הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם

16.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55615

⸱

23 ביוני 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Technology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Sciences, 2University of Science and Technology of China, 3Department of Physics and Astronomy, University of Manitoba, 4Department of Biosystems Engineering, University of Manitoba, 5Seven Oaks General Hospital, 6Department of Immunology, University of Manitoba, 7Department of Biological Sciences, University of Manitoba

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק את השיטה המפורטת של ביצוע assay chemotaxis נויטרופילי מהיר על ידי שילוב של בידוד שבב נויטרופילי מן הדם כולו ואת הבדיקה chemotaxis על שבב microfluidic יחיד.

תקציר

הגירה נויטרופילי chemotaxis הם קריטיים עבור המערכת החיסונית של הגוף שלנו. מכשירים Microfluidic משמשים יותר ויותר לחקר נדידת נויטרופילים chemotaxis בשל היתרונות שלהם להדמיה בזמן אמת, שליטה מדויקת של ריכוז כימי הדרגתיות הדרגתית, מופחתת מגיב וצריכה מדגם. לאחרונה, מאמץ גדל והולך נעשה על ידי חוקרים microfluidic לעבר פיתוח משולב ופעל בקלות microfluidic chemotaxis ניתוח מערכות, ישירות מכל הדם. בכיוון זה, שיטת All-on-chip הראשונה פותחה עבור שילוב הטיהור השלילי המגנטי של נויטרופילים ואת assay chemotaxis מדגימות נפח דם קטן. שיטה חדשה זו מאפשרת מהירה דגימה אל נויטרופיל הבדיקה chemotaxis הבדיקה ב 25 דקות. במאמר זה, אנו מספקים בנייה מפורטת, ניתוח שיטת ניתוח נתונים עבור assay זה כל שבב chemotaxis assay עם דיון על אסטרטגיות לפתרון בעיות, limiציורים וכיוונים עתידיים. תוצאות נציג של assay chemotaxis נויטרופילי בדיקות chemoattractant מוגדר, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), ואת כיח מחולה מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), תוך שימוש בשיטה זו על כל שבב מוצגים. שיטה זו חלה על חקירות רבות הקשורות להעברת תאים ויישומים קליניים.

מבוא

Chemotaxis, תהליך של הגירה תא מכוון לשיכוך מסיס ריכוז כימי, הוא מעורב באופן קריטי בתהליכים ביולוגיים רבים כולל תגובה חיסונית 1 , 2 , 3 , פיתוח רקמות 4 וגרורות סרטן 5 . נויטרופילים הם תת-הדם השופע ביותר בתאי הדם הלבנים וממלאים תפקידים מכריעים בהפיכת פונקציות ההגנה המארחת של הגוף, כמו גם בתיווך של תגובות חיסוניות אדפטטיביות 6 , 7 . נויטרופילים מצוידים במנגנון chemotactic מוסדר מאוד המאפשר לתאי החיסון המווסתים להגיב לתאי chemoattractants שמקורם בפאתוגן ( למשל fMLP) ומנגנוני chemoattractants ( לדוגמה אינטרלוקין 8). הגירה נויטרופילי chemotaxis לתווך בעיות פיזיולוגיות שונותומחלות כגון דלקת וסרטן 1 , 9 . לפיכך, הערכה מדויקת של chemotaxis נויטרופילי מספק readout תפקודית חשובה לחקר הביולוגיה נויטרופילי מחלות הקשורות.

לעומת מבחני chemotaxis קונבנציונאלי בשימוש נרחב ( למשל assay transwell 10 ), התקנים microfluidic להראות הבטחה גדולה להערכה כמותית של נדידת תאים chemotaxis בשל הדור מדוייק כימית מדויק הדור מזעור 11 , 12 , 13 . במהלך שני העשורים האחרונים או כך, מכשירים microfluidic שונים פותחו כדי לחקור את chemotaxis של סוגי תאים ביולוגיים שונים, במיוחד נויטרופילים 11 . מאמץ משמעותי הוקדש לאפיון הגירה נויטרופילים ב-ספטיוטומפוראלי מדרגיות mical שהוגדרו התקנים microfluidic 14 , 15 . אסטרטגיות מעניינות פותחו גם כדי ללמוד החלטות כיוונית על ידי נויטרופילים באמצעות מכשירים microfluidic 16. מלבד מחקר ביולוגי, היישומים של התקנים microfluidic הורחבו לבחון דגימות קליניות להערכת המחלה 17 , 18 , 19 . עם זאת, השימוש במכשירים microfluidic רבים מוגבל מעבדות מחקר מיוחד דורש בידוד נויטרופילי ארוך מנפח גדול של דגימות דם. לכן, חלה מגמה הולכת וגדלה של פיתוח מכשירים משולבים microfluidic עבור ניתוח chemotaxis נויטרופילי מהיר ישירות טיפה של דם שלם 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

