מאמר שיטה

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

DOI:

10.3791/55700

⸱

3 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Science and Technology, ShanghaiTech University, 2Institute of Biochemistry and Cell Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute for Advanced Immunochemical Studies, ShanghaiTech University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול המשלב בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק כדי למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל העיקרי ניתק מן epididymides cauda חולדה. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים ראשוניים אפידלימלי נוספת להבהיר את התפקיד הפיזיולוגי של האפידידימיס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האפידידימיס הוא איבר חיוני להבשלת הזרע ולבריאות הרבייה. אפיתל האפידידיום מורכב מסוגי תאים המחוברים בצורה מורכבת, אשר נבדלים לא רק בתכונות מולקולריות ומורפולוגיות אלא גם בתכונות פיזיולוגיות. הבדלים אלה משקפים את הפונקציות המגוונות שלהם, אשר יחד לבסס את microenvironment הצורך לפיתוח זרע שלאחר האשכים ב לומן האפידידימלי. ההבנה של המאפיינים הביופיזיים של תאי האפיתל האפידיאליים היא קריטית לחשיפת התפקודים שלהם בזרע ובבריאות, בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים. בעוד התכונות הפונקציונליות שלהם עדיין לא הובהר במלואו, תאים epithelial epididymal ניתן ללמוד באמצעות טכניקה טלאי תיקון, כלי למדידת האירועים הסלולר ואת המאפיינים קרום של תאים בודדים. כאן, אנו מתארים את שיטות בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק ל meaבטוח את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל ניתק העיקרי של עכברוש capid epididymides.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אברידימיס בדרכי הרבייה הגברי הוא איבר מרופד בשכבת תאים אפיתל פסיפס. כמו ברקמות אפיתל אחרות, סוגי התאים השונים של האפיתל האפידידימלי, כולל תאים ראשיים, תאים ברורים, תאים ותאי בזל מהמערכות החיסוניות והלימפאטיות, פועלים באופן מתואם כדי לתפקד כמחסום בחזית הצינורית וכמו תאים תומכים עבור התבגרות הזרע ופיזיולוגיה 1 , 2 , 3 . לפיכך, תאים אלה אפיתל לשחק תפקיד חיוני בבריאות הרבייה.

תאים אפיתל נחשבים בדרך כלל כמו תאים שאינם נרגשים שאינם מסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה כל או לא בתגובה בתגובה גירויים depolarizing, בשל היעדר מתח מגודרת Na + או Ca 2 + ערוצי 4 , 5 . עם זאת, תאים אפיתל להביע UniQue ערכות של תעלות יונים ו מובילים המסדירים תפקידים פיזיולוגיים מיוחדים שלהם, כגון הפרשת תחבורה המזינים 6 . תאים אפיתל שונים ולכן יש תכונות חשמליות אופייניות. לדוגמה, התאים העיקריים להביע את CFTR עבור התחבורה נוזלים כלור ולהביע את TRPV6 עבור סידן reabsorption, ואילו התאים ברורים להביע את המשאבה פרוטון V-ATPase לחומצה לומינלית 1 , 7 , 8 , 9 . כמה מובילים ערוצי יון המווסתים את התכונות הפיזיולוגיות של התאים אפיתל אפידלימלי דווחו, אבל המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים אפידרלי הם רובם לא הבנתי עדיין 10 , 11 , 12 , 13 .

מהOle-cell-clamp ההקלטה היא טכניקה מבוססת היטב לבחינת התכונות המהותיות של תאים נרגשים ולא נרגשים, והוא מועיל במיוחד עבור לימוד הפונקציות של תאים ניתק בעיקר דגימות הטרוגניות; מתח מהדק משמש למדידת המאפיינים קרום פסיבי וזרמים יוניים של תאים בודדים 14 , 15 . תכונות הממברנה הפסיבית כוללות התנגדות קלט וקיבולת. הפרמטר לשעבר מציין את מוליכות הממברנה המהותית, בעוד שהאחרון מרמז על פני השטח של קרום התא (bilayer phospholipid, שבו נמצאים תעלות יונים ומובילים, המשמש כמבודד דק המפריד בין תאי תאיים ותאיים תאיים). הקיבול של הממברנה הוא פרופורציונלי ישירות על פני השטח של קרום התא. יחד עם התנגדות הממברנה המשתקפת בהתנגדות הקלט, הזמן הקבוע של הממברנה, wHich מציין כמה מהר פוטנציאל קרום התא מגיב לזרימה של זרמי ערוץ יון, ניתן לקבוע. בהקשר זה, על ידי שילוב של מאפייני התגובה הנוכחית מסדרה של צעדים מתח החלים על התאים, הקינטיקה הביופיסיקלית המאפיינים של התאים נקבעים 15 , 16 , 17 , 18 .

