הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב

7.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55568

⸱

3 באפריל 2017

 ,  , 
1Department of Genetics, UT MD Anderson Cancer Center, 2Neuroscience Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 3ProDev Engineering, 4Genes and Development Program, Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, 5Section of Neurobiology, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

תקציר

איך אורגניזמים לחוש ולהגיב לטמפרטורות רעילות עדיין הוא הבין היטב. בהמשך, המנגנונים רגישים של המכונות החושיות, כגון בחולים חווים נוירופתיה היקפית או רגישות מושרה פציעה, אינם מתאפיינים גם. המודל תסיסנית הגנטי הצייתן נעשה שימוש כדי לחקור את תאי גנים דרושים זיהוי חום רעיל, אשר הניב גנים שמורים מרובים של עניין. מעט מאוד ידוע זאת על תאי קולטנים חשובים עבור חישה קרה רעילה. למרות, דרוזופילה לא לשרוד חשיפה ממושכת לטמפרטורות קרות (≤10 ºC), ותמנע מגניב, והעדיפה בטמפרטורות חמות מבחני העדפה התנהגותית, איך הם מרגישים ואולי למנוע גירויים קרים רעילים יש רק נחקר לאחרונה.

כאן אנו מתארים ולאפיין הקור הרעיל הראשון (≤10 ºC) assay התנהגותייםדרוזופילה. שימוש בכלי זה assay, אנו מראים חוקרים כיצד איכותיים וכמותית להעריך התנהגויות nociceptive קרות. ניתן לעשות זאת בתנאי תרבות נורמלים / בריאים, או כנראה בהקשר של מחלה, פציעה או רגישות. יתר על כן, ניתן ליישם assay כדי זחלים שנבחרו עבור גנוטיפים רצוי, אשר עשוי להשפיע thermosensation, כאב, או רגישות nociceptive. בהתחשב בכך כאב הוא תהליך שמור ביותר, באמצעות assay ללמוד nociception תרמית נוספת יהיה ללקט הבנה חשובה סביר של תהליכי כאב מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.

מבוא

דרוזופילה הוכיחה להיות שימושי מאוד עבור זיהוי של גנים שמורים הרומן ומעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות. זבובים לספק ערכת כלים גנטיות מתוחכמת ומערכת עצבים פשוטה המאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת עצבית 1, 2, 3, 4 לנתח הבסיסים התאיים ומולקולריים של nociception 5, 6, 7. זחלים הם שימושיים במיוחד עבור ניתוחים אלו, בהתחשב בעובדת מבחני התנהגות עבור מגע עדין 8, 9, 10, חום רעיל 11, 12, 13 ו תחושה מכאנית של גירוי מזיק 4, 11 כבר הוקמו, ואת לציפורן הזחל השקופה מאפשרת הדמיה לחיות או קבועה של האפידרמיס העצב סנסורי בסיסי. לאחרונה, ב assay עבור קר רעיל גם פותח 7, אשר אנו מתארים בפירוט רב יותר כאן.

באמצעות בדיקה קרה בסדר, קוניים שקצהו, אנו מראים כי תערוכת זחלים תסיסנית סט של התנהגויות תגובתי קרות ספציפיות, נבדל התנהגויות שנצפו בזמן תנועה נורמלית, הבאים במגע עדין, או אחרי גירויי טמפרטורה מכאניים או גבוהים קשים 7, 8, 11 . ההתנהגויות הקרות ספציפיות כוללות התכווצות גוף מלא וחזקה (CT), העלאת 45-90º המגזרים האחוריים (יח"צ) ו העלאה זמנית של הקדמי ואת הפלח אחורי לתוך בצורת U (ארה"ב). השכיחות של התנהגויות אלה מגדילה עם טמפרטורות ופוחתות אך כל פסגות בבית היםטמפרטורות שונות קרות בקלילות. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך תגובות CT מתווכות על ידי עצב סנסורי פריפריה שונה מאלו להגיב חום רעיל או גירויים מכאניים קשים 7.

