הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה

11K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55658

⸱

10 ביולי 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Chemistry and Haematology, University Medical Center Utrecht, 2Department of Pharmaceutics, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מתארת ​​שיטה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטי לחקר הדבקה טסיות, התפשטות, והפרשה תחת זרימה. פלטפורמה רב-תכליתית זו מאפשרת חקירת תפקוד טסיות למחקר מכניסטי על פקקת והמוסטאזיס.

תקציר

טסיות דם הם שחקנים חיוניים בהמוסטזיס, היווצרות של טרומבי לחותם הפרעות בכלי הדם. הם מעורבים גם פקקת, היווצרות של תרומבי כי לכסות את כלי הדם ואת הפגיעה באיברים, עם תוצאות מסכנות חיים. זה מניע מחקר מדעי על תפקוד טסיות ופיתוח שיטות כדי לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים התא כפי שהם מתרחשים בתנאי זרימה.

מגוון של מודלים לזרימה זמינים לחקר הדבקה וטסיות טסיות, שתי תופעות מרכזיות בביולוגיה טסיות. עבודה זו מתארת ​​שיטה ללימוד degranulation טסיות בזמן אמת תחת זרימה במהלך ההפעלה. השיטה עושה שימוש בתא הזרימה מצמידים ההתקנה משאבה מזרק ממוקם תחת שדה רחב, הפוך, מבוסס מיקרוסקופ פלואורסצנטי LED. ההתקנה המתוארת כאן מאפשר גירוי סימולטני של fluorophores מרובים אשר מועברים על ידי נוגדנים שכותרתו fluorescently או fluorescצבעים. לאחר ניסויים הדמיה חיה תא, כוסות לכסות ניתן לעבד עוד יותר ונותחו באמצעות מיקרוסקופ סטטי ( כלומר מיקרוסקופיה confocal או מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה).

מבוא

טסיות הדם הן תאים אנוקליאטיות המסתובבות בזרם הדם. הפונקציה העיקרית שלהם היא לחתום הפרות כלי הדם באתרים של פגיעה כדי למנוע אובדן דם. באתרים אלה של פגיעה, סיבי קולגן subendothelial נחשפים והם מכוסים לאחר מכן על ידי חלבון multimeric, פון Willebrand גורם (VWF). VWF אינטראקציה עם טסיות במחזור במנגנון זה תלוי glycoprotein IBA-IX-V מורכבים על פני התא 1 , להאט את מהירות הטסיות. זה חשוב במיוחד בשיעורי גזירה גבוהה. טסיות לאחר מכן לעבור שינויים מורפולוגיים בעת קבלת הפעלת דחפים קולגן. זה מוביל להתפשטות בלתי הפיך ובסופו של דבר צבירה טסיות. שני התהליכים תלויים בהפרשת תכולת גרגירים כדי להקל על קרוסטלקט טסיות טסיות. בין היתר, טסיות α- גרגרים מכילים פיברינוגן ו VWF לסייע הידבקות טסיות לגשרטסיות יחד בצורה תלויי אינטגרין. גרגירי הצפיפות הטסיות מכילים תרכובות אנאורגניות 2 , כולל סידן ואדנוזין diphosphate (ADP), אשר מסייעות לחזק את פעולת הטסיות. יתר על כן, טסיות להכיל מתווכים של דלקת (אלרגית) 3 , משלימים שליטה חלבונים 4 , ו אנגיוגנזה גורמים 5 , 6 , מעלה את השאלה האם וכיצד תוכן אלה משתחררים באופן דיפרנציאלי בתנאים משתנים.