במאמר הנוכחי, אנו מתארים את ההליכים לבידוד תאים אפיתל מ עכברוש cauda epididimis ואת הצעדים למדידת המאפיינים קרום של סוגי תאים שונים בתערובת התא ניתק באמצעות מהדק תיקון כל כולו. אנו מראים כי התאים העיקריים האפידידימלי התערוכה מאפיינים שונים electrophysiological קרום וכי מוליכות ניתן לזהות בקלות סוגי תאים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להנחיות של אוניברסיטת שנחאי TechTech טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, אשר למלא את הדרישות המקומיים והבינלאומיים.

1. בעלי חיים ניסיוניים

  1. השתמש הזכרים מבוגר עכברים Sprague-Dawley (~ 300-450 גרם) בין 8-12 שבועות. בעידן זה של חולדות, הזרע הגיעו eppididymides cauda.

2. בידוד של תאים אפיתל מ עכברוש Cauda Epididymides

הערה: השלבים הבאים מבוצעים בתנאים שאינם aseptic אלא אם צוין אחרת.

  1. הכנת מכשירים לנתיחה וריאגנטים
    1. לחטא את כלי לנתיחה על ידי טבילה באתנול 70% ולתת להם אוויר יבש.
    2. הפעל את אמבטיה ההתחממות (32 ° C); הכן מראש 500 מ"ל חם של 1x Roswell Park Memorial Institute 1640 בינוני (RPMI) בתוספת 1% (v / v) antibioטיקים (100 U / מ"ל ​​פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין הסופי), ו שכותרתו "RPMI (+ P / S 1: 100)". בצע את השלב הזה בתחנת עבודה נקייה של זרימת אוויר.
    3. הכן מראש 1x500 מ"ל של Iscove השתנה Dulbecco בינוני (IMDM) המכיל חומצות אמינו לא חיוניות (0.1 מ"מ) ו pyruvate נתרן (1 מ"מ), בתוספת 5-α-dihydrotestosterone (1 ננומטר), 10% שור עוברית סרום, 1% (v / v) אנטיביוטיקה (100 U / מ"ל ​​פניצילין ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין הסופי), ו שכותרתו "מלא IMDM". יצירת aliquots 50 מ"ל חותם עם parafilm; חנות ב 4 ° C. השתמש בתנאים aseptic.
    4. הכן פתרון קולגן enazyme עיכול על ידי המסת collagenase סוג אני ו collagenase סוג II ב RPMI (+ P / S 1: 100) וכתוצאה מכך 1 מ"ג / מ"ל ​​של כל collagenase בפתרון. סינון דרך קרום 0.22 מיקרומטר ולסמן כמו "פתרון collagenase". שמור על טמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש. התאם את עוצמת הקול של פתרון האנזים מבוססעל משקל האנזים; את הכמות המינימלית הנדרשת עבור שני epididymides cauda מ חולדה אחת היא 2 מ"ל.
    5. ממלאים צלחת 35 מ"מ עם RPMI (+ P / S 1: 100).
  2. ניתוחים של עכברים
    1. להקריב את החיה על ידי או באמצעות pentobarbital נתרן 85 מ"ג / ק"ג IP או באמצעות תא isoflurane עד החיה אינה מגיבה לגירוי זנב זנב; עקוב אחר צוואר הרחם.
    2. לחטא את הבטן התחתונה על ידי ניגוב עם אתנול 70%, בעדינות לדחוף את שני האשכים למטה הבטן התחתונה, ולאחר מכן לפתוח את הבטן התחתונה ליד שק האשכים.
    3. לאסוף את השומן האפידידימלי, לנתח את כל אברי הרבייה (אשכים, epididymides, ו deferens ואס) ו לטבול בצלחת עם RPMI (+ P / S 1: 100).
    4. העברת אברי הרבייה בצלחת עם RPMI (+ P / S 1: 100) לתחנת עבודה aseptic.
    5. לנתח את epididymides cauda מן רקמות החיבור ואת השומן ואת epiקפסולת דידימאל. מניחים אחד עם אפרדימיס ~ 0.2 מ"ל של פתרון Collagenase ב 1.5 מ"ל tube.Perform בשלב זה בתנועה נקייה זרימת אוויר עבודה מבוקרת.
  3. דיסוציאציה של תאים בודדים מאפודידימידי חולדה
    1. חותכים את epididymides ב Collagenase פתרון באמצעות מספריים בסדר עד הרקמה הופך נוזל הדבק. שוטפים את המספריים בעדינות עם שאר (0.8 מ"ל) פתרון האנזים בצינור 1.5 מ"ל.
    2. מניחים את הצינור על thermomixer מתכת במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס במהירות רועדת של 1000 סל"ד.
    3. צנטריפוגה תערובת רקמות האנזים ב 30 xg ב RT במשך 3 דקות ו decant supernatant דביק המכיל בעיקר את הזרע.
    4. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל מלא IMDM להרוות את כל הפעילות האנזימטית. מעבירים את ההשעיה התא לצינור 50 מ"ל המכיל 49 מ"ל RPMI (+ P / S 1: 100).
      הערה: לחלופין, לסנן את ההשעיה התא דרך קרום 100 מיקרומטר רשת עם triturat קבועיון להימנע גדולים, אגרגטים התא. עם זאת, אין להשתמש במסנן רשת אם ההשעיה התא נדרש לגידול monolayers התא.
    5. צנטריפוגה תערובת הסלולר ב 30 xg ב RT במשך 10 דקות; לסלק את supernatant.
    6. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל מלא IMDM עם טחינה דקה במשך 5 דקות לפחות לנתק תאים בודדים מן תערובות רקמות האנזימטית טיפול.
  4. הפרדת תאים אפיתל מתאי אחרים בתנאים aseptic
    1. תרבות ההשעיה התא על צלחת 10 פטרי ס"מ המכיל Full-IMDM לפחות 8 שעות או לילה, באינקובטור ב 32 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 .
    2. הכן coverslips סטרילית מראש על ידי טבילה אלכוהול 100%. אוויר יבש לטבול בנפח קטן של המדיום התרבות. מניחים את coverslips ב 6 מנות תרבות ס"מ או בארות בודדות של צלחת 24 גם.
    3. למחרת, לקצור את התאים אפיתל מנותקים על ידי איסוף בעדינות את התאים התאSion מ צלחת פטרי, אשר מורכב בעיקר של תאים אפיתל. צנטריפוגה ההשעיה תא ב 30 xg ב RT במשך 5 דקות, ולאחר מכן decant supernatant.
    4. Resuspend תא גלולה ב ~ 2 מ"ל מלא IMDM.
    5. זרעים 0.2 מ"ל של ההשעיה תא שנקטפו אל מרכז כל coverslip סטרילית.
    6. בואו ההשעיה התא להתיישב טיפות נוזלי לפחות 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדלג באופן רופף coverslips זכוכית. בזהירות להוסיף 1 מ"ל מלא IMDM בקצה של צלחת 10 ס"מ, או 0.3 מ"ל מלא IMDM היטב כל צלחת 24-היטב; לא להפריע לתאים.
    7. שמור על תאים בודדים בודדים על coverslips באינקובטור ב 32 מעלות צלזיוס 5% CO 2 עד ניסויים תיקון מהדק.

3. הקלטה פתרונות Micropipettes

הערה: עבור ניסויים קליק תיקון, להשתמש בכימיקלים באיכות הטובה ביותר ופתרונות.