בדומה קולטן אזעקה החולייתנים, דנדריטים מרובים דרוזופילה (MD) עצב סנסורי הפריפריה יש מבנים דנדריטים מורכבים arborize מעל האפידרמיס 1. נוירונים MD נמצאים בכל מגזר גוף הזחל, מקרין האקסונים שלהם כדי העצב בחוט הגחון 14. עצב סנסורי MD מופרד לארבע כיתות שונות (I-IV) המבוססות על מורפולוגיה הדנדריטים ויש לי משתנה פונקציות חושיות 4, 9, 10, 15, 16, 17. בעוד נוירונים IV בכיתה נדרשים עבור תגובות רול גוף לרוחב זחללטמפרטורות גבוהות או גירויים מכאניים קשים III נוירונים 4, בכיתה נדרשות עבור תגובות מגע עדין 9, 10 ו לא מופעלים רק על ידי קר, אלא גם נדרשים עבור התגובות התנהגותיות הקרות עורר 7. שני נוירונים IV III ומעמד בכיתה לנצל ערוצי פוטנציאל הקולטן חולף דיסקרטיים (TRP) כדי להקל על תגובות התנהגותיות 7 רעילים, 11, 18 ו גירויים שאינם רעיל 9, 10, 17, 19. בהמשך, nociception הזחל הוא רגיש לפציעה הבאה, ברמה התאית 20 והתנהגותיים 12, 21.

Assay המתואר כאן מאפשר quantification של אחד נורמלי, או פוטנציאל לשנות תגובות התנהגותיות לטמפרטורות קרות החל קר מזיק (≤ 10 ºC), מגניב מזיק (11-17 ºC), כדי בטמפרטורות הסביבה (18-22 ºC). הטמפרטורות הקרות המשמשות assay זה מסוגלות מפעיל ישירות בכיתת III נוירונים חושיים, לעורר עליות סידן חזקות, לשחזור קר עורר תגובות התנהגותיות, אשר יכולה להיות איכותית וכמותית נתחו 7. ניתן ליישם assay זה כדי זחלים של כל גנוטיפ כמעט כמו גם זחלים חשופים לתנאים סביבתיים מגוונים (תזונת שינה, פגיעה, סוכנים תרופתיים) כדי לקבוע שניהם גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים nociception הקר, רגישות nociceptive או פלסטיות nociceptive. בהתחשב בכך thermosensation הוא נמצא בכל מקום על פני מינים רבים, assay זה מספק כלי רב ערך לחקר nociception ועלול לחשוף מטרות גן רומן או אינטראקציות עצביות שתשפרנההבנתנו nociception חוליות.

החללית הקרה שהותקנה (ראה בדיקה קרה, טבלת החומרים) מנצלת טמפרטורת לולאה סגורה מבוקרת מכשיר פלטייה, אשר מקרר את פיר אלומיניום טיפ חרוטים באמצעות הולכה תרמית. Thermistor מוטבע בתוך קצה קוני אלומיניום מדווח הטמפרטורה בזמן אמת על יחידת הבקרה. כיור ומאוורר מחוברים מודול התרמו להסדיר את עומס החום של אפקט פלטייה (קוו) ולכן טווח הטמפרטורה הרצויה של (22-0 מעלות צלזיוס) יכול להיות מושגת (ראה יחידת בקרת תרמית, ענייני חומרים). הגירוי הקר המזיק של בדיקת הקצה הקר מוחל ביד אל קו אמצע הגב, כדי לפלח (הים) במרחק שווה מן הקצוות קדמיים וגם אחוריים (בערך קטע A4, לראות באיור 1 א) של הזחל. בתגובה לגירויים קרים, זחלים בדרך כלל לייצר אחד משלוש התנהגויות קרות עורר בתוך החיתוך של 10: גוף מלאהתכווצות (CT), העלאה 45-90º של מגזרים קדמיים וגם אחוריים לתוך בצורת U (ארה"ב), או העלאה של המגזרים האחוריים (יח"צ) (המתוארים תוצאות). אף אחד ההתנהגויות אלה מבוצעים בזמן תנועה פריסטלטיות רגילה או התנהגות שיחור מזון. התנהגויות אלו הן גם נבדלים תגובות מגע עדינות התגובה מתגלגלת מרתיעת טמפרטורה גבוהה או גירויים מכאניים רעילים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת הזחלים

