Method Article

הכנה במבחנה אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון להיום, הטיפולים כירורגיים תרופתיים הזמינים עבור מחלות לב וכלי דם (CVD) מוגבלים ולעתים קרובות פליאטיבי. במקביל, טיפולי גני תא הם מאוד גישות חלופיות מבטיחות לטיפול CVD. עם זאת, היישום הקליני הרחב של ריפוי גנטי מוגבל מאוד על ידי חוסר מערכות למסירת הגן מתאימות. ההתפתחות של וקטורים למסירת הגן מתאימים יכולה לספק פתרון לאתגרים נוכחיים טיפול בתא. בפרט, חסרונות קיימים, כגון יעילות מוגבלת ושימור תאי נמוך ב האיבר נפצע, ניתן להתגבר על ידי הנדסת תא מתאימה (כלומר, גנטי) לפני ההשתלה. הפרוטוקול המובא מתאר את השינוי החולף היעיל ובטוח של תאי האנדותל באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים פאראמגנטי polyethyleneimine (PEI / MNP) וקטור משלוח מבוסס. כמו כן, האלגוריתם ושיטות לאפיון תאים מוגדרים. Intracellu המוצלחמסירה של microRNA (miR) לתוך האדם ורידים טבורי תאים אנדותל (HUVECs) הושגה מבלי להשפיע על כדאיות התא, פונקציונליות, או תקשורת בין תאיים. יתר על כן, גישה זו הוכחה לגרום השפעה תפקודית חזקה מיר exogenous הציג. חשוב לציין, היישום של וקטור זה מבוסס MNP מבטיח מגנטיזציה התא, עם אפשרויות נלוות של מיקוד מגנטי לא מעקב פולשני MRI. זה עשוי לספק בסיס מגנטי מונחה, מהונדס גנטית תרפויטים תא שניתן לפקח ללא פולשנית עם MRI.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ג'ין וטיפול תא הם כלים רבים עצמה יש פוטנציאל לפתור אתגרים נוכחיים בטיפול CVD. למרות העובדה כי הן הגישות הללו נבדקות כעת בניסויים קליניים, הם עדיין אינם מוכנים ליישום קליני רחב 1. יש לציין, גישה משותפת להתמודדות עם האתגרים של גן לבין טיפול בתא היא לפתח וקטורים למסירת גן רבים תכליתיים מתאימים ליישום קליני. היעדר מערכות למסירת הגן בטוחות ויעילות הוא הדאגה העיקרית של ריפוי גנטי. במקביל, ההנדסה הגנטית של מוצרי הסלולר לפני ההשתלה יכולה להתגבר על האתגרים הרציניים של טיפול בתא, כגון יעילות נמוכה (למשל, בתחום הלב, רק ~ 5% של שיפור תפקודי מושגת פוסט-תאי גזע להשתלת 1 ) ושימור / ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מייתרי טבור אדם בידוד תא התקבלו לאחר לידה מ הודיעו, נשים בריאות שנתנו הסכימו בכתב אל השימוש בחומר זה לצורך המחקר על פי הצהרת הלסינקי. הוועדה האתית של אוניברסיטת רוסטוק אישרה את המחקר הציג (reg. מס '2011 06, ממושכת 23 בספטמבר, 2013).

1. הכנת מתחמי Transfection

  1. Biotinylation של polyethyleneimine (תש"ן).
    1. להתמוסס מסועף PEI במים ultrapure תחת בחישה מגנטית ב 300 - 400 סל"ד עבו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה העיקרית של הפרוטוקול המוצע היא לייצר מגנטי תגובת תאי miR-modified וכדי לנהל האפיון המדויק שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, תאי transfected ביעילות, מגיבים בחירה מגנטית והדרכה לזיהוי באמצעות MRI, יש לקבל.