לכיוון זה, שיטת All-on-chip פותחה המשלבת את הטיהור נויטרופילי המגנטי שלילי ואת assay chemotaxis הבאים על מכשיר microfluidic יחיד 25 . שיטה זו על כל שבב יש את התכונות הרומן הבא: 1) בניגוד אסטרטגיות שבב הקודם לבודד נויטרופילים מן הדם על ידי הידבקות תא מבוסס הדבקה או גודל התא מבוסס סינון 20 , 22 , שיטה חדשה זו מאפשרת גבוהה טוהר, על שבב הפרדה מגנטית של נויטרופילים מ כרכים קטנים של דם שלם, כמו גם מדידה chemotaxis על גירוי chemoattractant; 2) מבנה עגינה התא מסייע ליישר את העמדות הראשוניות של נויטרופילים קרוב לתעלה כיוונית כימיים ומאפשר ניתוח chemotaxis פשוטה ללא מעקב תא יחיד; 3) שילוב של בידוד נויטרופילי וכימותAssay ציר על מכשיר microfluidic יחיד מאפשר מהיר מדגם ניתוח ניתוח chemotaxis ב 25 דקות, כאשר אין הפרעה בין צעדים ניסיוניים.

מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט עבור הבנייה, ניתוח שיטת ניתוח נתונים של assay זה על שבב chemotaxis assay. המאמר מדגים את השימוש היעיל בשיטה שפותחה עבור ביצוע chemotaxis נויטרופילי על ידי בדיקת chemoattractant רקומביננטי ידוע דגימות chemotactic מורכבים מהחולים, ואחריו דיון על אסטרטגיות פתרון בעיות, מגבלות וכיוונים עתידיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל פרוטוקולי איסוף המדגם של בני האדם אושרו על ידי מועצת המחקר המשותפת של הפקולטה למחקרי מחקר באוניברסיטת מאניטובה, ויניפג.

1. ייצור מכשיר Microfluidic ( איור 1 א )