מאז 1980, המחקר של תפקוד טסיות במודלים הזרימה היה בעל ערך לחקירת מנגנוני טרומבוטיים. מאז, התקדמות טכנית רבה נעשתה, מודלים הזרימה הכוללים היווצרות fibrin מפותחים כיום כדי assay הפוטנציאל המוסטטי של ריכוז טסיות טיפולית לשעבר vivo 8 אולחקור את השפעת ההפרעות בשיעורי גזירה על מורפולוגיה 9 . ההבדלים במנגנונים המולקולריים והתאים הביולוגיים שמניעים הידבקות יציבה ויצירת פקקת פיזיולוגית (הימוסטאזיס) לעומת היווצרות פקק פתולוגי (פקקת) עשויים להיות מתוחכמים מאוד ומניעים את התפתחות מודלים הזרימה המאפשרים הדמיה בזמן אמת של תת-תאים אלה תהליכים.

דוגמה לתהליך שעבורו התקנה כזו תהיה בעלת ערך היא ההפצה (re) של polyphosphate תוך תאיים וגיוס גורמים קרישניים כדי לחשוף את ההשפעה תלוי הזמן על זה על תשתית פיברין 10 . מחקרים מוגבלים לעיתים קרובות לניתוח נקודות קצה. המטרה העיקרית של השיטה המתוארת היא לאפשר את החקירה החזותית בזמן אמת של תהליכים תת-דינמיים דינמיים המתרחשים במהלך הפעלת טסיות מתחת לזרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הוועדה הרפואית הרפואית המקומית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי אוטרכט אישרה את רישום הדם למטרות מחקר של vivo לשעבר , כולל אלו של מחקר זה.

1. הכנת פתרון

  1. הכנת חומצה 4 (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) של חיץ Tyrode על ידי המסת 10 מ"מ HEPES, 0.5 מ"מ Na 2 HPO 4 , 145 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 1 מ"מ MgSO 4 , ו 5.55 מ"מ D- גלוקוז במים מזוקקים.
    1. בצע שתי גרסאות של המאגר: להגדיר את רמות ה- pH ב 6.5 ו 7.4, בהתאמה. הפוך למאגר טרי עבור כל יום של ניסויים. להשלים עם 10 ng / mL prostacyclin שבו צוין.
  2. הכן טריס שנאגרו מלוחים (TBS) על ידי המסת 50 מ"מ טריס ו 150 מ"מ NaCl במים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 9.0.
  3. הכן חומצה ציטראט דקסטרוז (ACD) על ידי המסת 85 מ"מ טרי ציטראט ציטראט, 71 מ"מ חומצת לימון, 111 מ"מ גלוקוז D ב דיסמים טריים.
  4. הכן פתרון מקבע על ידי הוספת 2% (V / V) paraformaldehyde (PFA) למאגר HEPES Tyrode, pH 7.4. מחממים לפזר (50 - 70 מעלות צלזיוס) ולהגדיר את ה- pH 7.4. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. ההפשרה ב 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  5. הכן חיץ חסימת על ידי המסת 1% (מ / V) אלבומין בסרום האדם (HSA) במאגר HEPES Tyrode, pH 7.4
  6. הפוך פתרון polyvinyl אלכוהול על ידי הוספת 4.8 גרם של אלכוהול polyvinyl ל 12 גרם של גליצרול ומערבבים היטב. הוסף 12 מ"ל של מים מזוקקים ולהשאיר אותו על rotator בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    1. הוסף 24 מ"ל של 0.2 M Tris-HCL, pH 8.5. מחממים ל 50 מעלות צלזיוס תוך ערבוב במשך 30 דקות. הוסף 1.25 גרם של 1,4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן (DABCO) ומערבבים היטב. צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 5 דקות. Aliquot supernatant (1 מ"ל מספיק עבור שקופיות 15-20) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. השתמש aliquots פעם אחת.

