מאמר שיטה

בידוד של חלבונים ביניים חלבונים מ רקמות עכבר מרובות לחקר ההזדקנות הקשורים שינויים טרנסלוציוניים

DOI:

10.3791/55655

⸱

18 במאי 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשיטה זו, אנו מציגים תהליכים ביוכימיים לבידוד מהיר ויעיל של חלבונים בינוניים (IF) חלבונים מרקמות עכבר מרובות. IFs מבודד ניתן להשתמש כדי ללמוד שינויים שינויים שלאחר translational ידי ספקטרומטריית מסה בדיקות ביוכימיים אחרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סיבים בינוניים (IFs), יחד עם חוטים actin ו microtubules, טופס cytoskeleton - מרכיב מבניים קריטיים של כל תא. תפקוד תקין IFs מספקים תאים עם עמידות מכנית ומתח, בעוד cytoskeleton IF מתפקדת פשרות בריאות הסלולר כבר קשור עם מחלות אנושיות רבות. שינויים לאחר טרנספורמציה (PTM) מסדירים בצורה ביקורתית את הדינאמיקה של IF בתגובה לשינויים פיזיולוגיים ובתנאי לחץ. לכן, היכולת לפקח על השינויים בחתימת ה- PTM של IFs יכולה לתרום להבנה תפקודית טובה יותר, ובסופו של דבר מיזוג, של מערכת ה- IF כמגיב מתח במהלך פגיעה סלולרית. עם זאת, מספר גדול של חלבונים IF, אשר מקודדים על ידי יותר מ -70 גנים בודדים לידי ביטוי באופן תלוי רקמות, הוא אתגר גדול במיון את החשיבות היחסית של PTM שונים. לשם כך, שיטות המאפשרים ניטור של PTMs על חלבונים IFעל רמה אורגניזם רחב, ולא עבור בני משפחה מבודדים של המשפחה, יכול להאיץ את התקדמות המחקר בתחום זה. כאן, אנו מציגים שיטות ביוכימיות לבידוד של החלק הכולל, דטרגנט מסיסים, וחלק עמידים דטרגנט של חלבונים IF מ 9 רקמות עכבר שונות (המוח, הלב, הריאות, הכבד, המעי הדק, המעי הגס, הלבלב, הכליות, ו טְחוֹל). אנחנו עוד להדגים פרוטוקול אופטימיזציה לבידוד מהיר של חלבונים IF באמצעות מטריקס lysing ו homogenization אוטומטי של רקמות עכבר שונות. פרוטוקול אוטומטי שימושי עבור אפיון פרופילים IFS בניסויים עם נפח מדגם גבוה (כגון מודלים המחלה מעורבים בעלי חיים מרובים קבוצות ניסיוניות). הדגימות שנוצרו יכול להיות מנוצל עבור ניתוחים במורד שונים, כולל ספקטרומטריית מסה מבוססי ספקטרומטריית מסה. באמצעות שיטות אלה, אנו מספקים נתונים חדשים כדי להראות כי אם חלבונים ברקמות עכבר שונות (המוח והכבד) עוברים שינויים מקבילים לגבי expres שלהםSion רמות ו PTMs במהלך ההזדקנות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IFs הם משפחה של חלבונים שבני אדם מקודדים על ידי 73 גנים ומסווגים לשישה סוגים עיקריים: סוגים I-IV הם cytoplasmic ( כגון אפיתל וקראטינים של שיער (K), דגימת מיוציטים, נוירופילמנטים, חלבון חומצי פיבריללי גלילי (GFAP) ואחרים); סוג V הם lamins גרעיני; וסוג VI הם IFs בעדשת העין 1 . מבחינת האבולוציה המולקולרית שלהם, אם לחלבונים יש שלושה תחומים נפוצים: תחום משוכלל של מוט "סליל", ותחום "ראש" ו"זנב "גלובלי. אם tetramers חלבון להרכיב טופס מבשרי קצר, אשר משולבים בסופו של דבר לתוך חוטים בוגרים כי מבנה מבנים cytoskeletal דינמי מבנים נוקלאוסקלטליים המעורבים בהגנה מכנית 2 , מתח חישה 3 , 4 , תקנה של שעתוק 5 וצמיחה, פונקציות חיוניות אחרות קריטי"> 1 , 6 , 7 .