  1. מסכת עיצוב ושקיפות הדפסה.
    1. עיצבו את המכשיר כמפורט לעיל. ראה איור 1 א .
      הערה: ההתקן כולל שתי שכבות. השכבה הראשונה (4 מיקרומטר גבוה) מגדיר את הערוץ תא תעלה מחסום ללכוד את התאים ליד ערוץ הדרגתי. השכבה השנייה (60 מיקרומטר גבוה) מגדיר את ערוץ ייצור הדרגתי, הנמל והערוץ עבור טעינת תאים, המאגרים כימי הכניסה לשקע פסולת. סימני היישור מיועדים לשתי השכבות. עבור השכבה השנייה, אורך ורוחב של ערוץ הזרם במעלה הזרם הוא 60 מ"מ ו 200 מיקרומטר, בהתאמה; אורכו ורוחבו של הזרםערוץ קלט מתפתל הוא 6 מ"מ ו 280 מיקרומטר, בהתאמה.
    2. הדפס את תכונות השכבה הראשונה והשנייה למסיכת שקיפות באמצעות מדפסת ברזולוציה גבוהה.
      הערה: רזולוציית ההדפסה תלויה בתכונות המינימום בתכנון. בעיצוב הנוכחי, 32,000 dpi נבחר עבור 10 מיקרומטר תכונה מינימלית.
  2. נקו את פרוסות הסיליקון.
    1. מניחים 3 פרוסות סיליקון לתוך פלזמה מנקה. החל ואקום במשך 3 דקות.
    2. הפעל את כוח הפלזמה ולהגדיר את רמת גבוהה. השתמש פלזמה חמצן לטפל פרוסות הסיליקון למשך 30 דקות.
    3. כבה את שואב הפלזמה והוציא את פרוסות הסיליקון. פרוסות סיליקון מוכן בודה עובש המכשיר.
  3. לפברק את השכבה הראשונה על ידי photolithography במתקן cleanroom.
    הערה: הפרמטרים המדויקים של ייצור עשויים להשתנות בהתאם למתקן הייצור.
    1. לדלל 10 מ"ל SU-8 2025 עם 10 מ"ל SU-8 2000 ב מפסק זכוכית כדי להכין את photoresist מעוצב. השאירו את התערובת ברדס קטר במשך 10 דקות עד בועות להיעלם.
    2. בזהירות במקום את פרוסות סיליקון ניקה על הטווה עם צ 'אק מתאים וליישם את ואקום לשתק את פרוסות הסיליקון.
    3. בזהירות לשפוך 3 מ"ל של תערובת photoresist אל מרכז פרוסות סיליקון. ספין בסל"ד 500 במשך 5 שניות. לאחר מכן ספין בסל"ד 3,000 במשך 30 s כדי לקבל ציפוי הסופי 4 מיקרומטר עובי photoresist על פרוסות סיליקון.
    4. בזהירות להסיר את פרוסות הסיליקון מן הטווה ואופים את פרוסות הסיליקון על hotplate עבור 4 דקות ב 95 ° C.
    5. בזהירות במקום פרוסות סיליקון על aligner מסכה ולהגדיר את החשיפה זמן UV ל 6 s. בזהירות לצרף את מסכת השקיפות של השכבה הראשונה על צלחת זכוכית שקופה באמצעות דבק.
    6. בעדינות במקום את צלחת זכוכית שקופה עם המסכה המצורפת אל היישור וליישר את המסכה עם פרוסות סיליקון. לחשוף את siפרוסות ליקון UV כדי דפוס מבנה התא עגינה.
    7. מוציאים בזהירות את צלחת הזכוכית ומוציאים את פרוסות הסיליקון החשופות. אופים את פרוסות הסיליקון על hotplate עבור 4 דקות ב 95 ° C.
    8. מעבירים את פרוסות סיליקון למכסה קטר ומניחים אותו במחבת זכוכית המכיל את מפתח SU-8. בעדינות לנער את זה במשך 30 s.
    9. לנקות את פרוסות סיליקון באמצעות מפתח SU-8 טריים ואחריו אלכוהול איזופרופיל (IPA) בתוך מכסה המנוע קטר. יבש את פרוסות הסיליקון על ידי גז חנקן בתוך מכסה המנוע; השכבה הראשונה מוכנה.
  4. לפברק את השכבה השנייה על השכבה הראשונה.
    1. השתמש בקלטת דבק כדי לכסות את סימני היישור בשכבה הראשונה. בזהירות במקום פרוסות סיליקון עם השכבה הראשונה על צ 'אק ואקום של טווה ולהחיל ואקום כדי לשתק את פרוסות הסיליקון.
    2. יוצקים 3 מ"ל של SU-8 2025 photoresist על פרוסות סיליקון. ספין את פרוסות הסיליקון בסל"ד 500 במשך 5 שניות. ואז ספין בסל"ד 2000 במשך 30S כדי לקבל הסופי 60 מיקרומטר עובי ציפוי photoresist על פרוסות סיליקון.