  1. הכנת פתרונות מניות
    1. החיטוי כל הבקבוקים לאחסון מלאי לסנן את כל פתרונות המניה (למעט פתרונות קורוזיביים) ולסנן באמצעות 0.22 מיקרומטר קרום לפני השימוש.
    2. הכן את כל פתרונות המניות מראש ב RT, חנות ב 4 o C: 5 M NaCl; 1 M KCl; 100 מ"מ MgCl 2 ; 100 מ"מ CaCl 2 ; 200 מ"מ NaH 2 PO 4 ; 100 מ"מ EGTA (pH 7.0 עם KOH). ידית 5 M NaOH, 1 M HCl ו 1 M מניות KOH כמו פתרונות קורוזיביים.
  2. הכנת תקן חיצוני הקלטה פתרון מלח פיזיולוגי (PSS)
    1. חם את פתרונות המניה RT בבוקר של ההקלטה מהדק תיקון.
    2. פיפטה את החומרים מכל המניות על פי נפח הסופי הרצוי, למעט CaCl 2 , למשל להכנת 500 מ"ל של PSS: 140 מ"מ NaCl = 14 מ"ל של 5M; 5 מ"מ KCl = 2.5 מ"ל של 1M; 1.2 מ"מ MgCl 2 = 6 מ"ל של 100 מ"מ; 1.2 mM NaH 2 PO 4 = 3 מ"ל של 200 מ"מ.
    3. הוסף כפולמים מזוקקים (DDH 2 O) לנפח הסופי של 400 מ"ל ושיווי משקל.
    4. לשקול 0.9 גרם גלוקוז ו 1.19 גרם HEPES ו להמיס לחלוטין בתערובת הפתרון.
    5. הוסף את מלאי CaCl 2 (2.5 מ"מ = 12.5 מ"ל של 100 מ"מ) עם ערבוב.
    6. הוסף עד 99% מהנפח הסופי.
    7. התאם את pH 7.4 באמצעות NaOH או HCl.
    8. בדוק את osmolarity ולהתאים באמצעות 5 Na NaCl או גלוקוז, במידת הצורך.
    9. הוסף dDH 2 O לנפח הסופי של 500 מ"ל בצילינדר.
  3. הכנה של פתרונות פנימיים micropipette (נמוך EGTA K + מבוססי פתרונות)
    1. לשקול או פיפטה את הכמות הנכונה של ריאגנטים מכל המניות על פי נפח הסופי הרצוי וריכוז, למשל להכנת 50 מ"ל נמוך EGTA K + מבוסס פתרון תאיים בהיקף של ~ 30 מ"ל dDH 2 O: 100 מ"מ K-gluconate = 1.17 גרם; 35 מ"מ KCl = 1.75 מ"ל של 1 M; 2 מ"מ MgCl 2 = 1 מ"לשל 100 מ"מ; 0.1 מ"מ EGTA = 0.05 מ"ל של 100 מ"מ; 10 מ"מ HEPES = 0.072 גרם.
    2. הוסף מספיק מים עבור ~ 95% נפח סופי ולאפשר את הפתרון כדי לאזן ב RT. ודא שהפתרון ברור.
    3. בעוד כל הזמן ערבוב הפתרון, להתאים את ה- pH 7.2 באמצעות KOH.
    4. לשקול ולהוסיף 0.078 גרם MG-ATP לפתרון עד שהוא מומס לחלוטין.
    5. מניחים את הפתרון על הקרח ולהשתמש aliquot קטן למדידת osmolarity; בדרך כלל, הפתרונות אמצעים ~ 290 mOsmol ואינו צריך הסתגלות. אם osmolarity שונה באופן משמעותי 280-295 mOsmol, להכין פתרון חדש.
    6. הוסף dDH 2 O כדי נפח סופי.
    7. מחלקים את הפתרון לתוך 500 aliquots μL, מסנן עם מסנן 0.2 מיקרומטר מזרק, החותם בחוזקה מיד לאחסן ב ≤ -20 מעלות צלזיוס.
    8. ביום של ניסוי טלאי תיקון, להפשיר אחד aliquot של פתרון תאיים על הקרח ולשמור מקורר במהלך הניסוי תיקון מהדק ללמנוע השפלה.
  4. משוך את טפיחות תיקון מ נימי זכוכית (הוראות פיפטה המשתמש הבא של המדריך) כדי להשיג גדלים micropipette עם התנגדות של 5-10 M כאשר מלא פתרון תאיים.