2. הכנת הכנת זכוכית

  1. כיסוי degreaseמשקפיים (25 x 50 מ"מ 2 ) על ידי דוגרים בן לילה בחומצה chromosulfuric. שוטפים את הכוסות המכוסות במים מזוקקים ומייבשים אותן במשך הלילה ב 60 מעלות צלזיוס בתנור.
  2. דבק רצועה של סרט פרפין (10 x 15 ס"מ 2 ) על גבי ספסל מעבדה עם טיפה של מים ולהסיר את האוויר על ידי החלקה של הסרט פרפין. פיפטה 80 טיפות μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​VWF או פיברינוגן 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​על הסרט פרפין. מניחים את המשקפיים על הטיפות; הפתרון חלבון יתפשט בין שני משטחים כדי לכסות את הצד האחורי כולו של הזכוכית. לדגור על 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (RT).
  3. הסר את הסרט פרפין לחסום את הכוסות על ידי הצבת אותם, עם הצד המצופה למעלה בצלחת 4-היטב עם חיץ חסימה. לדגור על 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. כבקרה, לחסום כוס לכסות כי לא היה מצופה VWF או פיברינוגן.

3. הכנת פלזמה עשירה פלזמה (PRP)

  1. איסוף דם שלם citrated (ריכוז סופי: 0.32% נתרן ציטראט (M / V)) על ידי וניפנקציה.
  2. צנטריפוגה הדם במשך 15 דקות ב 160 xg ו RT בלי בלימה. איסוף supernatant ( כלומר, PRP) עם פיפטה פלסטיק פסטר.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, שלוש שכבות ניתן לראות (מלמעלה למטה): PRP, תאי דם לבנים, ותאי דם אדומים. הקפד לא לכלול את התאים הלבנים והאדומים. בדרך כלל, 3 מ"ל של PRP ניתן לאסוף לאחר צנטריפוגה של צינור דם 9 מ"ל.
  3. המשך לסעיף 4 אם הניסוי יבוצע עם טסיות שטופות. אם PRP הוא הרצוי, המשך לשלב הבא.
  4. לאחר איסוף PRP, צנטריפוגה את שארית הדם (המכיל את כדורית התא האדום) שוב במשך 10 דקות ב 2000 xg ללא בלימה. לאסוף את supernatant המכיל פלזמה עניים טסיות (PPP).
    הערה: בדרך כלל, 2 מ"ל ניתן לאסוף לאחר צעד צנטריפוגה השני.
  5. לספור את מספר pLatelets ב PRP על מנתח תאים לדלל אותו עם PPP (שלב 3.4) לריכוז של 150,000 טסיות / μL.
    הערה: הנפח הכולל של PRP המדולל תלוי בספירת הטסיות של התורם. ספירת הטסיות משתנה מאוד בין התורמים, ודילול PRP דורש הערכה על בסיס אישי. ספירת טסיות נחשבת נורמלית כאשר בתוך 150,000 ו 450,000 טסיות / μL.
  6. המשך לסעיף 5.

הכנת טסיות שטף

  1. קביעת נפח טסיות ממוצע (MPV) ב PRP באמצעות מנתח התא.
    הערה: זהו אינדיקטור לטרום הפעלה טסיות 11 . MPV רגיל עבור restlets טסיות הוא 7.5-11.5 fL 11 . MPV לא צריך להגדיל יותר מ 1.5 fL במהלך ההליך שטיפה טסיות.
  2. הוסף 1/10 נפח של ACD כדי PRP כדי למנוע טסיות מראש הפעלה צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלם. הסר את הסו Pernatant מחדש להשעות את גלולה בזהירות במאגר HEPES Tyrode, pH 6.5, לנפח המקורי של PRP.
  3. להפשיר aliquot של prostacyclin ידי הוספת TBS לריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל; לשמור על הקרח.
  4. כדי למנוע הפעלה טסיות, להוסיף prostacyclin בריכוז סופי של 10 ng / mL לטסיות מחדש מושעה צנטריפוגה מיד במשך 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלימה. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה בזהירות במאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4.
  5. ספירת מספר טסיות (שלב 3.5) ולקבוע את השינוי MPV (שלב 4.1) (MPV לא צריך לשנות יותר מ -1.5 fL).
  6. התאם את מספר הטסיות עם המאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, לריכוז של 150,000 טסיות / μL. השאירו את טסיות להתאושש במשך 30 דקות ב RT לפני הניסויים. השתמש טסיות שטף עבור ניסויים בתוך 4 שעות לאחר בידוד.