    3. בזהירות להסיר את פרוסות הסיליקון מן הטווה ולהעביר אותו hotplate; אופים ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    4. הסר בעדינות את סרט ההדבקה כדי לחשוף את סימני היישור בשכבה הראשונה. מניחים את פרוסות הסיליקון על hotplate ואופים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות.
    5. בזהירות במקום פרוסות סיליקון על aligner מסכה ולהגדיר את החשיפה זמן UV להיות 18 s.
    6. בזהירות לצרף את מסכת השקיפות של השכבה השנייה על צלחת זכוכית שקופה באמצעות דבק.
    7. בזהירות במקום את צלחת זכוכית עם המסכה המצורפת ליישור, וליישר את המסכה ואת השכבה הראשונה על פרוסות הסיליקון על ידי סימני יישור המעבר באמצעות מיקרוסקופ בדיקה של aligner.
    8. לחשוף את photorsist מצופה פרוסות סיליקון UV כדי דפוס את טעינת תאים וערוצי הדרגתי.
    9. בזהירות להסיר את צלחת זכוכית להוציא את הסיליקון Wעפר. אופים את פרוסות הסיליקון על hotplate ב 65 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ולאחר מכן להעביר את פרוסות הסיליקון עוד 95 מעלות צלזיוס צלחת חמה ואופים במשך 6 דקות.
    10. מעבירים את פרוסות הסיליקון אל מכסה המנוע קטר ומניחים אותו במחבת זכוכית המכיל את מפתח SU-8. בעדינות לנער את זה במשך 6 דקות.
    11. לנקות את פרוסות סיליקון באמצעות מפתח SU-8 טרי ואחריו IPA בתוך מכסה המנוע קטר.
    12. יבש את פרוסות סיליקון באמצעות גז חנקן בתוך מכסה המנוע קטר. מניחים את פרוסות הסיליקון על hotplate וקשה לאפות את התבנית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות; השכבה השנייה מוכנה.
  5. מאסטר עובש שינוי פני השטח.
    הערה: שלב שינוי פני השטח silanization מוחל על עובש SU-8 כדי להקל על שחרור polydimethylsiloxane (PDMS) מן התבנית רך ליתוגרפיה.
    1. קח 10 μL של tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl (trichlorosilane) פתרון טיפ micropipette. שים את קצה micropipette לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל אNd לשחרר את מכסה הצינור.
    2. מניחים את הצינור ואת פרוסות סיליקון SU-8 בדוגמת בתוך desiccator וליישם את ואקום עבור 1 שעות; את המסכה עובש מוכן בובר את המכשיר PDMS.
  6. לפברק את מכשיר PDMS.
    1. הכן את הפתרון PDMS על ידי ערבוב 40 גרם PDMS הבסיס ו 4 גרם ריפוי סוכן כוס פלסטיק. מניחים את תבנית SU-8 מוכן מוכן בצלחת פטרי בזהירות לשפוך 44 גרם PDMS פתרון על התבנית.
    2. מניחים את צלחת פטרי ב desiccator וליישם ואקום degas הפתרון PDMS במשך 20 דקות. ואז במקום צלחת פטרי בתנור לרפא PDMS ב 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. לאחר אפייה, להוציא את צלחת פטרי ומניחים אותו על ספסל נקי. בזהירות לחתוך לקלף את לוח PDMS מן עובש SU-8.
    4. פונץ את יציאת טעינת התא באמצעות פונצ'ר בקוטר 3 מ"מ. פונץ את המאגרים מפרצון כימי ואת שקע פסולת באמצעות פונצ'ר בקוטר 6 מ"מ.
    5. הסר את האבק עלמשטח של לוח PDMS באמצעות סרט דבק. מניחים את לוח PDMS שקופית זכוכית נקייה לתוך מכונת פלזמה. החל את הוואקום במשך 3 דקות.
    6. הפעל את כוח הפלזמה ולהגדיר את רמת גבוהה. בעדינות להתאים את שסתום האוויר plasmatreat לוח PDMS ואת שקופיות הזכוכית במשך 3 דקות.
    7. כבה את כוח הפלזמה ושחרר את הוואקום. בזהירות להוציא את לוח PDMS ואת שקופית זכוכית באמצעות פינצטה.
    8. מיד במקום את לוח PDMS (עם מבנים ערוץ פנים אל פנים) על גבי שקופית זכוכית; בעדינות הקש על לוח PDMS כדי לקשר אותו לכוס. ממלאים את הערוץ microfluidic עם מים deionized מיד; את ייצור המכשיר microfluidic והרכבה הושלמו.