4. הגדרת התיקון Clamp תיקון הקמת תא שלם תא עם תאים

  1. הגדרת הניסוי תיקון מהדק
    1. הפעל את ערכת מהדק התיקון (מחשב, מגבר הנשלט על ידי מחשב, Digitizer וכו ' )
    2. פתח את התוכנה תיקון מהדק ( למשל AXON pCLAMP10 או HEKA PatchMaster) ולהגדיר את הפרוטוקולים עבור הקלטות אלקטרו. הגדר את המסנן עבור האות כדי לעבור נמוך ב 1-3 קילוהרץ ו digitizer ב 10-20 קילוהרץ.
    3. הפעל את המצלמה, את המיקרו-מניפולטור ואת מקור האור.
    4. כאשר המגבר הנשלט על ידי המחשב מופעל, הניח את הגוף של הנסיין על ידי נגיעה בידיים של מתקן הידוק התיקון שנקבע,לפני נגיעה על הדוכן, כדי להגן עליו מפני זעזועים חשמליים.
    5. מעבירים את תאים אפיתל culturing על coverslip זכוכית לתא ההקלטה מלא ~ 1 מ"ל של תקן PSS ב RT. בזהירות לשנות את PSS רחצה לפחות פעמיים באמצעות פיפטה לפני כל תיקון קלימפ ניסויים.
      הערה: יש למלא את מערכת הזלוף ב - PSS סטנדרטי או בפתרון חיצוני אחר בהתאם לניסוי המתוכנן. Perfuse מיקרוסקופ רכוב הקלטת תא (RC-26G או RC-26GLP) עם PSS כמה פעמים במהירות של ~ 2 מ"ל / דקה לפני תחילת הניסויים תיקון מהדק. ודא כי אין בועות אוויר לכודים לאורך מערכת זלוף.
    6. הצג ובחר את התאים תחת מיקרוסקופ הפוך תוך שימוש ביעדים 10X ו 40X מצויד הפרעה הפרש בניגוד מערכת אופטית. חפש תאים בודדים בודדים גדולים להקלטת. זיהוי תאים אפיתלתיים מבודדים eppidhelial על ידי צורה כדורית שלהם עם מ 'גסIcrovilli בקצה אחד של הממברנות והפצה מקוטבת של תוכן תאיים ( איור 1 ).
    7. באמצעות מזרק 1 מ"ל (מחט מתוצרת עצמית microsyringe מתוצרת בית), למלא micropipette עם הפתרון הפנימי (נמוך EGTA K + בסיס הפתרון, ראה שלב 3.3). ודא כי אין בועות אוויר micropipette, אשר יכול להגדיל את ההתנגדות של micropipette. השתמש פתרון מספיק, כך את הפתרון הפנימי submersges מצופה כלוריד חוט כסף אלקטרודה בתוך בעל micropipette.
    8. הר micropipette את בעל האלקטרודה, וליישם לחץ חיובי נמוך (~ 0.2 מ"ל נפח מזרק). שמור על לחץ חיובי נמוך רציפה עד לגעת קרום התא בשלבים מאוחרים יותר.
  2. הקמת תצורה של תא שלם עם תאים להקלטות
    1. לטבול את פיפטה לתוך הפתרון אמבטיה במהירות הגבוהה ביותר של micromanipulator. מצא את פיפטהעצה במסך המחובר למצלמה הדיגיטלית; להאט את מהירות micromanipulator למצב בינוני גבוהה.
    2. בדוק במהירות את ההתנגדות micropipette (5-10 MΩ) באמצעות הפקודה ממשק רכישת נתונים ( למשל "בדיקת ממברנה" במערכת AXON) על ידי החלת צעד מתח ( למשל 5 mV עבור 100 אלפיות השנייה) שנוצר על ידי מגבר מבוקרת מחשב. שינוי micropipette חדש אם ההתנגדות היא משמעותית מחוץ לטווח זה.