ראשית, את זהותם של HUVECs מבודד אושרו על ידי מכתים טיפוסי עם CD31 סמן אנדותל (PECAM) (איור 2 א) ועל ידי היכולת ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את ייצור תאי מהונדסים גנטית עמוסה חלקיקים פאראמגנטי לקבלת הנחיות נוספות מגנטית נשלטת שלהם מוצג בפרוטוקול הנוכחי. היישום המוצלח של אסטרטגיה זו מאפשר לפתרון קשיים מסוימים של טיפול בתא, כגון החזקה נמוכה engraftment העני באזור נפצע 2, 3, 4, על ידי מתן מוצר תא למקד אליו להשתלה. יתר על כן, כניסתה סימולטני של חומר גנטי שנבחר כראוי יכולה לקדם מאפייני תא ובכך יכולה להגדיל יתרונות פונקציונליים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ג פולדה (מרכז מיקרוסקופי אלקטרונים, רוסטוק אונ', גרמניה) עבור התמיכה הטכנית ברכישת תמונות TEM של חלקיקים פאראמגנטי מסוננים בביצוע ניתוח רנטגן שלהם. העבודה מתבצעת על רוסטוק RTC נתמכה על ידי המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר גרמניה (FKZ 0312138A, FKZ 316,159 ו VIP + 03VP00241) ואת פומרניה מדינת מקלנבורג-מערב עם הקרנות המבניות של האיחוד האירופי (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 ו ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) ועל ידי DFG (DA 1296-1), ורטיבות-קרן, וקרן הלב גרמנית (F / 01/12). פרנק Wiekhorst נתמכה על ידי תוכנית המחקר FP7 האיחוד האירופי "Nanomag" FP7-NMP-2013-גדול 7.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 עמודי התפלהGE Healthcare17085101המכילים תמיסת ריאגנט נינהידרין בינונית Sephadex G-25
2%סיגמא אולדריץ'7285
גליציןסיגמא אולדריץ'410225
ערכת כימות ביוטין פירסתרמו סיינטיפיק28005
קורא מיקרופלייט דגם 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere חלקיקים פרמגנטייםPromegaZ5481
Millex-HV PVDF מסנןMerckSLHV013SL 0.45 ומיקרו; m
מאזניים 120 מיקרוסקופ אלקטרונים שידורZeissמתח תאוצה 120  גלאי
רנטגן ספירEDAX-Amatek
תרבית תאים פלסטיקTPP
NHS-אסתר אטו 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-אסתר אטו 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA תווית ערכת ITMirus BioMIR 9650
ביוטין אטו 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
קולגן מסוג IV GibcoThermo Scientific17104019
מדיום גידול אנדותל, EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו סיינטיפיק15140122100 יח'/מ"ל, 100 ומיקרו; g/mL
MatrigelBD Biosciences356234
נוגדן נגד PECAM-1Santa Cruzsc-1506
MS MACS עמודותMiltenyi Biotec 130-042-201
Near-IR Live/Dead Cell Stain KitThermo ScientificL10119
Cy3 Colour-Labeled Pre-miR Negative ControlThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" או "Cyanine-miR3" בכתב היד
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo ScientificAM17110"scr-miR" בכתב היד
מעכב סינתטי Anti-has-miR92a-3p Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1 מערכתZeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127תמיסה 4% בכתם
גרעיני PBS DAPIThermo ScientificD1306
NucleoSpin ערכת בידוד RNAMachery-Nagel740955
mirVana miRNA ערכת בידודThermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוךThermo Scientific4366596
StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת AppliedBiosystems
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqMan assayThermo Scientific000431רצף miRNA בוגר: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan assayThermo ScientificHs01547673_m1
RNU6B TaqMan AssayThermo Scientific001093
18S rRNA Endogenous ControlThermo Scientific4333760F
ג'לטיןSigma AldrichG7041
CellTrace Calcein אדום-כתוםתרמו מדעיC34851
PBSPan BiotechP04-53500
BSASigma Aldrich
MACS bufferMiltenyi Biotec 130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7.1 מערכת MRI לבעלי חיים טסלהBruker CorporationA7906
תוכנת ImageJהמכונים הלאומיים לבריאותשודרגה עם מכשיר AngiogenesisAnalyzer (NIH)
MPSתוכנת Bruker Biospin
MatlabMathworks
טבעת מגנט ניאודים magnets4you GmbHRM-10x04x05-Gø 10 מ"מ; שימור הוא ~ 1.3  T, כפייה ו-ge; 955 kA/m
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ערכת הדמיהThermo ScientificC10340
FluorSave ReagentMerck345789
אמבט אולטרסאונדבנדליןאלקטרוני סוג: RK 100 SH
kV

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial CellsMicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

Related Articles