  1. רם מניות או צלבים גנטיים בתוך חממת 25 ºC.
    1. אם culturing צלב, להשתמש 20-25 נקבות בתולה ו 15-20 זכרים לכל בקבוקון המכיל תקשורת זבוב קמח תירס רגילה. אפשר נקבות להטיל ביצים במשך כ 48 שעות לפני העברתי בקבוקון חדש של מזון.
  2. 4-5 ימים לאחר ליי ביצה, לאסוף הזחלים instar 3 rd של הגנוטיפ הרצוי על ידי התזת בעדינות זרם של מים לתוך המזון וזחלים רגשני, ושופכים את תוכנה אל צלחת פטרי בגודל בינוני, נקי (60 מ"מ x 15 מ"מ).
  3. הבא, ולמיין זחלים בעדינות בעזרת מלקחיים באמצעות גודל או מכחול כדי למנוע גדול "נדודי 3 rd instar" או זחלים חולניים קטנים מ נבדק. זחלי מחק המכילים כל סמנים גנטיים או מאזנים רצויים.
  4. יש מאכלי תווית חבר במעבדת בחור או מכולות שבו זחלים ממוינים יוצבו כך הנסיין יכול להיות "עיוור" על האקסתנאי או הגנוטיפ perimental של הזחלים אם רלוונטי. הנסיין יכול להחיל תוויות מפוענחות נתונים שנאספו לאחר הניסוי באמצעות מפתח שנוצר על ידי חברי מעבדה.
  5. באמצעות scoopula, להעביר סכום פרוטה בגודל של מזון טרי לתוך (35 מ"מ x 10 מ"מ או 60 מ"מ x 15 מ"מ) נקי, מלא צלחת פטרי שכותרתו בחצי הדרך עם מים בטמפרטורת החדר.
  6. בעדינות להזיז את הזחלים הממוינים על המזון (כדי למנוע רעב או התייבשות אם צפויות בדיקות לקחת יותר מ 20 דקות) באמצעות מלקחיים או מכחול.

2. הקרה Probe Assay

  1. הפעל את יחידת הבדיקה הקרה המאפשרת כמה דקות עד שיתקרר לטמפרטורה הרצויה. אם הגדרתי לטמפרטורות נמוכות, התעבות תהווה סבירה לאורך החללית.
  2. נקה את כל עודף לחות עם מעבדה לנגב לפני בקשת הזחל. כאשר אינו בשימוש מיידי, במקום בידוד כובע על החללית לשני לבודד וכדי לשמור על קצה נקי ולמנוע נזק.
  3. מניח זחל instar באמצע 3 rd גבי פיסת דקה של ויניל נייד הכהה (בדרך כלל, להשתמש חתיכה קטנה לחתוך מתוך קלסר מחברת) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. העזרים ויניל השחורים להדמיה ניגודיות בהעברת הזחל מבלי לגעת בו כדי ליישר את זה כמו שצריך עם החללית.
  4. כוון את המיקרוסקופ (ראו טבלה של חומרים) ויחידת אור (ראו טבלה של חומרים) כדי בהירות בינונית (בהירות מקסימום 50-75%) לספק בניגוד ולמנוע הזחל מהתייבשות מהר מדי.
  5. לבטל את כל זחלים אינם מציגים נורמליות ראשון נידות פריסטלטיות כפי שיכלו לבלבל את התוצאות. הזחל צריך להיות לח מצלחת פטרי של מים אחרים הזחל תדבק ויניל עיכוב תנועה נורמלית. מים צריכים לא רופסים סביב הזחל.
  6. Advance החללית ביד לכיוון הזחל בזווית 90º לצייר גוף anteroposterior, באמצעות ויניל כדי להזיז את הזחל לתוך corעמדת rect (ראה איור 1 א).
  7. כוון את הקצה של החללית להניח בעדינות על פני השטח הגבה באמצע של הזחל עם החללית בזווית של כ -45 אל במת מיקרוסקופ.
  8. במגע חללי, להפעיל טיימר מעבדה. החל מספיק לחץ כלפי מטה על מנת להגדיל את כניסת המשטח מעט של לציפורן הזחל תוך התרה קדימה או תנועה לאחור.
  9. החזק בדיקה במקום עד 10 s או עד לתגובה ההתנהגותית קר עורר הוא ציין - המוקדם מביניהם. ואז להסיר את החללית.
  10. רשום את התגובה ההתנהגותית שנצפתה ואת חביון התגובה. זחלים כי לא ישיבו תוך 10 ימים נחשבים "לא מגיב". זמן אחזור יכול גם להיות מוקלט עבור מגיבים ומשמש למדידת שינויים / משרעת חוסן תגובה.
  11. בטל זחל ולהכין את הבא.
  12. חזור על שלבי 2.3-2.11 עד המספר הרצוי של זחלי מבחן הוא הגיע (שלושה סטים של n = 20-40 זחלים היו used כאן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

