מאמר שיטה

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

11.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 באפריל 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את "אפקט השמיכה" של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.

תקציר

מחקרים על פיזיולוגית שרירי שלד להתמודד עם האתגר הטכני של עיבוד הדגימות כראוי להשיג חלקים עם תאי ציטופלסמית נראו בבירור. משוכה נוספת היא למגע ההדוק של myofibers אל הרקמות הסובבות. בגלל התהליך של קיבוע רקמה והטבעת פרפין מוביל ההצטמקות של סיבי שריר, הקפאה היא אמצעי אופטימלי של התקשות רקמת שריר עבור חתך. עם זאת, סוגיה בדרך נתקל, היווצרות של גבישי קרח, מתרחשת במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים בגלל תכולת מים גבוהה של השריר. הפרוטוקול המובא כאן לראשונה מתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור מקפיא כראוי ברקמות שרירות על ידי השיקוע שלהם חנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא שזה גורם להיווצרות מחסום גז חנקן ליד רקמות, אשר משמש כמבודד ומעכבת את הקירור של רקמות. כדי למנוע זאת השפעה "אדי שמיכה", התחלה חדשהcryovial w נועד להגדיל את מהירות זרימת הנוזל סביב משטח רקמה. זו הושגה על ידי ניקוב סך של 14 חורים מפרצון בקיר של הבקבוקון. על פי דינמיקת בועה, שיעור גבוה של תוצאות זרימת נוזל בבועות קטנות סיכויים פחות כדי ליצור מחסום גז. כאשר חנקן נוזלי זורם לתוך cryovial דרך חורי המפרצון, מהירות הזרימה סביב הרקמה היא מהירה מספיק כדי לבטל מחסומי גז. לעומת השיטה של ​​הקפאת רקמות שרירות באמצעות איזופנטאן טרום צונן, פרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל יותר וניתן להשתמש בו כדי להקפיא שריר באופן תפוקה. יתר על כן, שיטה זו היא אופטימלית עבור מוסדות שאין להם גישה איזופנטאן, המהווה דליק מאוד בטמפרטורת החדר.

מבוא

שריר שלד הוא המרכיב היקר ביותר של בעלי חיים לייצור בשר מהנקודה התזונתית ועיבוד של השקפה. בתעשיית הבשר, ישנם שני היבטים קריטיים במיוחד: את היעילות של צמיחת שרירים ואיכות הבשר והתוצאה. כרכיב עיקרי של השריר, סיבי שריר שקשורים באופן ישיר על ביצועי צמיחה ואיכות בשר טרי בחי 1. לדוגמא, המספר הכולל של סיבים (TNF) ואת שטח החתך של סיבים (CSAF) בעיקר לקביעת מסת שריר ואיכות בשר; גם, רכב סוג הסיבים (FTC) בחריפות משפיע איכות בשר טרי 2. לכן, המניפולציה של מאפייני סיב שריר בבעלי חיים היא שיטה יעילה מאוד כדי להגדיל את רווחיות ליבה ואת התחרותיות של משקי 1.

נכון להיום, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים זוהו לתמרן characterist סיב שרירICS 1. מניפולציה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הבחירה של חיות הממוקדות עם גנים ספציפיים, כגון גן מיוסטטין בבקר 3, גן Callipyge בכבשים 4, ואת RYR1 וגני IGF2 בחזירים 5. כמו כן, שליטת דיאטה וטיפולים עם הורמונים ספציפיים לשחק תפקיד חשוב מאפייני סיב שריר 6. לפיכך, גישה משלבת גורמים גנטיים ותזונתיים יוכל לשפר תוכן ואיכות בשר בשר רזה. עם זאת, מחקרים על סיבי שריר מוגבלים תעשיית הבשר משום ההבהרה של המבנה סיבי שריר עדיין מהווה אתגר.