5. תזרים לשכת האסיפה

Ss = "jove_content"> הערה: ניסויים אלו עושים שימוש בתא הזרימה שפותח בתוך הבית. מגוון של תזרים המיוצר מסחרית ניתן להשתמש, כל עוד הם יכולים להחזיק זכוכית לכסות, אשר מועדף נשלף לניתוחים נוספים. תא הזרימה המשמש את הניסויים המתוארים עשוי פולי (methacrylate מתיל) כדי להתאים בדיוק לשלב להכניס מיקרוסקופ. הוא מכיל מפרצון מוצא ( איור 1A - C , 1, 2), כמו גם חיבור ואקום ( איור 1 א ו C ; 3). גיליון סיליקון מותאם אישית ( איור 1 א ו D , 4) ממוקם על גבי. שני לחתוך- outs טופס ואקום ערוצים ( איור 1 א ו D ; 5) כדי לצרף את כיסוי זכוכית ( איור 1 א ; 6) בחוזקה לחדר. חתך מרכזי יוצר את ערוץ הזרימה ( איור 1 א ו- D ; 7; 2.0 מ"מ רוחב 0.125 מ"מ גובה). השקע והשקע מחוברים לערוץ הזרימה, והוואקום מחובר לערוץ הוואקום.

  1. מכסים את החלק העליון של החדר לזרום עם מים מזוקקים במקום גיליון סיליקון אישית עם הצד החלק למטה על המים. הצף את הסדין למקומו על ידי הסרת מים עודפים, תוך שמירה על הסדין במקומו.
    הערה: גיליון זה סיליקון מחדש שמיש (סיליקון ידוע המאפיינים אינרטי שלה); בדרך כלל לא נצפו טסיות דם. ניתן לנקות את הסדינים באמצעות חומר ניקוי ולהשתמש בהם מחדש עד שייפגע החומר (קריעה, במיוחד באזור שבין הערוצים). בדרך כלל, גיליון יכול לשמש במשך 20 ימים עם ניסויים מרובים ליום.
  2. דגירה תא לזרום עבור 1 שעה ב 60 ° C להתאדות המים שיורית כדי לדבוק בחוזקה את הסיליקון גיליון לתא הזרימה.
  3. עם פיפטה פלסטיק פסטר, להוסיף טיפה שלהמאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, על ערוץ הזרימה. הניחו את מכסה הזכוכית (ראו סעיף) 2 עם הצד המצופה כלפי מטה, אל תעלת הזרימה. חבר את משאבת ואקום לחיבור ואקום ( תרשימים 1A ו- C 3). החל ~ 10 kPa הלחץ.

6. מכתים מראש של טסיות והכנת הנוגדנים

  1. כתמי טסיות
    1. דגירה טסיות שטף עם 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​DAPI במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס בחושך. כדי לשטוף DAPI מאוגד וכדי למנוע טסיות ההפעלה, להוסיף prostacyclin בריכוז סופי של 10 ng / מ"ל ​​ו צנטריפוגה מיד 15 דקות ב 400 xg ו RT ללא בלם.
    2. לשחזר את גלולה טסיות במאגר של HEPES Tyrode, pH 7.4, לריכוז טסיות של 150,000 טסיות / μL.
  2. הכנת נוגדנים
    1. מערבבים ביוטין נוגדן שכותרתו עם סטרקה שכותרתו AlexaTavidin על יחס טוחנת של 1: 1. דגירה במשך מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני השימוש (שלב 7.6).
      הערה: יעילות תיוג של ביוטין יכולה להשתנות בין קבוצות שונות. אם יש בעיות עם ויזואליזציה של מולקולות היעד, ניסויים בקרה צריכה להתבצע כדי לאשר biotinylation מוצלח, כמו גם את המאפיינים היעד מחייב של נוגדן biotinylated ספציפיים.