2. הגירה Cell Microfluidic הגירה הכנה

  1. הכנת המכשיר Microfluidic.
    1. הכן 50 מיקרוגרם / פתרון פיברונקטין מ"ל על ידי דילול 50 μL של פתרון fibronectin המניות (1 מ"ג / מ"ל) ל 95081; L מלוחים Dulbecco של פוספט מלוחים (DPBS) בתוך ארון biosafety.
    2. הכן את המדיום ההגירה על ידי ערבוב 9 מ"ל Roswell Park Memorial Institute בינוני (RPMI-1640) ו 1 מ"ל של RPMI-1640 עם אלבומין בסרום של 4% בסרום (BSA).
    3. הסר את המים deionized מהמכשיר.
    4. הוסף 100 פתרון fibronectin μL למכשיר מן השקע. המתן 3 דקות על מנת להבטיח כי כל הערוצים מלאים פתרון fibronectin. מניחים את המכשיר microfluidic בצלחת פטרי מכוסה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
    5. הסר את הפתרון fibronectin מהמכשיר. הוסף בינוני 100 הגירה μL מן השקע. המתן 3 דקות כדי להבטיח שכל הערוצים מלאים במדיום ההגירה.
    6. דגירה המכשיר עוד 1 שעות בטמפרטורת החדר; לאחר מכן המכשיר מוכן לניסוי chemotaxis.
  2. Chemoattractant פתרון הכנה לניסוי chemotaxis.
    1. הכן 100 nM פתרון fMLP ב tOtal 1 בינוני הגירה מ"ל. מערבבים 5 μL של מלאי FITC-Dextran (10 kDa, 1 מ"מ) עם פתרון fMLP בצינור 1.5 מ"ל.
      הערה: FITC-Dextran משמש למדידת צבע. לחלופין, השתמש Rhodamine כמחוון מעבר צבע. הפתרון chemoattractant fMLP מוכן אז ניסוי chemotaxis.
  3. הכנה מדגם הכנה.
    הערה: נויטרופילים chemotaxis המושרה על ידי מדגם של מדגם כיח מהמטופלים ב- COPD נבדק כמו יישום דיאגנוסטי קליני של שיטה זו על כל שבב.
    1. השגת פרוטוקול אתיקה אנושית כדי לאסוף דגימות כיח מחולי COPD.
      הערה: קיבלנו אישורים כדי לאסוף דגימות בבית החולים שבע אוקס כללי בוויניפג (אושרה על ידי אוניברסיטת מניטובה).
    2. השג את הסכמת הסכמה בכתב מכל הנושאים.
    3. איסוף דגימות כיח ספונטניות של חולי COPD. מקום 500 מדגם כיול μL בצינור 1.5 מ"ל.
    4. הוסף 500 μL 0.1% diThiothreitol בצינור 1.5 מ"ל ו לערבב בעדינות. מניחים את הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
    5. צנטריפוגה המדגם ב XG 753 למשך 10 דקות ולאחר מכן לאסוף את supernatant. צנטריפוגה supernatant ב XG 865 במשך 5 דקות ולאחר מכן לאסוף את supernatant הסופי. חנות supernatant שנאספו בתוך מקפיא -80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    6. כאשר מוכן לניסוי chemotaxis, להפשיר את הפתרון כיח; העברת 900 בינוני הגירת μL לצינור 1.5 מ"ל ומערבבים עם פתרון 100 כיול μL בתוך ארון biosafety; את הפתרון כיח הוא מוכן לניסוי chemotaxis.
  4. איסוף דגימות דם.
    1. השגת פרוטוקול אתיקה אנושית לאסוף דגימות דם מתורמים בריאים. השג את הסכמת הסכמה בכתב מכל תורמי הדם.
      הערה: כאן התקבלו הדגימות בבית החולים הכללי "ויקטוריה" בוויניפג (שאושרה על ידי המועצה לאתיקה משותפת של הפקולטה למחקר באוניברסיטת מאניתOba).
    2. אסוף את דגימת הדם על ידי וניפנקציה והכניס את המדגם לתוך צינור מצופה EDTA. שמור את הצינור בתוך ארון biosafety לפני הניסוי.