החשיבות הפונקציונלית של מערכת ה- IF מודגשת על ידי קיומו של מחלות אנושיות רבות הנגרמות על ידי מוטציות של גנים IF, כולל נוירופתיות, מיופתים, הפרעות בשבריריות העור, הפרעות בתפקוד מטבולי ותסמונות מוקדמות של הזדקנות מוקדמת. כמה מוטציות גן IF לא לגרום, אבל predispose נשאים שלהם התקדמות המחלה, כגון קרטין אפיתל פשוט מחלת כבד 9 . זה האחרון בשל הפונקציות הקריטיות להגנה על הלחץ של IFs באפיתליה. IFs באופן כללי הם בין חלבונים הסלולר שופע ביותר בתנאים הבסיסיים, אבל הם עוד יותר המושרה חזק במהלך סוגים שונים של מתח 10 . לדוגמה, מחקרים שנערכו לאחרונה מעריכים את השינויים ב- protea-wide ב- nematode C. elegans שהראו כי מספר רב של IFS הם בעלי רמה גבוהה ונוטים לצבורOn במהלך ההזדקנות האורגניזמים 11 , 12 . מאחר ותחזוקת מבנה IF תקין היא חיונית להתנגדות סלולרית לצורות שונות של לחץ 10 , אם הצבירה עשויה גם היא לתרום לירידה תפקודית במהלך ההזדקנות. עם זאת, מחקרים ברמת האורגניזמים בודקים מספר רב של יונקים חלבונים IF על פני רקמות שונות בלחץ הם חסרים.

IFs הם מבנים דינמיים מאוד להסתגל כדי לענות על דרישות הסלולר. Keratins, למשל, עוברים רכיבה עצמאית ביוסינתזה בין בריכת חלבון מסיס (לא פילמנטית) ו מסיס (נימי) חלבון 13 . בתנאים פיזיולוגיים רגילים כ -5% ניתן להפיק את מאגר K8 / K18 הכולל במאגר ללא חומרי ניקוי, בהשוואה לכ -20% שניתן להסיסם בחומר הניקוי הלא יוניד Nonidet P-40, אשר ניתן להשוותו ביוכימית ל- Triton- X100 14 , 15 . במהלך מיטוזה יש עלייה ניכרת את מסיסות של סוג פשוט אפיתל K8 ו K18 14 , אשר ניכרת פחות אפידרמיס keratins אבל נראה יותר ב vimentin ו III סוג אחר IF חלבונים 15 , 16 . תכונות מסיסות של חלבונים IF הם מוסדרים בחוזקה על ידי זרחון, שינוי שלאחר טרנסלוציאציה המפתח (PTM) עבור סידור נימה מסיסות 17 , 18 , 19 , 20 . רוב ה- IFs עוברים תקנה נרחבת על ידי מספר PTMs באתרים משומרים, וכתוצאה מכך שינויים פונקציונליים 17 .

מטרת שיטה זו היא להציג חוקרים חדשים בתחום IF למיצוי ביוכימי ושיטות אנליטיות לחקר חלבונים אם על פני רקמות עכבר מרובות. ספֵּצִיפִי, אנו מתמקדים בבידוד של חלבונים IF באמצעות שיטת מיצוי מלח גבוהה והערכת שינויים ב- PTM באמצעות ספקטרומטריית מסה ועל-ידי נוגדנים המכוונים ל- PTM. שיטות אלה מבוססות על הליכים שפורסמו בעבר, אך כוללים שינויים לחילוץ סוגים שונים של חלבונים IF כדי לחשוף מנגנון נפוץ לרגולציה בכל רחבי המשפחה. לדוגמה, acetylation K8 ב שאריות ליזין מסוים מסדיר ארגון נימה, בעוד hyperacetylation מקדם K8 מסיסות ויצירת המצרפי 22 . מחקרים גלובליים חדשים proteomic Profiledic יש גם גילה כי רוב הרקמה ספציפית IF חלבונים גם מטרות acetylation וכי רוב אתרי acetylation IF מוגבלים לתחום מוט משומר מאוד. זה מדגיש את הצורך בשיטות המתאימות פרופיל גלובלית של מערכת IF. כמו כן, אנו מציגים שיטה מהירה של בידוד חלבונים IF מ רקמות מרובות באמצעות homogenization אוטומטי Optiמטריצה ​​lysing. ההכנות כתוצאה מתאימים לניתוח PTM במורד הזרם באמצעות ספקטרומטריית מסה ושיטות אחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מאושר ומבוצע על פי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה.