7. זלוף

  1. הפעל את מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם את התוכנה מיקרוסקופ. השתמש בהגדרות המיקרוסקופ המפורטות בטבלה 1 .
    הערה: ייזום המיקרוסקופ והגדרות ההקלטה עבור הדמיה תא חי הקלטה של ​​טסיות ואת הנוגדנים שכותרתו fluorescently שכותרתו ו / או צבעים על ידי טעינת הניסוי המתאים בתוכנת מיקרוסקופ. בצע ניסויים זרימה ב RT.
  2. חסום את צינורות כניסת על ידי חיבור מזרק 10 מ"ל לצינור ו aspirating 1% HSA bloחיץ cking לתוך צינורות כניסת. דגירה במשך 15 דקות ב RT. שוטפים את צינורות מפרצון על ידי aspirating HEPES Tyrode של חיץ, pH 7.4, לתוך צינורות מפרצון.
  3. חבר את צינורות הכניסה חסומות צינורות שפופרת לא מטופלים, הן עם קוטר של 1.02 מ"מ ו ~ ~ 20-30 ס"מ אורך לשקע ואת מוצא של החדר. חבר מזרק 10 מ"ל (או נפח נמוך יותר עבור דיוק) צינורות מוצא. הפעל את משאבת המזרק.
    הערה: הקוטר של המזרק, בשילוב עם קצב הזרימה שנקבע על המשאבה, לקבוע את קצב הזרימה volumetric. יחד עם פני השטח של ערוץ הזרימה, שיעור גזירה ניתן לחשב על פי הנוסחה 13 לְהַלָן. לפיכך, ניתן לתפעל את שיעור הגזירה על ידי שינוי קצב הזרימה של משאבת מזרק או לשנות את הממדים של ערוץ הזרימה. שיעור גזירה של 800-1,600 s -1 בדרך כלל מודלים של זרימת הדם העורקי, בעוד 25 - 100 מודלים 1 עבור דם ורידיזְרִימָה. עבור התקנה זו, קצב הזרימה של 7.5 μL / דקות תוצאות בשיעור גזירה של 25 s -1 .
    שיעור גזירה = 6Q / h 2 s ב -1 s
    כאשר: Q = קצב זרימה volumetric (mL / s), גובה = גובה ערוץ (ס"מ) (0.0125 ס"מ, זה עובי של הסיליקון גיליון), w = רוחב ערוץ (ס"מ) (0.2 ס"מ בחדר זה).
  4. מניחים טיפה של שמן טבילה על המטרה 100X (הגברה סך של 1000X) ואת הר החדר על המיקרוסקופ עם משטח הזכוכית למטה.
  5. מניחים את צינורות כניסת לתוך צינור המכיל HEPES Tyrode של חיץ, pH 7.4. באופן ידני למשוך את הבוכנה של המזרק מחובר צינורות מוצא ולמשוך את הפתרון דרך החדר כדי להסיר את האוויר מן המערכת. מניחים את המזרק לתוך משאבת מזרק ( איור 1 ב ו C ; 8) ולהפעיל את המשאבה לזמן קצר להדק את הבוכנה להבטיח זרימה יציבה.
  6. הוסף נוגדנים ו / או צבעים על ההשעיה טסיות או PRP, בזהירותלערבב עם פיפטה פלסטיק, ולהעביר את התערובת לצינור 1.5 מ"ל.
    הערה: עבור זלוף אופייני 30 דקות בקצב הגזירה 25 s-1 (7.5 μL / min), מינימום של 225 μL של ההשעיה טסיות יש צורך. הנוגדנים המשמשים את התוצאות המייצגות מוצגים בטבלה 2 .
  7. מעבירים את צינורות הכניסה, תוך לחיצה, מן המאגר HEPES Tyrode, pH 7.4, צינור 1.5 מ"ל המכיל או PRP או טסיות שטף את הנוגדנים ו / או צבעים ( איור 1 ב ו C ; 9).
