הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו

18.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55704

⸱

8 ביוני 2017

 ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.

תקציר

אמנם יש התקדמות בולטת במחקר השמיעה בעשורים האחרונים, עדיין אין תרופה עבור אובדן שמיעה Sensorineural (SNHL), מצב זה בדרך כלל כרוך נזק או אובדן של מבנים מכאנסנסורי עדין של האוזן הפנימית. מתוחכם מבחני חוץ גופית vivo לשעבר צמחו בשנים האחרונות, מה שמאפשר את ההקרנה של מספר גדל והולך של תרכובות טיפוליות פוטנציאליים תוך מזעור משאבים מאיצים המאמצים לפתח תרופות עבור SNHL. למרות תרבויות הומוגניות של סוגי תאים מסוימים ממשיכים לשחק תפקיד חשוב במחקר הנוכחי, מדענים רבים כיום להסתמך על תרבויות organotypic מורכבים יותר של האוזן הפנימית Murine, הידוע גם בשם explants cochlear. שימור מבנים תאיים מאורגנים בתוך האוזן הפנימית מקנה הערכה באתרו של מרכיבים שונים של תשתית השבלול, כולל תאי שיער פנימיים וחיצוניים, נוירונים גנגליונים ספירליים, נוירוניםItes, ותאים התומכים. כאן אנו מציגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הכנה זהירה של explants אלה מאפשרת זיהוי של מנגנונים אשר תורמים SNHL ומהווה כלי רב ערך עבור קהילת המחקר השמיעה.

מבוא

אובדן שמיעה חושבי (SNHL) משקף נזק לאוזן הפנימית או מסלול שמיעתי עולה. בעוד אובדן שמיעה הוא הגירעון הסנסורי הנפוץ ביותר בבני אדם 1 , טיפולים מרפא עדיין לא קיים 2 . למרות שתלות שתלי המוח או השמיעה השמיעתית יכולות לשקם מידה מסוימת של שמיעה לחולים עם SNHL חמור עד עומק, השימוע שסופק על ידי מכשירים אלה עדיין שונה מאוד משימוע "טבעי", במיוחד במהלך ניסיונות להבין דיבור ברעש או להאזנה למוסיקה.

בעוד שתנועת תאי השיער נחשבת מזה זמן רב לתוצאה העיקרית של אירועי השמיעה הטראומטיים ( למשל, חשיפה לרעש חזק), יש ראיות גוברות לכך שהסינפסות המשדרות מידע מתאי שיער לעצב השמיעתי הן לפחות פגיעות לטראומה אקוסטית 3 , 4 , 5 > 6 . מאחר וספים אודיומטריים אנושיים, תקן הזהב הנוכחי להערכת תפקוד השמיעה, אינם מנבאים נזק תאגידי ספציפי באוזן הפנימית, נדרשים כלים מעודנים יותר כדי לזהות ניוון תאי מוקדם ככל האפשר וליזום טיפול הולם.

טיפולים תרופתיים מבטיחים לאובדן שמיעה נבדקים לעתים קרובות על תרבויות תאים הומוגניות במבחנה , אך מערכות כאלה אינן מדויקות במדויק את מיקרו-הסביבה של השבלול. תאי Cochlear ידועים כדי להפריש גורמים trophic המשפיעים על סוגי תאים אחרים בתוך שבלול 8 , 9 , תהליך חיוני vivo כי הוא איבד כאשר איבר של קורטי 10 , 11 או ספירל גנגליון נוירונים (SGNs) 12 מתורבתים בבידוד או כאשר סמנים מולקולריים מנותחיםEf "> 13. עם זאת, במחקרים vivo כי ייתכן שיהיה צורך אימות של נתונים במבחנה להקים טיפולים חדשים, אישית עבור אובדן שמיעה במרדף של" רפואה דיוק "דורשים משאבים משמעותיים וזמן.זה רלוונטי במיוחד כאשר שוקלים כמה מאמץ נדרש כדי לבצע מושלמת אוזן באמצע או חלון עגול זריקות הממברנה עם בדיקות השמיעה ולאחר מכן לנתיחה של מכלול שבלול כולו.ההקרנה היעילה של תרכובות מבטיח בתרבויות vivo לשעבר organotypic המכונה explants cochlear מספק חלופה כלכלית ואמינה 14 , 15 , 16 , 17 .

מאמר זה מפרט פרוטוקול שבאמצעותו ניתן ליצור, לשמור ולהעריך explants cochlear מטופלים. יישומים ספציפיים למודל זה מודגשים, כולל השימוש בו בהקרנהשל תרכובות טיפוליות פוטנציאליות והערכה השוואתית של וקטורים ויראליים לריפוי גנטי. גישה vivo exant לשעבר מאפשר לחוקרים לדמיין את ההשפעות של טיפול נתון על אוכלוסיות תאים שונים באתרם , להקל על זיהוי של סוג ספציפי תאים מנגנוני ואת חידוד הבאים של טיפול ממוקד.