1. הכנות

  1. הכן חיץ טריטון- X (1% Triton X-100, 5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), להעלות את נפח פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4). כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 5 מ"ל כל טריטון X-100 ו 500 מ"מ EDTA לתוך 490 מ"ל של PBS, pH 7.4. חנות Triton-X פתרון חיץ ב 4 ° C.
  2. הכן מאגר מלח גבוהה (10 מ"מ טריס HCl, pH 7.6, 140 מ"מ NaCl, 1.5 M KCl, 5 מ"מ EDTA, 0.5% Triton X-100, להעלות את נפח כפול מזוקקים (DD) H 2 O). כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 10 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6), 14 מ"ל של 5 M NaCl, 55.9 גרם KCl, 5 מ"ל של 0.5 M EDTA, ו 2.5 מ"ל של טריטון X-100, להתאים את עוצמת הקול ל 500 מ"ל באמצעות מים מזוקקים פעמיים). חנות מלח גבוהה פתרון הצפת ב 4 ° C.
  3. רק לפני השימוש, להשלים כמות נאותה של Triton-X ו- High Salt Buffer ( למשל 1 מ"ל עבור כל מדגם רקמות 25 מ"ג) עם קוקטייל פרוטאז או פרוטאז / phosphatase מעכב ולבטל כל חיץ לא בשימוש המכיל את המעכבים.
  4. הכן 5 מ"מ EDTA ב 1x PBS, pH 7.4. כדי להפוך 500 מ"ל: מערבבים 5 מ"ל של 0.5 M EDTA לתוך 495 מ"ל של 1x PBS, pH 7.4.
  5. לבודד את איברי העכבר השונים (מוח, לב, ריאה, כבד, לבלב, המעי הגס, המעי, הכליות, הטחול) באמצעות פרוטוקולים מאושרים אשר תואמים את ההנחיות הוטרינריות ואת הסטנדרטים המוסדיים 23 . הליך איסוף רקמות צריך לקחת לא יותר מ 5 דקות כדי לשמר את ה- RNA ואת שלמות החלבון של רקמות עשירות פרוטאז ( למשל הלבלב צריך להיות מעובד הראשון).
  6. גזור כמות קטנה של רקמות (~ 5-20 מ"ג) ומקום פתרון אחסון RNA, עבור מיצוי RNA הבאים, סינתזה cDNA, כמותי בזמן אמת PCR ניתוח לביטוי IF IF. מקום RNA פתרונות אחסון אחסון עם רקמות על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה וללכת פרוטוקול ליצרן נוסף sTorage ו בידוד צעדים.
  7. חותכים את שאר הרקמה לשברים קטנים יותר ( למשל 0.5 ס"מ) ומקום cryovial. הצמד להקפיא בקבוקונים החנות ב -80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

2. אם ביטוי גנים ניתוח

  1. חלץ RNA מ רקמות נשמר ב RNA פתרון מגיב אחסון. השתמש בכל שיטת מיצוי RNA מתאימה / מועדפת בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. לכמת ריכוז RNA ולהשתמש 2 מיקרוגרם של RNA לייצר cDNA באמצעות ערכת שעתוק מתאימה לאחור לפי פרוטוקול של היצרן.
  3. באמצעות cDNA שנוצר ועכבר אם הגן ספציפי primers להגדיר תגובות qPCR, כולל שלושה משכפל טכני של כל מדגם, כמו גם שליטה ריקה על פי פרוטוקול של היצרן.
  4. לכמת IF ביטוי גנים כמו שינוי לקפל השוואת תנאים שונים ( למשל, צעירים לעומת רקמות ישנות).