    הערה: חשוב כי בעת העברת צינורות, צינורות הוא סחוט (לחיצה החוצה את האוויר) כדי למנוע את כניסת האוויר לצינור. ניתן לטפל טסיות חסיד עם מגוון של ריאגנטים בשלב הבא על ידי הזזת צינורות מפרצון צינור אחר בצורה דומה. בטבלה 3 ניתן למצוא רשימה של ריאגנטים מועילים.
  8. בחר את "Live visualizatioN "בתוכנה, למקד את המיקרוסקופ על משטח הזכוכית המכסה המצופה, ולהפעיל את המשאבה בקצב גזירה של 1,600 s-1 (484 μL / min) עד שהטסיות יגיעו לתא הזרימה, להקטין את שיעור הגזירה בחזרה 25 s-1 על ידי שינוי ההגדרות של משאבת מזרק בקצב זרימה של 7.5 μL / min.
  9. צג השטח של הצד המצופה של זכוכית לכסות, לחכות עד הטסיות הראשון מתחיל לדבוק, למקד את המיקרוסקופ על הטסיות האלה, ולהתחיל להקליט על ידי ייזום הניסוי בתוכנה. ראה טבלה 1 עבור הגדרות ההקלטה שבשימוש כאן.
  10. בצע את ההקלטה חיה חזותית. לאחר 30 דקות, לעצור את המשאבה מזרק.
    הערה: ודא כי טסיות להישאר להתמקד במהלך הניסוי. בדרך כלל, 20-30 טסיות לצרף בשדה הראייה בהגדלה של 1,000X; זה בערך 2,000-3,000 טסיות בכל ערוץ הזרימה.
  11. קיבעון באמצעותתא הזרימה (אופציונלי).
    1. כאשר הזרימה נעצרה לאחר משאבת מזרק הוא עצר, להעביר את צינורות כניסת (אוויר חינם) לפתרון מקבע. הפעל מחדש את המשאבה ואת זרימת חיץ קיבעון דרך הערוץ במשך מינימום של 10 דקות באותו קצב הזרימה כאמור בשלב 7.8.
  12. הסר את החדר מן המיקרוסקופ, לנקות את שמן טבילה מן הזכוכית, לנתק את ואקום, בזהירות להסיר את כיסוי זכוכית מן החדר עם מחט 18 G.
    הערה: מנע מכוס הכיסוי לשבור ולפגוע בסיליקון.
  13. מניחים את השקופית לכסות (עם התאים מופנים כלפי מעלה) בצלחת 4 באר על גבי רקמה, מראש הרטובות עם מים מזוקקים.
    הערה: פעולה זו מונעת את כיסוי הזכוכית מלדבוק במשטח הבאר ומונעת ייבוש.
  14. פיפטה 750 μL של פתרון מקבע על גבי זכוכית לכסות דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. במקרה דגימות לא ניתן לנתח ישירות,לאחסן אותם PFA 0.5% (מדולל על ידי חיץ HEPES Tyrode, pH 7.4) ב 4 ° C כדי להבטיח קיבעון יציב. המשך לסעיף 8 כדי לעבד את כיסוי הזכוכית לצורך הדמיה.
  15. לאחר השימוש, לשטוף את החדר, צינורות, גיליון עם מים מזוקקים דגירה לילה פתרון דטרגנט. לפני השימוש חוזר של החדר ומרכיבים אחרים, לשטוף עם מים מזוקקים.
  16. שמור את הנתונים מיקרוסקופ נתוני גלם המכילים את כל המטא נתונים. בעת הצורך, ייצא את הסרטים ל- .MOV, h.264 דחוס, או .AVI לא דחוס. שמור מסגרות נפרדות כמו קבצי JPEG או TIF.

