אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

Summary

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

Abstract

במחקר של תאי גזע בוגרים ומנגנונים רגנרטיבית, תולעים שטוחות planarian הן מצרך במערכת מודל vivo. הדבר נובע במידה רבה האוכלוסייה ויכולת תאי גזע פלוריפוטנטיים בשפע שלהם כדי להתחדש כל סוגי תאים ורקמות לאחר פציעות כי יהיה קטסטרופלי עבור רוב החיות. לאחרונה, planarians זכה לפופולריות כמודל התחדשות עין. היכולת שלהם להתחדש העין כולה (המורכב משני סוגי רקמות: תאי פיגמנט קולטני האור) מאפשר דיסקציה של מנגנוני ויסות התחדשות מערכת הראייה. יש עיניים אבלציה מספר יתרונות על פני שיטות אחרות (כמו עריפת ראש או ניקוב חורים) לבחינת מסלולים ספציפיים העין ומנגנונים, שהחשוב בהם הוא התחדשות התאים היא מוגבלת בעיקר ברקמות העין לבד. מטרת מאמר זה וידאו היא להדגים כיצד להסיר את הכוס האופטית planarian מהימנה מבלי להפריע למוח או רקמות סובבות.טיפול תולעים והתחזוקה של מושבה הוקמה מתואר גם. טכניקה זו משתמשת 31 G, 5/16-inch מחט אינסולין כדי בניתוח לגרוף את הכוס האופטית של planarians משותקת על צלחת קרה. שיטה זו כוללת הן אבלציה עין אחת כפולה, בעיניים התחדשות בתוך 1-2 שבועות, המאפשר מגוון רחב של יישומים. בפרט, בטכניקה זו אבלציה ניתן לשלב בקלות עם מסך (התערבות RNA) תרופתי וגנטי עבור הבנה טובה יותר של מנגנון שיקום וההתפתחות שלהם, תאי גזע עין והתחזוקה שלהם, ותגובות התנהגותיות phototaxic ואת הבסיס הנוירולוגי שלהם.

Introduction

Planarians הם אורגניזם מודל עוצמה לחקר התחדשות גזע בוגרים בתיווך התא. Flatworms המתוק שאינו טפיל אלה להחזיק את היכולת להתחדש כל וכל רקמות חסרות, כוללים מערכת המוח ¹ העצבים המרכזיים שלהם. למד לאחור ככל ה -1700 ^2, ההתקדמות הטכנולוגית בתחום planarian במהלך 10-15 השנים האחרונות (כגון הגנום רצף, הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, התערבות RNA (RNAi), ו transcriptomics) עדכנת אורגניזם מודל היסטורי זה . באופן ספציפי, planarians צבר פופולריות לאחרונה כמודל המתעורר למחקר עין ^3.

יש Planarians עי....

Protocol

1. התרבות טיפול בבעלי חיים

הערה: פרוטוקול זה משתמש Schmidtea Mediterranea, זן planarian דיפלואידי עם הגנום רצף ^{16, 17,} כי הוא נפוץ למחקר התחדשות. עם זאת, assay הוא פחות מוצלח עם מינים אחרים, כגון Girardia tigrina ו Girardia dorotocephala (אשר זמינים מסחרית).

1. לשמור תולעים "מי תולעת" עשויים מלחי ים 0.5 g / L ב ultrapure (או יונים מסוננים) מים. השתמש מכלות פוליפרופילן או זכוכית סטר....

Results

עבור ניתוח 1-2 שעות לאחר הראשונה, חיות עשויות להפגין ירידה בתנועה לעומת תולעים שלמים (אולם הם עדיין יעברו). אם תרצה, תולעים יאכלו בתוך 24 שעות של ניתוח (למשל, עבור האכלת RNAi). כאשר בעקבות התחדשות עין באותו אנשים לאורך זמן, הקפד לצלם כל תולעת הן לפני הניתוח (שלמים) ובבית 1 שעות לאחר אבלציה (hPa). עד 4 ימים לאחר אבלציה (DPA) תאי הפיגמנט התחדשות צריכים להיות גלויים, ועל ידי 14 DPA העין כולו תהיה מחדש לחלוטין (איור 3A-B). זה כולל את ה.......