3. עמ 'פיצוי של סך lysates רקמות עבור Immunoblot

  1. Homogenize 25 מ"ג של רקמה 1 מ"ל של 2x לא צמצום חיץ מדגם SDS. להשמיט צבע bromophenol כחול מן המאגר המדגם אם assay חלבון colorimetric היא להתבצע כדי לכמת ריכוז חלבון.
  2. הוסף 5% (V / V) של 2-mercaptoethanol (2-ME) לעשות דגימות מופחת. ΜL 200 של דגימות לא הפחתת, להוסיף 10 μL של 2-ME.
  3. קביעת ריכוז החלבון באמצעות assergant- וצמצום assay חלבון תואם סוכן. אם צבע נכלל כבר במאגר המדגם, כמות החלבון ניתן להעריך לאחר ריצה ג'ל באמצעות מספר טכניקות, כולל קומסי מבוסס כתם 24 .
  4. וורטקס כל דגימות חום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. ביצוע סופג המערבי תחת שני צמצום ולא צמצום התנאים. חשיפה קרום בקצרה (<1 דקות) כדי לחשוף מינים מונומריים, ועוד (> 1 דקות) כדי לחשוף מתחמי המסה המולקולרי גבוה מכילNg אם חלבונים. אם צבירה ניטור, לבחון ג 'ל כולו / קרום (כולל תחתית של בארות ג' ל).
  6. הפעל ג'ל מקביל הכתם עם כתם חלבון כמו בקרת טעינה 24 . במודלי מחלה או ניסויים פציעה סך כתם חלבון יש להשתמש כביקורת העמסה, בניגוד immunoblots עבור "משק בית" חלבונים ( למשל אקטין, GAPDH) כי השינוי האחרון בתנאי לחץ שונים.

הכנת תמציות מסיסות דטרגנט ומלח גבוה של IFs ספציפי רקמות

  1. הוסף 1 מ"ל של קר טריטון X-100 חיץ לתוך homogenizer צינור זכוכית ומניחים אותו על הקרח.
  2. הסר פיסה קטנה של רקמות (~ 25 מ"ג) מן אחסון חנקן נוזלי מקום ישירות homogenizer זכוכית. השתמש העלי polytetrafluethethylene כדי homogenize (50 משיכות) ולהימנע ביצוע בועות. שמור על homogenizer ו lysate קר בכל עת.
  3. העברת lysate ל micr 1.5 מ"לצינור ocentrifuge על קרח צנטריפוגה ב XG 20,000 במשך 10 דקות בצנטריפוגה טרום צונן (4 מעלות צלזיוס).
  4. אסוף את החלק supernatant לתוך צינור נפרד. זהו החלק הטריטון מסיס X, אשר יכול לשמש immunoprecipitation (IP) וניתוח של הבריכה מסיס אבקת של חלבונים IF. שים לב כי צעדים 4.1-4.4 ניתן לחזור על מנת להשיג תמצית IF נקי מ רקמת המוח.
  5. הוסף 1 מ"ל של מאגר מלח גבוהה ל גלולה רקמות, להעביר homogenizer נקי dounce 100 משיכות. מעבירים את homogenate בחזרה לצינור microcentrifuge ומניחים את הצינור על שייקר מסתובב בחדר קר במשך 1 ח.
  6. צנטריפוגה homogenates ב 20,000 xg במשך 20 דקות ב 4 ° C. מחק את supernatant.
  7. הוסף 1 מ"ל של חיץ קר PBS / EDTA חיץ כדי גלולה homogenize גלולה (20 משיכות) ב homogenizer נקי כצעד ניקוי סופי *. העברה צינור חדש צנטריפוגה ב XG 20,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להשיג את החלבון IF-תמצית מלח גבוהה עשירה (HSE).
    * לחלופין, מערבולת במקום homogenization בשלב זה.
  8. מחק supernatant ו לפזר את כדורי μL 300 של חיץ מדגם SDS לא צמצום כי כבר מחומם מראש. לשבור את גלולה בתחילה על ידי pipetting ו vortexing, ולאחר מכן לחמם את דגימות 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס.
  9. וורטקס ו pipet לפי הצורך על מנת להבטיח את גלולה הוא מומס. זה עלול לקחת כמה דקות כדי לפזר את כדורי.
  10. חנות כל דגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