    3. התחל להזיז את המטרה רכוב על המיקרוסקופ; בהדרגה להנחות את micropipette לכיוון התא הנבחר. תמיד להוריד את המטרה הראשונה, ולאחר מכן להוריד את micropipette אל המטוס של המיקוד, עד micropipette הוא מעל פני השטח המרכזי של התא הנבחר.
    4. ביטול פוטנציאל צומת נוזלי בין פיפטה ופתרונות אמבטיה לאפס באמצעות הפקודה "פיפטה לקזז" בממשק המפקד של התוכנה.
    5. הגדר את המגבר הנשלט באמצעות מחשבו אנדר כדי מתח מהדק ואת הממברנה הבדיקה למצב "אמבטיה".
    6. פיין להתמקד עבור תצוגה ברורה יותר של התא, ולאחר מכן בהדרגה להוריד את micropipette באמצעות micromanipulator במהירות בינונית נמוכה.
    7. כאשר micropipette קרוב לתא (שהוכח על ידי זרם ירד כאשר מופעלות על ידי הפקודה הבדיקה הממברנה), להסיר את הלחץ החיובי נמוך מיד להחיל לחץ שלילי חלש (נפח 0.1 מזרק מ"ל) כדי ליצור את gigaseal (> 1 GΩ) .
    8. צג את ההתנגדות עם הממברנה הבדיקה. אם ההתנגדות היא> 500 MΩ אבל <1 GΩ, יש ליישם פוטנציאל שלילי (בדרך כלל כבעלת הפוטנציאל החזק - 60 mV), אשר יכול לעזור ליצור את gigaseal. לפצות את זרם קיבולי חולף של micropipette.
    9. אם החותם הוא 1 GΩ ויציב (כפי שמוצג בממשק התוכנה), יש ליישם שאיבה קצרה וחזקה כדי לשבור את קרום התא. אין להחיל פיצוי עבור seRies ההתנגדות ואת קיבול התא.
    10. מיד לאחר השגת תצורה של תא שלם מוצלח, יש ליישם צעד 10 hypervolarizing 10 (5-עקבות עם מרווחי זמן מינימלי, 20 ms משך, מדגם אות ב 20 קילוהרץ) מ פוטנציאל החזקה של -60 mV.
    11. החלף את מצב המתח למצב אפס הנוכחי לסמן את הקריאות מממשק התוכנה או לבצע הקלטה ללא פער (10-60 שניות) על הקריאות פוטנציאל הממברנה של התא.
    12. לחזור במהירות ולהישאר במצב מתח וליישם את פרוטוקולי המתח על פי הניסויים המתוכננים ולמדוד את התגובות הנוכחיות. חיסור אינו מוחל על זרם הדליפה הפנימי במהלך ההקלטות.
    13. מעקב אחר יציבות התגובות במהלך ההקלטות, או הפרמטרים השונים של התא. לדוגמא, להשתמש בממשק הפקוד "מבחן ממברנה" כדי לבדוק את עמידות הקלט (i R), התנגדות הסדרה (ים R) ואת התאקרום קיבול (C מ ' ) במבחן הממברנה במצב "תא" במהלך הבורר של פרוטוקולים.
      הערה: טיפות פתאומיות בהתנגדות הקלט מעידות בדרך כלל על תיקון רופף, ועלייה דרמטית בהתנגדות הסדרה עשויה להצביע על סתימת קצה המיקרופטים על ידי האברונים התוך תאיים או שברי הממברנה. במהלך ההקלטה, לפקח באופן קבוע את המיקום micropipette כדי לבדוק אם מתרחשת סחף, אשר עלול להוביל לאובדן התיקון. אם סחיפה היא בעיה, בזהירות להרים את micropipette ואת תא התיקון הרחק מהחלק התחתון של החדר ההקלטה. צעד זה עשוי לפעמים להוביל לאובדן התיקון, ובמקרה זה, יש צורך לחזור על כל התהליך תיקון טלאי תא.