בסך הכל, טכניקה זו מספקת מודל ללמוד את vivo cochlea לשעבר תוך שמירה על חוצה שיחה בין סוגי תאים שונים מאוד להתקיים בתוך cochlea.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה (IACUC) של מסצ 'וסטס עין ואוזן. ניסויים בוצעו על פי קוד האתיקה של האיגוד הרפואי העולמי.

1. הכנת הדיסקציה

  1. הכנת השולחן הניתוח
    1. השתמש באתנול 70% לחטא את השולחן כירורגי.
    2. מקום שני רפידות הכנה nonsterile ליד המיקרוסקופ.
    3. הכן את מגש המכשיר, כולל מספריים ההפעלה מעוקרים בחום, ידית אזמל, סכין מיקרו, מלקחיים (שני כל אחד # 4 & # 55). מניחים את מגש המכשיר ואת 50 מ"מ, שקוף היטב, זכוכית צלחת פטרי תחתית על משטח אחד סטרילי.
    4. השג להב סטרילי מס '15 באזמל; שקית ניילון או מכולה (להשליך את הפגרים בהתאם להנחיות המוסדיות); קרח בדלי; ו קר, סטרילי של תמיסת מלח מאוזן של Hank (HBSS). המקום פריטים אלה עלפנקס אחר nonsterile.
    5. מעבירים את HBSS לתוך צינור פלסטיק 50 מ"ל מעבדה ולשים אותו על הקרח.
  2. הכנת התרבות
    1. הכן את כל החומרים ברדס זרימה למינרית. עבור כל ארבעה דגימות, לשים ארבעה autoclaved 10 מ"מ כיסוי זכוכית עגול מחליק בארבעת שיבוצים של 35 מ"מ 4 צלחת פטרי.
    2. עבור כל 4 דגימות, לערבב נפח כולל של 300 μL המורכב הבאים בצינור microcentrifuge: 10 μL של דבק רקמות, 285 μL של NaHCO 3 , ו 5 μL של NaOH.
    3. שים 45 μL של הפתרון שנוצר על כל כיסוי להחליק ולהשאיר אותו שם לפחות 20 דקות ב RT; פתרון זה ניתן להשאיר על coverslip במשך מספר שעות, אבל לא ניתן להשאיר O / N.
    4. מניחים אחד או שניים 35 מ"מ 4-גם צלחת פטרי (es) בתוך צלחת 10 פטרי ס"מ על מנת ליצור שני מחסומים נגד זיהום.
    5. הכינו בינוני תרבות המכיל 98% Dulbecco השתנה של הנשר בינוני (DMEM), 1% N-2, ו 1% ampicillin (65 μL לכל טוב בצינור צנטריפוגה (מיקרו)). חם פתרון 25 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

