של תרכובות גילוי תרופות בנגעים caseous. כתוצאה מכך, ההערכה של הפצת סמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים ל- Johnson & Johnson, ל- TB Alliance, ל- Astra Zeneca, ל- Rib-X ול- Trius Therapeutics על אספקת bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ו- tedized, בהתאמה. ברנדן פרידו, מתיו צימרמן, סטיבן ג'וזווין, אמה ריי-ג'וראדו, ננסי רואל, ליאן לי ודניאלה ויינר סיפקו תמיכה בניתוח MALDI, בשיטות ביואנליטיות, בהכנת תחליף המקרה, בסינתזה כימית ובבידוד של ארנבת ארנבת. עבודה זו התקיימה במימון של קרן ביל ומלינדה גייטס, פרס # OPP1044966 ו OPP1024050 ל V. Dartois, NIH משותפת Instrumentation גרנט S10OD018072, כמו גם מימון משותף של קרן ביל ומלינדה גייטס וולקום Trust עבור מרכז מצוינות עבור אופטימיזציה של עופרת למחלות העולם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ארנבות לבנות ניו זילנדיות | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| קטתזיה (קטמין) 100 מ"ג/מ"ל C3N | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 56344 | |
| אנסד (קסילזין) 100 מ"ג/מ"ל | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | 33198 | |
| תמיסת Euthasol (פנטוברביטל נתרן ופניטואין נתרן | Virbac | 710101 | |
| THP-1 קו תאים מונוציטי | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 ס"מ² בקבוק מטופל TC (T175) | פישר סיינטיפיק | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 מדיה ללא גלוטמין | פישר סיינטיפיק | MT-15-040-CV | |
| Hyclone סרום בקר עוברי, גמא מוקרן | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-גלוטמין, צלחת 200 מ"מ | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC, 145 מ"מ x 20 מ"מ, מאוורר | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| חומצה אולאית | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device לוחית בסיס לשימוש חוזר | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| מוסיף מכשיר Pierce RED, 50/קופסה | פישר סיינטיפיק | PI-89809 | |
| כלי להסרת הכנסת פירס אדום | פישר סיינטיפיק | 89812 | |
| חותם צלחת דבק | פישר סיינטיפיק | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 מ"ל (גיבקו) | טכנולוגיות חיים | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| אצטוניטריל | סיגמא | 34998 | |
| מתנול | סיגמא | 34860 | |
| ורפמיל הידרוכלוריד | סיגמא | V4629 | |
| מלח נתרן דיקלופנק | סיגמא | 93484 | |
| תמיסת טריפן כחולה, 0.4% | פישר סיינטיפיק | 15-250-061 | |
| אתנול, 200 הוכחה | פישר סיינטיפיק | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| אביזר הומוגנייזר טחנת חרוזים, חרוזי מתכת בתפזורת | פישר סיינטיפיק | 15-340-158 | |
| 484R קובלט 60 Irradiator | JL שפרד | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip חד פעמי Hemacytometers | פישר סיינטיפיק | 22-600-100 | |
| מיקרוסקופ אור זקוף | Leica | DM1000 | |
| מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בינארית | Agilent | 1260 | |
| ספקטרומטר מסה | AB Sciex | 4000 |
מקורות
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