5. ניתוח של נכסים אלקטרונים פסיביים של תאים

  1. לאחר קבלת הנתונים מן הניסויים מהדק תיקון, לפתוח את הנתונים ללא פער בתוכנת Clampfit ולמדוד את הממוצעערך עבור פוטנציאל קרום מנוחה לכל תא. לחלופין, השתמש בערך כפי מסומן למטה מתח הנוכחי אפס במצב הנוכחי. תקן את הערכים עם פוטנציאל צומת נוזלי (12.4 mV במחקר זה).
  2. פתח את הנתונים מ 10- mV hyperpolarizing צעד (ΔV) המתקבל מתא, למדוד את ההבדל הנוכחי לפני ובמהלך שלב (Δ I צעד ), ולחשב את ההתנגדות קלט (R i ) באמצעות המשוואה כמו:
    figure-protocol-1
  3. לחשב את קיבול התא (C מ ' , ביחידה של pF) (להשתמש בנתונים הנוכחי אותו מ 10-mV hyperpolarizing צעד על ידי שילוב השטח הכולל תחת קבלים הנוכחי קבלים במהלך זרם דעיכה הראשונית חולף הרים על ההדק צעד ההדק) כדי לקבל את הערך של סך הטעינה שנצברה (Q, ביחידה של pA • ms) של התא. השתמש במשוואה הבאה:
    figure-protocol-2
  4. חישוב הערך של התנגדות הסדרה (R s ) לכל תא על ידי התאמת הזרם הארעי הראשוני משלב השלילי של 10 mV עם אלגוריתם אקספוננציאלי סטנדרטי כדי להשיג את הזמן הנוכחי של ריקבון קבוע ( T , ביחידה של ms) ולהשתמש משוואה הבאה:
    figure-protocol-3