דרוזופילה מהלך זחלים בתנועה פריסטלטיות הכוללת הפסקות מדי פעם, מפנה את ראשו, ואת שינויים בכיוון 22. בתגובה לבקשת מוקד של גירוי קור רעיל אולם, תערוכת זחלי סט של התנהגויות ייחודיות, בניגוד הגליל לרוחב המרתיע חום רעיל גירויים מכאניים. התנהגויות אלו הן גם שונות מתגובות כדי מגע עדין 8, 9, 10 או למגע של החללית בטמפרטורת החדר. ההתנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי להעריך איכותית וכמותית nociception או רגישות nociceptive הזחלים של רקע גנטי שונים, השפעות סביבתיות, ו / או תנאי-induced נזק. מאז assay זה מאפשר יישום מוקד של גירוי קור, עם הכלי הזה אפשר להעריך את הפונקציה של קבוצת משנה של עצב סנסורי פריפריה במיוחד להגיב לטמפרטורות קרות. מעניין, התנהגויות קרות עורר אלה נראים לנצל סוגים שונים של נוירונים חושיים מאלה מופעלים על ידי חום 7, 11, אבל מעגל nociceptiv...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

בקשה לפטנט בארה"ב (CL) ממתינה על העיצוב של החללית הקרה. מידע נוסף על פרטים של מספרים הקטלוגיים קרה חללית ובנייה, וכן ייעוץ נוסף על עיצוב כלי יסופק לפי בקשה.

תודות

אנו מודים שרה וו וקמיל גרהם לפיתוח בשלבים מוקדמים של assay הבדיקה הקר, המרכז במלאי Bloomington תסיסנית מניות זבוב, וחברי מעבדת Galko עבור האנושות לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA (NIH F31NS083306) כדי HNT, ועל ידי NIH R01NS069828, R21NS087360 לבין אוניברסיטת טקסס MD Anderson קלארק המלגה בסיסי מחקר כדי MJG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ColdPro-Dev Engineeringנבנה בהתאמה אישית לפי דרישהניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה
יחידת בקרה תרמיתTE Technologyמארז בנוי בהתאמה אישיתניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה
מיקרוסקופ Zeiss Stemi 2000 ZeissNT55-605
Fiber-Lite MI-150 תאורהבעוצמה גבוההדולן-ג'נר תעשיות.A20500
Schott Dual Gooseneck 23 אינץ' מדריך אור סיבים אופטייםSchott צפון אמריקה, בע"משוט A08575
מלקחייםFSTFS-1670משמש למיון וטיפול בזחלים. הקפד להחליק ולהקהות מעט את קצות המלקחיים כדי להפחית את הסיכון לנקב או לפצוע בטעות את הזחלים
PaintbrushDick Blick Art Materials06762-1002משמש למיון וטיפול בזחלים. זה מועיל אם המברשת לחה במהלך השימוש.
35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירןפלקון351008
60 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירןפלקון351007
חתיכת ויניל שחור (לפחות 2 אינץ' x 2 אינץ')משמש לספק ניגודיות ולכוון זחלים לבדיקה הקרה
פישרברנד סקופולה מריתפישר סיינטיפיק14-357Qמשמש להעברת מזון
Kimtech Science Kimwipesפישר סיינטיפיק06-666Aמשמש לייבוש הזחלים ובדיקה קרה אם יש עודף לחות

מקורות

  1. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
  3. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
  4. Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
  5. Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
  6. Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
  7. Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
  8. Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
  9. Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
  10. Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
  11. Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
  12. Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
  13. Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837(2012).
  14. Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  15. Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
  16. Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
  17. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
  18. Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343(2011).
  19. Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39(2012).
  20. Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735(2015).
  21. Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
  22. Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
  23. Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).
  24. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
  25. Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
  26. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  27. Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
  28. Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
  29. Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
  30. Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת קור מזיקתגובה התנהגותיתגשושית קורנוציפציה תרמיתניתוח גנטיבדיקות התנהגותיותביטוי גניםדימות פלואורסצנטי
Assay רומן עבור הקרה Nociception ב
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.