8. הכנה לדוגמא עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטי confocal

  1. מעבירים את המשקפיים לכסות חדש 4 גם צלחות ולשטוף 5 פעמים עם 3 מ"ל של חיץ HEPES Tyrode, pH 7.4. הוסף 3 מ"ל / טוב של חסימת חיץ דגירה במשך שעה 1 ב RT.
  2. הסר את המאגר החוסם; מוסיפים 3 מ"ל / טוב של גליצין 0.15% (M / V) במאגר HEPES Tyrode, pH 7.4; ו דגירה במשך 15 דקות ב RT.
  3. הסר פתרון גליצין לשטוף 5 פעמים ב 3 מ"ל / טוב של חסימת חיץ. לחלופין, להוסיף נוגדנים fluorophore מצומדות בדילול חסימת חיץ עבור מכתים נוספים. דגירה במשך שעה 1 ב RT בחושך.
  4. לשטוף 5 פעמים עם חיץ חסימת ו 2 פעמים עם מים מזוקקים. יבש את הכוס על ידי הסרת נוזל עודף עם רקמה (מן הקצוות פנימה), מבלי לגעת בתאים.
  5. פיפטה 60 μL של פתרון אלכוהול פוליוויניל על שקופית מיקרוסקופ. מניחים את מכסה זכוכית, עם התאים למטה, על גבי ירידה ולתת אלכוהול polyvinyl להתפשט בין שני משטחים. דגירה לילה ב RT בחושך.
  6. לנתח את התאים על ידי מיקרוסקופיה confocal 14 .
  7. שמור את קובצי הנתונים הגולמיים של נתוני הערימה שנרשמו המכילים את כל המטא נתונים. בעת הצורך, לעבד את הנתונים הגולמיים קבצים לתוך MOV, H.264 דחוסים, או. קבצים לא דחוסים. שמור ערימות נפרדות כמו קבצי JPEG או TIF.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מציג תמונות של החדר לזרום ההתקנה ניסיוני; את המיקום ואת הממדים של הסיליקון גיליון; ואת חיבורי צינורות. איור 2 מספק פרטים על הממדים של החדר הזרימה. איור 3 ו סרט 1 להראות סדרה של זמן של תמונות של הידבקות טסיות והתפשטות על VWF משותק. CD63 הוא חלבון transmembrane כי הוא מוכנס לתוך קרום של גרגרי צפופה תאיים של טסיות מנוחה 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ברחבי העולם, פקקת היא גורם מוביל למוות ולתחלואה, וטסיות משחקות תפקיד מרכזי בהתפתחותה. עבודה זו מתארת ​​שיטה עבור הדמיה תא חי של degranulation טסיות מתחת לזרימה. בדרך כלל מניחים כי כאשר טסיות הדם הופעלות, כל התכנים הגרעיניים משוחררים ישירות לפתרון. התוצאות הנלוות מלמדות כי אין זה בהכרח כך. במהלך הדבקה ו degranulation, טסיות לשמור על כמות משמעותית של polyphosphate ( איור 4 ). בנוסף, VWF חלבון multimeric קשורה משטח טסיות לאחר degranulation ( איור 5 )...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לגלות.