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליך העיכול האנזימי המתואר לבידוד של תאים אפיתל מן epididymides cauda חולדה הוא פרוטוקול שונה מן המחקרים הקודמים שלנו 9 , 12 . שיטה זו מייצרת תערובת של תאים בודדים עם מעל 90% הכדאיות וללא שלפוחיות פני השטח או נפח נפוח התא. תערובת תאים הטרוגנית מורכבת בעיקר של תאים עיקריים, תאים ברורים ותאי הבסיס, כפי שתיארנו בעבר 1 . בפרוטוקול זה, דגימות טהורות יחסית של תאים אפיתלתיי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה, פיזור אנזימטית של epididymides cauda חולדה בעקביות הניב תאים אפיתל בריאים. איכות התאים אפיתל אפידלימלי עבור ניסויים מהדק תיקון תלוי במספר צעדים קריטיים בפרוטוקול. לדוגמה, צנטריפוגה של תערובת התא על כוח צנטריפוגלי נמוך (30 xg) חשוב להסרת spermatozoa ואת תוכן luminal epididymal; התאים אפיתל אפידלימלי להיות בריא בנוכחות הזרע בתרבות התא. בנוסף, culturing תערובת התא ניתק על צלחת פטרי במשך מספר שעות הוא צעד חשוב על מנת להסיר את fibroblasts ותאי השריר החלקים; התאים שאינם אפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר כריסטופר אנטוס על הערות מועילות על הטקסט. עבודה זו נתמכה על ידי מימון סטארט-אפ מאוניברסיטת שנחאי-טק שהוענק לוויני שום ובמימון הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NNSFC מס '31471370).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>מכשיר של מערכת AXON
מגבר מבוקר מחשבהתקנים מולקולריים - מגברAxon Multiclamp 700B Patch-clamp
מערכת רכישהדיגיטלית התקנים מולקולריים -Digidata 1550
מיקרוסקופאולימפוסBX-61WI
מיקרומניפולטורSutter InstrumentsMPC-325
תא הקלטה ומחמם בשורהWarner InstrumentsTC-324C
מכשיר של מערכת HEKA
Patch מגבר מהדקהרווארד ביוסיינס - HEKAEPC-10 USB מיקרוסקופ כפול
אולימפוסIX73
מיקרומניפולטורSutter InstrumentsMPC-325
תא הקלטה ומחמם בשורהWarner InstrumentsTC-324C
<חזק>מכשיר אחר
Micropipette PullerSutter Instrument P-1000
תא הקלטהוורנר אינסטרומנטסRC-26G או תא
בורוסיליקט זכוכית נימית עם נימהמכשיר סאטר / מכשיר הרווארדBF150-86-10
שולחן בידוד רטטTMC 63544
מצלמת מצלמה דיגיטליתHAMAMASTUORCA-Flash4.0 V2 C11440-22CU
חזק>ריאגנטים לבידוד
RPMI 1640 בינוניGibco22400089
פניצילין/סטרפטומיציןGibca15140112
IMDMATCC 30-2005 
IMDMGibcoC12440500BT
קולגנאז ISigmaC0130
קולגנאז IISigmaC6885
5-α-dihydrotestosteroneMedchemexpressHY-A0120
סרום בקר עובריגדי FBS-12A
<תמיסות פנימיות חזקות>מיקרופיפטות (תמיסה מבוססת K+) (pH 7.2, 280-295 mOsm)
KCl, 35 מ"מסיגמא/V900068
MgCl<תת>2 · 6H2O, 2mMSigma/שונים M2393
EGTA, 0.1mMSigma/שוניםE4378
HEPES, 10mMSigma/ V900477
שונים K-גלוקונאט, 100 מ"מסיגמא /שונים P-1847
מ"ג-ATP, 3 מ"מסיגמא / שוניםA9187
<חזק>תמיסת המלח הפיזיולוגית החיצונית הסטנדרטית (PSS) (pH 7.4, 300-310 mOsm)
NaCl, 140 מ"מסיגמא/שוניםV900058
KCl, 4.7 מ"מסיגמא/V900068
שונים CaCl2, 2.5mMSigma/differentV900266
MgCl2 · 6H2O, 1.2mMSigma/differentM2393
NaH2PO4, 1.2mMSigma/V900060
שונים HEPES, 10mMSigma/V900477 שונים
גלוקוז, 10 מ"מסיגמא/מגווןV900392
<חזק>להתאמת pH
NaOHסיגמאV900797>=97%
KOHSigma/שונים60371טוהר >=99.99%
ממיר Axon תוצרת בית<שונות/טוהר שונים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shum, W. W. C., Ruan, Y. C., Da Silva, N., Breton, S. Establishment of Cell-Cell Cross Talk in the Epididymis: Control of Luminal Acidification. J Androl. 32 (6), 576-586 (2011).