3. הכל על שבב Chemotaxis Assay מבצע

  1. על שבב תא בידוד ( איור 1 ב ).
    1. מקום 10 דם שלם μL בצינור 1.5 מ"ל בתוך ארון biosafety.
      הערה: פרטים על איסוף דגימות דם מפורטים בסעיף 2.4.
    2. הוסף 2 קוקטייל נוגדן μL (אב) ו 2 חלקיקים מגנטיים μL (MP) מן ערכת בידוד נויטרופילי (לראות את הטבלה של חומרים) לתוך צינור 1.5 מ"ל בעדינות לערבב; זה יהיה תווית תאים בדם למעט נויטרופילים.
    3. דגירה את הדם AB-MP תערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: זה יהיה מגנטית תג התאים נוגדן שכותרתו בדם.
    4. צרף שני דיסקים מגנטיים קטנים לשני הצדדים של הטעינה התא pOf של המכשיר. לשאוב את המדיום מכל יציאות של המכשיר.
    5. לאט לאט פיפטה 2 μL דם AB-MP תערובת לתוך המכשיר microfluidic מהנמל טעינה תא.
      הערה: תאים שכותרתו מגנטית לכודים על הקירות הצדדיים של יציאת טעינה תא תוך נויטרופילים יזרום לתוך המכשיר ולהיות לכודים במבנה עגינה התא.
    6. המתן כמה דקות עד נויטרופילים מספיק לכודים באזור עגינה התא.
  2. Assay Chemotaxis ( איור 1 ג ).
    1. מניחים את המכשיר microfluidic על הבמה טמפרטורה מבוקרת מיקרוסקופ ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. הוסף 100 פתרון chemoattractant μL (פתרון fMLP או כיח) ו 100 בינוני הגירה μL למאגרים שלהם מיועד inlet באמצעות שני pipettors; זה יפיק שיפוע chemoattractant בערוץ הדרגתי על ידי זרימה רציפה זרימה למינרית מבוסס כימי בסיוע pressurמבנה איזון.
      הערה: פרטים על איסוף הבדיקות מחולי COPD נמצאים בסעיף 2.3.
      1. עבור ניסוי שליטה בינוני, רק להוסיף בינוני ההגירה לשני המאגרים מפרצון.
    3. לרכוש את התמונה פלואורסצנטי של FITC-Dextran בערוץ הדרגתי.
    4. ייבוא ​​התמונה לתמונה ImageJ באמצעות הפקודה "קובץ | פתח".
    5. למדוד את עוצמת הקרינה פרופיל על פני ערוץ הדרגתי באמצעות הפקודה "ניתוח פרופיל מגרש".
    6. לייצא את נתוני המדידה לגיליון אלקטרוני עבור מתווה נוסף.
    7. לדגור את המכשיר על הבמה טמפרטורה מבוקרת מיקרוסקופ או בתרבות המסורתית חממה תא במשך 15 דקות.
    8. תמונה את ערוץ הדרגתי באמצעות המטרה 10X להקליט את התאים עמדות הסופי לניתוח נתונים.
    9. אם יש צורך, להקליט את ההעברה התא במכשיר על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות.

4. הגירה Cell DAta ניתוח ( איור 1 ג )