5. אוטומטי תמוגה רקמות עבור אם חלבונים לחלץ ב גבוהה נפח ניסויים

  1. עבור מיצוי רנ"א, חיץ מקום תמוגה (חיץ μL 600 לכל 25 מ"ג של רקמה) בצינור המכיל lysing מטריצה ​​D (משתמשת קרמיקה קטנים) ואת הדופק פעמיים במשך 25 של lyser רקמות. נפרד lysate מן המטריצה ​​על ידי צנטריפוגה ב XG 20,000 ו להמשיך לשלב הבא בבידוד.
  2. עבור מיצוי חלבונים, מקום Tritעל X-100 (או חיץ מדגם SDS אם הכנת lysate הכולל) בצינור lysing עם lysing מטריצה ​​SS (שימוש יחיד חרוז נירוסטה). לאחר בדיקת מטריצות מרובות, זה נבחר כי הוא מייצר אם תמציות חלבון כי הם באיכות דומה כמו השיטה douncing המסורתית. שים לב כי השיטה האוטומטית אינה אופטימלית ללבלב וטחול, ואת פרוטוקול homogenization סטנדרטי צריך לשמש רקמות אלה.
  3. כדי להמשיך בהכנה של מלח גבוהה לחלץ, להסיר את חרוז נירוסטה מן הצינור באמצעות מגנט, ו צנטריפוגה צינורות ב XG 20,000 דקות 10 ב 4 ° C.
  4. המשך עם שלב 4.4 (לעיל) של פרוטוקול ידני.
  5. חנות כל דגימות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

6. אימונו-העשרה של חלבונים IF לאחר טרנספורמציה השתנה

  1. הכן חיץ PBST (0.02% Tween-20 ב PBS). כדי להפוך 50 מ"ל, להוסיף 10 μL של Tween-20 ל 50 מ"ל של PBS, pH 7.4.
  2. הכן נוגדנים PTMפתרון (1-10 מיקרוגרם של נוגדן μL 200 של PBST). באופן כללי, 3 מיקרוגרם של נוגדנים / תגובה הוא מצב התחלה טובה שיכולה להיות אופטימיזציה נוספת אם יש צורך.
  3. עבור כל תגובה, aliquot 50 μL של חרוזים מגנטיים לתוך צינור microcentrifuge, במקום על מגנט לשאוב את פתרון אחסון חרוז.
  4. Conjugate החרוזים כדי הנוגדנים immunoprecipitation ידי השעיית מחדש בפתרון נוגדן ו דוגרים על rotator (סוף סוף, כדי להבטיח ערבוב של כרכים קטנים) בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  5. מניחים את הצינורות על מגנט לשאוב נוגדן פתרון.
  6. יש לשטוף את החרוזים נוגדנים מצומדות פעם 200 PBST μL ולהסיר חיץ לשטוף.
  7. הוסף 0.6-1 מ"ל של lysate רקמה החרוזים, לערבב על ידי pipetting עדין דגירה במשך 3 שעות על מסובבת בחדר קר.
  8. מניחים צינורות על מגנט, להסיר lysate, לשטוף את החרוזים חמש פעמים עם 200 μL של PBST. לאחר השלב האחרון כביסה, לאסוף את חרוזים ב 100 _6; L של PBS (לא Tween-20) ולהעביר צינור חדש נקי. מניחים את הצינור על המגנט.
  9. לשאוב את PBS ולהוסיף 100 μL של חיץ מדגם שאינו צמצום. הסר 50 μL ולהוסיף 2-ME (5%) לעשות דגימות הפחתת. מחממים את הדגימות ל 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  10. להפריד את שבב ה- IP מן חרוזים על המגנט ולאסוף אותו לתוך צינור חדש.
  11. חנות דוגמאות ב -20 מעלות צלזיוס עד הניתוח.