  2. Robaire, B., Hinton, B. T. Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. Plant, T. M., Zeleznik, A. J. , Elsevier. 691-771 (2015).
  3. Da Silva, N., et al. A dense network of dendritic cells populates the murine epididymis. Reproduction. 141 (5), 653-663 (2011).
  4. Kolb, H. A. Special Issue on Ionic Channels II. , Springer. 51-91 (1990).
  5. Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 80 (2), 259-268 (1995).
  6. Frizzell, R. A., Hanrahan, J. W. Physiology of Epithelial Chloride and Fluid Secretion. Cold Spr Harb Pers Med. 2 (6), (2012).
  7. Wong, P. Y. D. CFTR gene and male fertility. Mol Hum Reprod. 4 (2), 107-110 (1998).
  8. Shum, W. W. C., et al. Transepithelial Projections from Basal Cells Are Luminal Sensors in Pseudostratified Epithelia. Cell. 135 (6), 1108-1117 (2008).
  9. Gao, D. Y., et al. Coupling of TRPV6 and TMEM16A in epithelial principal cells of the rat epididymis. J Gen Physiol. 148 (2), 161-182 (2016).
  10. Huang, S. J., et al. Electrophysiological Studies of Anion Secretion in Cultured Human Epididymal Cells. J Physiol. 455, 455-469 (1992).
  11. Chan, H. C., Fu, W. O., Chung, Y. W., Chan, P. S. F., Wong, P. Y. D. An Atp-Activated Cation Conductance in Human Epididymal Cells. Biol Repro. 52 (3), 645-652 (1995).
  12. Cheung, K. H., et al. Cell-cell interaction underlies formation of fluid in the male reproductive tract of the rat. J Gen Physiol. 125 (5), 443-454 (2005).
  13. Pastor-Soler, N., Pietrement, C., Breton, S. Role of acid/base transporters in the male reproductive tract and potential consequences of their malfunction. Physiol. 20, 417-428 (2005).
  14. Evans, A. M., Osipenko, O. N., Haworth, S. G., Gurney, A. M. Resting potentials and potassium currents during development of pulmonary artery smooth muscle cells. Ame J Physiol-Heart Circ Physiol. 275 (3), 887-899 (1998).
  15. Golowasch, J., et al. Membrane Capacitance Measurements Revisited: Dependence of Capacitance Value on Measurement Method in Nonisopotential Neurons. J Neurophysiol. 102 (4), 2161-2175 (2009).
  16. Cole, K. S. Membranes, Ions and Impulses. A Chapter of Classical Biophysics. , University of California Press. Berkeley, Calif. (1968).
  17. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys J. 69, 2800-2807 (1995).
  18. Solsona, C., Innocenti, B., Fernandez, J. M. Regulation of exocytotic fusion by cell inflation. Biophys J. 74 (2), 1061-1073 (1998).
  19. Robinson, D. W., Cameron, W. E. Time-dependent changes in input resistance of rat hypoglossal motoneurons associated with whole-cell recording. J Neurophysiol. 83 (5), 3160-3164 (2000).
  20. Sontheimer, H. Neuro Methods: Patch-Clamp Applications and Protocols. Boulton, A. A., Baker, G. B., Walz, W. , Humana Press. New Jersey. (1995).
  21. Cheung, Y. M., Hwang, J. C., Wong, P. Y. Epithelial membrane potentials of the epididymis in rats [proceedings]. J Physiol. 263 (2), 280(1976).
  22. Lybaert, P., et al. KATP channel subunits are expressed in the epididymal epithelium in several mammalian species. Biol Reprod. 79 (2), 253-261 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים