כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
איך אורגניזמים לחוש ולהגיב לטמפרטורות רעילות עדיין הוא הבין היטב. בהמשך, המנגנונים רגישים של המכונות החושיות, כגון בחולים חווים נוירופתיה היקפית או רגישות מושרה פציעה, אינם מתאפיינים גם. המודל תסיסנית הגנטי הצייתן נעשה שימוש כדי לחקור את תאי גנים דרושים זיהוי חום רעיל, אשר הניב גנים שמורים מרובים של עניין. מעט מאוד ידוע זאת על תאי קולטנים חשובים עבור חישה קרה רעילה. למרות, דרוזופילה לא לשרוד חשיפה ממושכת לטמפרטורות קרות (≤10 ºC), ותמנע מגניב, והעדיפה בטמפרטורות חמות מבחני העדפה התנהגותית, איך הם מרגישים ואולי למנוע גירויים קרים רעילים יש רק נחקר לאחרונה.
כאן אנו מתארים ולאפיין הקור הרעיל הראשון (≤10 ºC) assay התנהגותייםדרוזופילה. שימוש בכלי זה assay, אנו מראים חוקרים כיצד איכותיים וכמותית להעריך התנהגויות nociceptive קרות. ניתן לעשות זאת בתנאי תרבות נורמלים / בריאים, או כנראה בהקשר של מחלה, פציעה או רגישות. יתר על כן, ניתן ליישם assay כדי זחלים שנבחרו עבור גנוטיפים רצוי, אשר עשוי להשפיע thermosensation, כאב, או רגישות nociceptive. בהתחשב בכך כאב הוא תהליך שמור ביותר, באמצעות assay ללמוד nociception תרמית נוספת יהיה ללקט הבנה חשובה סביר של תהליכי כאב מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.
מבוא
דרוזופילה הוכיחה להיות שימושי מאוד עבור זיהוי של גנים שמורים הרומן ומעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות. זבובים לספק ערכת כלים גנטיות מתוחכמת ומערכת עצבים פשוטה המאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת עצבית 1, 2, 3, 4 לנתח הבסיסים התאיים ומולקולריים של nociception 5, 6, 7. זחלים הם שימושיים במיוחד עבור ניתוחים אלו, בהתחשב בעובדת מבחני התנהגות עבור מגע עדין 8,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת הזחלים
- רם מניות או צלבים גנטיים בתוך חממת 25 ºC.
- אם culturing צלב, להשתמש 20-25 נקבות בתולה ו 15-20 זכרים לכל בקבוקון המכיל תקשורת זבוב קמח תירס רגילה. אפשר נקבות להטיל ביצים במשך כ 48 שעות לפני העברתי בקבוקון חדש של מזון.
- 4-5 ימים לאחר ליי ביצה, לאסוף הזחלים instar 3 rd של הגנוטיפ הרצוי על ידי התזת בעדינות זרם של מים לתוך המזון וזחלים רגשני, ושופכים את תוכנה אל צלחת פטרי ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
דרוזופילה מהלך זחלים בתנועה פריסטלטיות הכוללת הפסקות מדי פעם, מפנה את ראשו, ואת שינויים בכיוון 22. בתגובה לבקשת מוקד של גירוי קור רעיל אולם, תערוכת זחלי סט של התנהגויות ייחודיות, בניגוד הגליל לרוחב המרתיע חום רעיל גירויים מכאניים. התנהגויות אלו הן גם שונות מתגובות כדי מגע עדין 8, 9, 10 או למגע של החללית בטמפרטורת החדר. ההתנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי להעריך איכותית וכמותית nociception או רגישות nociceptive הזחלים של רקע גנטי שונים, השפעות סביבתיות, ו / או תנאי-induced נזק. מאז assay זה מאפשר יישום מוקד של גירוי קור, עם הכלי הזה אפשר להעריך את הפונקציה של קבוצת משנה של עצב סנסורי פריפריה במיוחד להגיב לטמפרטורות קרות. מעניין, התנהגויות קרות עורר אלה נראים לנצל סוגים שונים של נוירונים חושיים מאלה מופעלים על ידי חום 7, 11, אבל מעגל nociceptiv.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
בקשה לפטנט בארה"ב (CL) ממתינה על העיצוב של החללית הקרה. מידע נוסף על פרטים של מספרים הקטלוגיים קרה חללית ובנייה, וכן ייעוץ נוסף על עיצוב כלי יסופק לפי בקשה.
תודות
אנו מודים שרה וו וקמיל גרהם לפיתוח בשלבים מוקדמים של assay הבדיקה הקר, המרכז במלאי Bloomington תסיסנית מניות זבוב, וחברי מעבדת Galko עבור האנושות לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA (NIH F31NS083306) כדי HNT, ועל ידי NIH R01NS069828, R21NS087360 לבין אוניברסיטת טקסס MD Anderson קלארק המלגה בסיסי מחקר כדי MJG.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Cold | Pro-Dev Engineering | נבנה בהתאמה אישית לפי דרישה | ניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה |
| יחידת בקרה תרמית | TE Technology | מארז בנוי בהתאמה אישית | ניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה |
| מיקרוסקופ Zeiss Stemi 2000 Zeiss | NT55-605 | ||
| Fiber-Lite MI-150 תאורה | בעוצמה גבוההדולן-ג'נר תעשיות. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 אינץ' מדריך אור סיבים אופטיים | Schott צפון אמריקה, בע"מ | שוט A08575 | |
| מלקחיים | FST | FS-1670 | משמש למיון וטיפול בזחלים. הקפד להחליק ולהקהות מעט את קצות המלקחיים כדי להפחית את הסיכון לנקב או לפצוע בטעות את הזחלים |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | משמש למיון וטיפול בזחלים. זה מועיל אם המברשת לחה במהלך השימוש. |
| 35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן | פלקון | 351008 | |
| 60 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן | פלקון | 351007 | |
| חתיכת ויניל שחור (לפחות 2 אינץ' x 2 אינץ') | משמש לספק ניגודיות ולכוון זחלים לבדיקה הקרה | ||
| פישרברנד סקופולה מרית | פישר סיינטיפיק | 14-357Q | משמש להעברת מזון |
| Kimtech Science Kimwipes | פישר סיינטיפיק | 06-666A | משמש לייבוש הזחלים ובדיקה קרה אם יש עודף לחות |
מקורות
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