Discussion

טכניקת עין אבלציה זה משפרת על השיטות הקיימות (כגון ניקוב חורים) על ידי לא כולל רקמות המוח הגבלה כריתה בעיקר ברקמות העין. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי רוב האנשים, מטכנאים מנוסים microsurgeries לסטודנטים לתואר ראשונים מנוסים אבל מצפון. מומלץ כי הטכניקה הזו להיות מתורגל הרבה פעמים לפני השימוש כריתה בניסויים, כולל (במידת האפשר) אישור של הסרה מלאה של כל רקמות העין על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתרו עבור סמן העין (ים) ^4,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מלחי ים אינסטנט אוקיינוס	ספקטרום מותגים	קופסת SS15-10	"10 ליטר"  (משקל נטו 3 ליברות)
מגבון טישו ללא מוך Kimwipes EX-L	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 אינץ'
נייר סינון Whatman #2	Sigma		WHA1002125 עיגולים, קוטר 125 מ"מ,
לבן מזרק אינסולין Easy Touch (עם מחט)	Pet Health Market	17175-04	מזרק U-100 1 סמ"ק, 31 גרם 5/16 במחט
100 מ"מ צלחת פטרי	VWR	25384-342	100 מ"מ x 15 מ"מ
60 מ"מ צלחת פטרי	VWR	25384-092	60 מ"מ x 15 מ"מ
דומונט #5  מלקחיים	Fine Science Tools	11254-20	Inox, קצה ישר, פיפטות העברה 11 ס"מ
nbsp;	סמקו סיינטיפיק	225	בוגר, נורה גדולה, 7.5 מ"ל, לא סטרילי
Parafilm M סרט פרפין	מותג	701606	4 אינץ' x 125 רגל גליל
12 באר צלחת תרבית רקמות לא מטופלת	VWR	15705-059	מטופל, תחתית שטוחה, סטרילית, מיכלי מזון מפלסטיק של מותג פלקון
(למושבה)	Ziploc	מלבן גדול	2.25 qt (2.12 ליטר), 10 אינץ' x 6 -3/4 אינץ' x 3 -3/16 אינץ'
Planaria (Girardia tigrina)	132954 ביולוגי קרוליינה		נמכר כ-Planaria "חום"; לרוב הם G. tigrina (הידוע גם בשם Dugesia tigrina), אך לפעמים הם G. dorotocephala (הידוע גם בשם Dugesia dorotocephala); שניהם יעבדו.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea אינם זמינים מסחרית. בשלב זה ניתן להשיג בעלי חיים רק ממעבדות המשתמשות בהם ויש להן בעלי חיים נוספים.
מגבות נייר חומות	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8 אינץ' מגבת נייר מרובת שכבות 1 שכבות, בקבוק כביסה לא מולבן
(למי תולעים), בקבוקי כביסה אופציונליים	VWR	16650-275	, פוליאתילן בצפיפות נמוכה, פה רחב, 500 מ"ל
נוגדן נגד סינפסין,	מחקרים התפתחותיים	3C11	Supernatant
נוגדן נגד מעצר, אופציונלי	n/a	n/a	לא זמין מסחרית. מתנה אדיבה ממייקל לוין, אוניברסיטת טאפטס
Nalgene Lowboy קרבוי עם שקע (לאחסון מי תולעים), אופציונלי	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,   פוליפרופילן, פרופיל נמוך מקל על מילוי מיכלי מושבת פלסטיק
צלחת פלטייר מותאמת אישית,	מכונת וויליאמס אופציונלית, פוקסבורו, MA	פרטי	העיצוב באדיבות ג'ונג'י מורוקומה, אוניברסיטת טאפטס:  צלחת פלטייר בנויה ממשאבת חום תרמו-אלקטרית סטנדרטית (לדוגמה, קטלוג All Electronics Corp # PJT-1, 30 מ"מ2).  משאבת החום המרובעת מכוסה במשטח מראה דק, ואז ממוקמת בתוך חור מרובע של 30 מ"מ2 בצורת פרספקס עגול (קוטר ~50 מ"מ). צורה זו היא בעובי דומה למשאבת החום, ומתאימה לתוך באר המכוונת במרכז צלעות-קירור עגולות (קוטר ~115 מ"מ). משאבת הטופס/חום היא  "מעוגן" לכיור עם תרכובת גוף קירור על בסיס סיליקון. המוליכים מושחלים דרך חורים שנקדחו הן דרך הטופס והן דרך גוף הקירור. החצי התחתון של גוף הקירור מחובר ל"רגל" שמתאים לפתח לוחית הבסיס של המיקרוסקופ שלך.
מקור מתח DC (עבור פלטת פלטייר), B & אופציונלי	ספק כוח DC	1665	במתח נמוך, 1-18 וולט (DC), 1-10 אמפר.
אספקה נפוצה
כפפות
סכין גילוח
מספריים
ניתוח היקף עם תאורת
משענות צ'ופסטיק, אופציונלי