תכונות סיב השריר מזוהים באמצעות שיטות histochemical, כגון triphosphatase אדנוזין שרירן (ATPase) assay. שיטה זו מסתמכת על העובדה כי אנזימים הממוקם דקים (6-8 מיקרומטר) קפוא קטעיםסיבי שריר ניתן הגיבו כימי עם מוצרים מסוימים. עם זאת, תכולת המים של שרירים עולה 75% בחזירים, ארנבים, עכברים, ובני אדם, ללא קשר לתפקיד (כלומר, גב, בטן, או hindlimb) 7. לעתים קרובות תוכן לחות גבוה בשרירים גורם לבעיה זו בדרך כלל - הקפאת חפצים - במהלך תקופת ההכנה של cryosections, כפי שתואר לעיל 8, 9. ברוב המקרים, זה כמעט בלתי אפשרי להקפיא כראוי ברקמות שרירות בקו ייצור מטבחיים, על פי הניסיון שלנו.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה ויעילה בשימוש במעבדה שלנו להקפיא רקמות שריר עבור Cryosectioning באופן תפוקה גבוהה. גולת הכותרת של שיטה זו היא cryovial חדש אשר נועד עבור רקמות פלאש-הקפאת שרירים בחנקן נוזלי. זרימת העבודה הנוכחית במקביל יכולה להקל רקמותהקפאה ועיבוד עבור cryosection שרירים מעולה, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של אפשרויות עבור בדיקת רקמות משום חנקן נוזלי אינו מתערבב עם רקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

השיטה הנוכחית כבר נקבעה ומאומתת לקצור ולאחסן יותר מ -1,000 דגימות שריר מכתים היסטולוגית במעבדה שלנו. כל הנהלים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ושימוש בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי משרד החקלאות של סין.

ציוד 1. עבור אוסף דוגמאות

  1. תווית הזהות מדגם על כל בקבוקון קריוגני.
    הערה: בקבוקון קריוגני תוכנן במיוחד כדי להקפיא דגימות רקמה טריות עבור הליך cryosection (איור 1A). צלוחיות עשויות פוליפרופילן במפעל עובש (איור 1C).
  2. השג את הציוד הבא: חנקן נוזלי במיכל חנקן נוזלי המתאים, משקפי בטיחות או מגן פנים, כפפות מקפיא, 10 מלקחיים ס"מ, 25 פינצטה ס"מ, צידנית קלקר (מידות פנימיות: 20 ס"מ x 12 ס"מ רוחב x 13.5 ס"מ ; הממדים החיצוניים: 24 ס"מ x 16 ס"מ רוחב x 15 ס"מ), סרט פלסטי (2.5 ס"מ x 0.8 ס"מ רוחב X 0.1 מ"מ עובי),אזמל, וכיסויים מחייב A4 PVC (21 ס"מ x 29.5 ס"מ) (איור 1B).

2. הכנת דוגמאות שרירים

  1. מלא את הקל-קר עם דק 5 חנקן נוזלי לפני איסוף דגימה.
    הערה: העמודה הגדולה של חנקן נוזלי היא חיונית כי חלק החנקן הנוזלי שחין משם והופך לגז כאשר דגימות טריות לגעת בו. על מנת להפחית את התדירות של העברת חנקן נוזלי כדי לחדש את ההפסד, מצנן קלקר בגודל מתאים חייב להיות רכשה מראש לפי מספר דגימות.
  2. לאחר טיפוס מתקבל, בעדינות ומניחים אותו על פיסת A4 PVC מחייב כיסוי ולבחון את הכיוון של סיבי שריר.
    הערה: הנה, השתמשנו החתך של שריר longissimus דוריס מן הראשונים החוליה המותני האחרונה בחזירים. דגימות עומדים ארוכה 12 ס"מ, 8 ס"מ רוחב, ו 5 ס"מ גבוה.
  3. השתמש אזמל לעשות שני חתכים מקבילים דרך i הדגימהn בכיוון של סיבי שריר, כ 3 ס"מ אורך ו 0.6 ס"מ זה מזה. חתוך את השריר חרות למלבן כ 0.6 ס"מ x 0.6 ס"מ x גבוה ארוך 1.5 ס"מ.
    הערה: האמינות של מדידת שטח החתך של סיבי השריר בעיקר תלוי כיוון הסיבים של השריר החרות.
  4. השתמשו 10 ס"מ מלקחיים לשים המדגם בעדינות על פיסת סרט פלסטי, עם ציר האורך של מקבילים שרירים חרוט אל הקצה הארוך של (איור 2 א) הסרט.
    הערה: סרט הפלסטיק יש שתי פונקציות: פונקציה חזקה המסייע בתיקון האורינטציה של סיבי שריר ואת תפקיד הדבקה שמונע סדקים במדגם בשל להקפאה מהירה.
  5. בעזרת מלקחיים, למקם את רקמת השריר לתוך באמצע התחתון של בקבוקון קריוגני שכותרתו, רק בין החורים מפרצון, ואז בחוזקה מכסה את בקבוקון (איור 2B).

מקפיא 3. ומדגם שרירי אחסוןהים

  1. באמצעות 25 פינצטה ס"מ, במהירות להטביע את הבקבוקון קריוגני כולו בחנקן נוזלי ב הקל-קר טרום מקורר, מחכה עד חנקן נוזלי לא להרתיח (כ 10-20 s).
    הערה: cryovial יצוף כאשר החנקן הנוזלי רותח, כך בזהירות לטבול את הבקבוקון של חנקן הנוזל רותח במשך 10-20 s.
  2. העברת דגימות שריר למיכל האחסון בחנקן נוזלי או במקפיא -80 ° C לאחסון ארוך טווח.

4. שקופיות כנות

  1. Precool cryostat ל בין C ° -20 ו -22 מעלות צלזיוס.
  2. הסר וזורקים את הלהב microtome הישן, לנגב בעל סכין צלחת אנטי רול ב cryostat, להתקין להב microtome חדש ב cryostat, ולהגדיר את עובי חיתוך כדי 8 מיקרומטר.
  3. העברת דגימת שריר בבקבוקון קריוגני מהמיכל אחסון חנקן נוזלי או -80 ° C במקפיא עד cryostat, והובלתו בחנקן נוזלי או על קרח יבש.
  4. חכה 30 דקות עבור הדגימה לאזן עם הטמפרטורה של cryostat.
    הערה: כל ציוד שעשויה לגעת הדגימה חייבת להיות טרום מקוררת, בגלל טמפרטורה גבוהה עלולה לגרום להיווצרות גבישי קרח הדגימה.
  5. הר המדגם בעל דגימה תחת ניסוח טמפרטורת חיתוך האופטימלי של glycols מסיס במים שרפים (אוקטובר). חותכים סעיפים 8-מיקרומטר.
    הערה: כוונן את זווית החיתוך בניצב לכיוון של סיבי השריר, משום CSAF הוא שטח החתך של סיבי שריר.
  6. הר בסעיפים לכיוון המרכז של microslide טמפרטורה בחדר. מיד במקום להחליק לתוך קופסת שקופיות במקפיא -80 מעלות צלזיוס. אל תאפשרו את השקופית לייבש ב RT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור cryovial וציוד המעבדה המשותף מקפיא שרירים במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים מוצגים באיור 1. Cryovials עשויים פוליפרופילן במפעל עובש. לכל בקבוקון סך של 14 חורי מפרצון: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל אחד עם ארבעה חורים ב 90 מעלות זה לזה. חורי מפרצון אלה יכולים להאיץ את מהירות הזרימה של חנקן נוזלי ליד הרקמות כדי למנוע את האפקט "שמיכת אדי" כאשר מגעי חנקן נוזלי הרקמה. כתוצא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, אנו מתארים cryovial החדש, רב-חור להקפאה ואחסון רקמות השריר לבצע הערכות היסטולוגית של תפקוד השרירים. הצעד שונה קריטי פרוטוקול זה הוא כי המדגם של cryovial רב-חור שקוע ישירות בחנקן נוזלי. למיטב ידיעתנו, זוהי הדרך הפשוטה rapidest להשיג דגימות קפואות מצוינות cryosectioning השריר בין שיטות הקפאה הקיימות (ראה את תוצאות הנציג).

האתגר הטכני בפני חוקרים שרירים הוא כי גבישי קרח הם סיכוי טובים ביותר להרכיב בעת השימוש מק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים, כספי או אחר, הם הכריזו על ידי המחברים.

תודות

פרויקט זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (NSFC): 31,301,950 ו 31,671,288.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוטום קריוסטט  מיקרוסקופ דיגיטלי LeicaLeica CM1950
 ניקוןניקון DS-U3
  בקבוקון קריוגני    סרטמעוצב על ידי עצמנו
חנקןבשימוש
קומומלי אזמלבשימוש קומומלי
10 ס"מ מלקחייםבשימוש קומומלי
פינצטהבשימוש
זכוכית
מקפיא בשימוש קומומליבשימוש משותף
פלסטיק נוזלי 25 ס"מ קומומלי בטיחות כפפות

מקורות

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ATPase

מאמרים קשורים