7. הכנה של דוגמאות חלבון IF עבור ניתוח ספקטרומטריית מסה

  1. תזמון התייעצות עם מומחה proteomics לפני תחילת המחקר שכן יש זמן משמעותי ועלות מעורב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה.
  2. קח אמצעי זהירות מיוחדים כדי למנוע זיהום. ידית את כל הג'לים עם כפפות נקי דגירה במיכלים נקיים, שטף רק באמצעות dDH 2 O (למנוע סבון).
  3. הפעל 20-50 μL של מדגם HSE (מסעיפים 4 ו -5) על ג'ל SDS-PAGE על פי התנאים הסטנדרטיים.
    4. כתם עם כתם חלבון עבור 1 שעות. יש לשטוף מספר פעמים ו de-stain ב DDH 2 O לילה. IF להקות חלבון צריך להיות גלוי בקלות לאחר דה מכתים.
  4. מניחים את הג'ל בין מגיני גיליון פלסטיק, לסרוק ולסמן את להקות כי יהיה נכרת ונשלח לניתוח.
  5. הבלו את להקות חלבון IF באמצעות תער נקי חדש.
  6. מניחים את להקות ג'ל צינורות microcentrifuge נקי להעביר למסוף ספקטרומטר מסה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה חדשה מהירה עבור מיצוי מבוסס מלח גבוהה של חלבונים IF מ רקמות העכבר מרובים באמצעות מטריקס lysing.

השיטה המסורתית 25 , 26 של בידוד חלק הארי של חלבון חלבונים ביניים חלק מרקמת אפיתל שונה כאן לכלול 9 איברים שונים הליך מהיר יותר עבור תמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות המאפשרות אפיון ביוכימי של חלבונים IF יכול להיות שימושי כדי להבין תופעות פתופיזיולוגיות רבות במערכות יונקים, שכן אם חלבונים הם גם סמנים מאפננים של מתח הסלולר והרקמה 29 . העיקרון שמאחורי השיטה הנוכחית מבוסס על ההליכים הראשונים שפותחו בשנות השבעים והשמונים על מנת לבודד, להפריד ולבנות מחדש חלבונים IF מתאים ורקמות, בדרך כלל באמצעות פתרונות מלח נמוכה וגבוהה וחומרי ניקוי Triton-X100 25 , 30 ,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי NIH מעניקה NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], ו P30 DK034987 [ל UNC- קפלה היל]. המחברים מודים Deekshita Ramanarayanan לעזרה עם qPCR וניסוי כתם המערבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Dynabeads חלבון GThermoFisher Scientific10009חרוזי משקעים חיסוניים
PBSThermoFisher Scientific10010049למאגרים
Purelink RNA מיני ערכתThermoFisher Scientific12183018מיצוי RNA מרקמה
Purelink DNA סט ThermoFisherScientific12185010Aעל עיכול
מגנט Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Dלשימוש עם dynabeads
GelCode מגיב כתם כחולThermoFisher Scientific24592כתם ג'ל תואם ספקטרומטריית מסה
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher Scientific32106לשימוש בכתם מערבי
ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוההThermoFisher Scientific4368813לשימוש בניתוח ביטוי גנים
מערכת PCR Proflex 3 x 32 בארותThermoFisher Scientific4484073מערכת PCR
ממברנת העברת PVDF ThermoFisher Scientific88520לכתם מערבי
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778לניתוח qPCR
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020לאחסון רקמות לפני בידוד RNA
Novex 4-20% Tris Glycine GelThermoFisher ScientificXP04205BOXג'ל חלבון טרומי
אנטי-קרטין 8 נוגדן (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428לזיהוי כתמים מערביים של K8
Anti-VimentinThermoFisher ScientificMA511883לזיהוי כתמים מערביים של וימנטין
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675להעברה רטובה של ג'ל חלבון
2x SDS Sample BufferThermoFisher ScientificLC2676להכנה דגימות ג'ל חלבון
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755להפעלת ג'ל חלבון
חרוזי ליזינג - Matrix DMP Biomedicals116913100חרוזי ליזה וצינורות מטריצה לשיבוש רקמות ומיצוי RNA
חרוזי ליסינג - Matrix SSMP Biomedicals116921100חרוזי ליזה וצינורות מטריצה לשיבוש רקמות ומיצוי חלבון
ספקטרופוטומטר NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEמדידה של חלבון וחומצות גרעין
Precellys 24 הומוגנייזרBertin InstrumentsEQ03119הומוגנייזר רקמות אוטומטי
DNA עמודהתמיסת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287(2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231(2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598(2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

מאמרים קשורים