  1. לנתח את assay chemotaxis ידי חישוב מרחק הגירה תא מן מבנה עגינה כמתואר להלן. ראה איור 1 ג .
  2. ייבוא ​​התמונה לתוך NIH ImageJ תוכנה (גרסה 1.45).
  3. בחר את המרכז של כל תא שהגיע לערוץ הדרגתי.
  4. מדוד את הקואורדינטות של התאים שנבחרו עבור מיקומם הסופי. מדוד את קואורדינטת הנקודה בקצה קצה העגינה כמיקום הייחוס הראשוני.
  5. ייצא את נתוני הקואורדינציה הנמדדים לתוכנת גיליון אלקטרוני ( לדוגמה, Excel). חישוב מרחק ההגירה של התאים כהפרש בין המיקום הסופי של התא למצב ההתייחסות הראשונית לאורך כיוון ההדרגה.
  6. כייל את המרחק למיקרומטר. חישוב ממוצע וסטייה של המרחק הגירה של כל התאים כמדד של chemotaxis.
  7. השווה את ההעברההמרחק ration בנוכחות שיפוע chemoattractant לניסוי שליטה בינוני באמצעות הסטודנט של test.
  8. אם הזמן לשגות תמונות של הגירה תא נרשמות, הגירה תא chemotaxis ניתן לנתח עוד על ידי ניתוח מעקב התא 15 .
    הערה: החומרים הנדרשים כדי לבנות ולבצע את כל שבב assay chemotaxis מפורטים בטבלה של חומרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נויטרופילים נבחרים באופן שלילי מתוך ירידה של דם שלם ישירות במכשיר microfluidic. טוהר של נויטרופילים מבודדים אומת על ידי שבב Giemsa על השבב ואת התוצאות הראו את בצורת טבעת בצורת גרעין בצורת גרעין של נויטרופילים ( איור 2 א ) 25 . זה מצביע על בידוד יעיל על שבב נויטרופילי בטוהר גבוה מנפח קטן של דם שלם. יתר על כן, מבנה עגינה יכול ליישר ביעילות תאים ליד ערוץ הדרגתי לפני החלת שיפוע כימי (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לבודד ישירות נויטרופילים מן הדם כולו ואחריו הבדיקה chemotaxis, על כל שבב microfluidic, תוארה. שיטה זו מציעה תכונות שימושיות בתפעול קל שלה, בחירה שלילית של נויטרופילים טוהר גבוהה, מדגם מהיר ל-תוצאה הבדיקה chemotaxis, ריאגנטים מופחת וצריכה מדגם, מדויק ניתוח נתוני הגירה תא. כאומדן גס, לפחות 25% של נויטרופילים מן הדגימה כל הדם נכנס ביעילות את מבנה עגינה במכשיר מצאנו שטוהר נויטרופילי גבוה על ידי מכתים Giemsa על שבב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מענקים של מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) ואת המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR). אנו מודים למכון הקליני למחקר יישומי וחינוך בבית החולים הכללי "ויקטוריה" בוויניפג ובבית החולים הכללי "סבן אוקס" בוויניפג על ניהול דגימות קליניות של בני אדם. אנו מודים לד"ר חגית פרץ-סורוקה על דיון מועיל באסטרטגיות הפעולה של אסאי. אנו מודים לפרופסור קרולין רן וד"ר קסיאומינג (קודי) צ'ן מאוניברסיטת ווטרלו על תמיכתם הנדיבה בתהליך הצילומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ייצור מכשיר
יישור מסכהABMN/A
SpinnerSolitec5000
HotplateVWR11301-022
מנקה פלזמהHarrick PlasmaPDC-001
מייבש ואקוםפישר סיינטיפיק08-594-15A
משקל דיגיטליOhausCS200
SU-8 2000 דק יותרMicrochemSU-8 2000
SU-8 2025 PhotoresistMicrochemSU-8 2025
SU-8 מפתחMicrochemSU-8 מפתח
Si waferSilicon, IncLG2065
איזופרופיל אלכוהולפישר סיינטיפיקA416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilaneGelest78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)		Ellsworth Adhesives2065622
Petri DishFisher ScientificFB0875714
זכוכית שקופיות FisherScientific12-544-4
משטח חיתוךN/AN/Aבהתאמה אישית
פאנצ'ריםN/AN/A מותאם אישית
שםSourceCatalog NumberComments
>on-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640Fisher ScientificSH3025502
DPBSFisher ScientificSH3002802
בקר סרום אלבומין
(BSA)		סיגמא-אולדריץ'SH3057402
פיברונקטיןVWRCACB356008
fMLPSigma-AldrichF3506-10MG
דיסקים מגנטייםIndigo Instruments44202-1בקוטר 5 מ"מ, עובי

1 מ"מFITC-Dextran		Sigma-AldrichFD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich		R4127-5G
Giemsa תמיסת כתמיםRowley Biochemical Inc.G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
ערכת		STEMCELL
Technologies Inc		19666
DithiothreitolSigma-AldrichD0632
Nikon Ti-U מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוךתא סביבתי מיקרוסקופ NikonTi-U
.מצלמת InVivo ScientificN/A
CCDNikonDS-Fi1

מקורות

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509(2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921(2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523(2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PDMSfMLPCOPD
שיטה All-on- שבב עבור ניתוח נויטרופילי מהיר Chemotaxis ישירות מתוך ירידה של דם
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.