תודות

CM מודה על תמיכה כספית של הארגון הבינלאומי לחולים לליקויים של C1-Inhibitor (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht וקרן לנדסטיינר לחקר עירוי דם (LSBR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתן-חומצה סולפונית (HEPES) VWR441476L
Na2HPO4SigmaS-0876
NaClSigma31434
KClSigma31248
MgSO4Merck KGaA1.05886
D-glucoseMerck KGaA1.04074
פרוסטציקלין קיימן כימיקל18220
טרי-סודיום ציטראטMerck KGaA1.06448
חומצת לימון Merck KGaA1.00244
משקפי כיסויMenzel-Glä סרBBAD02400500 # A24 x 50 מ"מ, מס '1 = 0.13 - 0.16 מ"מ עובי.
חומצה כרומוגופרתית (2% CrO3)Riedelde Haen07404CAS [65272-70-0].
Von Willebrand factor (VWF)מעבדות מחקר אנזימי פיברינוגן מטוהרות
FIB3L
4 צלחת באר, לא מטופלתThermo Scientific267061
סרום אנושי אלבומין Fraction VHaem Technologies Inc.
823022 צינורות איסוף דם, 9 מ"ל, 9NC קרישה נתרן ציטראט 3.2%גריינר ביו-וואן455322
מנתח תאים Abbott Diagnosticsהמטולוגיה CELL-DYN
ParaformaldehydeSigma30525-89-4 
משאבת מזרקמכשיר הרווארד, הוליסטון, MAמכשיר הרווארד 22
מזרק 10 מ"ל בקוטר 14.5 מ"מBD biosciences305959מזרק Luer-Lok
Anti-CD63-biotin אבקאם 
AB134331 אנטי-CD62P-ביוטין מו"פ D SystemsDy137
4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)Polysciences Inc. 9224
סטרפטווידין, Alexa Fluor 488 מצומדThermo ScientificS11223 
שמן טבילהZeiss444963-0000-000
תמיסת דטרגנטיוניליוור, ביוטקס
גליציןסיגמא56-40-6 
אלכוהול פוליווינילסיגמא9002-89-5Mowiol 40-88.
טריס הידרוכלורידסיגמא1185-53-1 
1,4-Diazabicyclo[2.2.2]אוקטן (DABCO)Sigma280-57-9
כבשים Anti-hVWF pAbAbcam AB9378
Alexa fluor 488-NHSThermo ScientificA20000
גליצרולסיגמא-אולדריץ'15523-1L-R
סרט ParafinnBemisPM-9964 אינץ' x 125 רגל גליל.
יריעת סיליקון לא מחוזקתNagorNA 500-1200 מ"מ x 150 מ"מ x 0.125 מ"מ.
יריעת סיליקון חתוכה בהתאמה אישית עם תעלות זלוף ואקוםתוצרתעשויה יריעת סיליקון לא מחוזקת (Nagor, NA 500-1)
צינורות 1.5 מ"לEppendorf AGT9661-1000AE
מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeiss Observer Z1 מצויד בנורות עירור LED.
תוכנת מיקרוסקופZeiss ZEN 2מהדורה
18 G מחט (18 G x 1 1/2 אינץ')BD biosciences305196
NaClRiedel de Haen31248375
TrisRoche10708976
פלסטיק פסטרפיפט VWR612-1681  7 מ"ל לא סטרילי, מדורג עד 3 מ"ל.
צינורות סיליקוןVWR228-0656קוטר פנימי. x קוטר חיצוני x עובי דופן = 1.02 x 2.16 x 0.57 מ"מ.
שקופיות מיקרוסקופThermo ScientificABAA000001##12E76 x 26 x 1 מ"מ, קצוות קרקע 45 & deg;, קצה חלבי.
בבית מנתח הבית כחולה

מקורות

  1. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  2. Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).
  3. May, B., Menkens, I., Westermann, E. Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines. Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).
  4. Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein. J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).
  5. Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis. Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).
  6. Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules. Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).
  7. Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components. J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).
  8. Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro. J Vis Exp. (109), (2016).
  9. Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).
  10. Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity. Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).
  11. Park, Y., Schoene, N., Harris, W. Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues. Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).
  12. Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood. Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).
  13. Slack, S. M., Turitto, V. T. Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH. Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).
  14. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).
  15. Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin. J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).
  16. Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes. J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).
  17. Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13. Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).
  18. Tersteeg, C., de Maat, S., et al. Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy. Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).
  19. Basir, A., de Groot, P., et al. In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact. Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

P selectinCD63
Live-cell הדמיה של degranulation טסיות והפרשה תחת זרימה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.