2. Murine Cochlear Explant Dissection

  1. עריפת ראש של העכבר הילוד
    1. השג 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק לרסס אתנול 70% במכסה שלה, כך שהמשטח רטוב.
    2. יוצקים HBSS קר מן צינור המעבדה הפלסטיק לתוך החלק התחתון של פלסטיק 60 מ"מ ואת 50 מ"מ צלול בצלחת, צלחת פטרי תחתית זכוכית. אחסן את המעבדה פלסטיק צלחת שתי מנות פטרי על הקרח כדי לשמור על רקמות קר בכל פעם שזה לא להיות גזור.
    3. מניחים עכבר P3 - P5 בגיל הילוד על הקרח באצבע החתך של כפפת לטקס לחכות עד היפותרמיה גורם לאובדן הכרה (כ 1-3 דקות).
    4. לערוף את העכבר במהירות עם המספריים ההפעלה להשליך את הגוף בשקית פלסטיק sealable. שים את ראשו של התינוק הנגוע70% אתנול במכסה של צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק.
  2. דיסקציה מאקרוסקופית של העצם הזמנית
    1. הסר את העור של הגולגולת על ידי ביצוע חתך שטחי מן הקדמי עד הקצה האחורי (ישירות על גבי תפר sagittal) באמצעות להב סכין מנתחים.
    2. חותכים שתי תעלות השמיעה החיצונית עם להב אזמל לקפל את העור anteriorly לחשוף את הגולגולת כולה.
      הערה: אמנם אין צורך במיקרוסקופ לנתיחה בדרך כלל עבור שלב זה, זה יכול לשמש להדמיה משופרת.
    3. פתח את הגולגולת לאורך תפר sagittal באמצעות להב # 15 אזמל. הקפד לחתוך את הגולגולת על ידי העברת בעדינות את הלהב למעלה ולמטה מ הקדמי כדי האחורי כדי למנוע דחיסה של cochleae.
      הערה: הגולגולת לא צריך להיות ossified בגיל זה צריך לחתוך בקלות.
    4. הסר וזורקים את חוטם על ידי ביצוע חתך אנכי ישירות אל מסלולים באמצעות # 15 אזמללהב.
      הערה: החלק האחורי של הגולגולת צריך עדיין להכיל את המוח ואת שבלול.
    5. השלך של המוח הקדמי, המוח הקטן, וגזע המוח באמצעות דיסקציה קהה עם # 4 מלקחיים.
  3. מיצוי מיקרוסקופי של השבלול
    1. התאם את המיקרוסקופ (הגדלה 6.5X) ואת מקור האור על ידי הצבת מלקחיים תחת היקף ואופטימיזציה התאורה ואת המיקוד.
    2. מניחים את שני חצאים של הגולגולת לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק מלא HBSS קר.
    3. לחשוף לחלוטין את cochlea / e, לזיהוי כמו להיות סמוך לעורק stapedial שמסביב (עורק מפותל בתוך העצם הזמנית), וכן להפריד את האורגן בצורה ברורה מן העצם הזמנית באמצעות # 4 מלקחיים.
    4. מעבירים את שבלול לתוך צלחת פטרי 50 מ"מ, צלול זכוכית, תחתית זכוכית ומניחים את צלחת מתחת למיקרוסקופ.
    5. מניחים את צלחת פטרי 60 מ"מ פלסטיק עם החצי השני של הגולגולת על הקרח.
    6. הסר את שבלול מן המערכת שיווי המשקל בזהירות לנתח את הקפסולה otic cochlear (בדרך כלל סחוס בגיל זה) עם # 4 מלקחיים. השתמש # 55 מלקחיים עבור כל השלבים הבאים.
  4. השלבים הסופיים של עיבוד רקמות
    1. המשך עם העיבוד של רקמת האוזן הפנימית על ידי הפרדה קפדנית של הליגמנט הלולייני הדבוק לאיבר של Corti משאר שבלול ואת modiolus באמצעות סכין מיקרו או שני מלקחיים.
      1. גזור לתוך אזור כהה, שקוף על הסדק בין הלולאה הלוליינית לאזור תא השיער ולהמשיך להסרת הבא של הלולאה הספירלית על ידי אחיזתו בהיבט הבסיסי ביותר בעדינות תוך כדי הסרת אותו בעדינות.
    2. מקם את הדגימה כדי לקבל תצוגה אורכית, sagittal של שבלול לחתוך את cochlea לתוך שניים עד שלושה חלקים באמצעות סכין מיקרו, סיווג חלקים אלה כמו apical, (באמצע,) ו - bאסאל מסתובב. הסר את הרקמה מעולה ונחותים את השכבה בפועל של תאי שיער ו neurites על מנת להשיג חתיכת explant cochlear שיכול להניח אופקית על צלחת פטרי.
      הערה: גודל מתאים להדבקה יציבה לתבשיל התרבות הוא כמחצית מפנה אחד של cochlear.
    3. מוציאים את הממברנה הטקטוריאלית, שכבה דקה מאוד שקופה העולה מיד על האיבר של קורטי, על ידי קילוף בעדינות את זה עם מלקחיים.
    4. הסר את הממברנה של רייסנר, מיד עולה על SGNs, על ידי נגיעה זה עם מלקחיים משני הצדדים וקילוף אותו.
      הערה: הסר את כל האזורים תא פגום שיער פגום על ידי חיתוך אותם עם סכין מיקרו.

3. העברת דגימות לתבניות התרבות

  1. הסר את 45 μL של תמיסת דבק רקמות מן ארבע מחליק תלושי. לשטוף כל להחליק לכסות עם 50 μL של סטרילי H 2 O. לשאוב את המים.
  2. לאסוף את פיפטה 1 מ"ל. רטוב קצה פיפטה עם כ 120 μL של DMEM כדי למנוע את הדגימה מן היצמדות הפנימי של קצה.
  3. מעבירים את הדגימות בנפרד באמצעות פיפטה 1 מ"ל. פיפטה מקסימום של 70 μL מן HBSS מלא, קטן, ברור, זכוכית צלחת פטרי התחתונה ומניחים את הדגימה יחד עם נוזל על אחד של 4 שיבוצים (מוכן עם כיסוי להחליק) בצלחת 4-פטרי .
  4. בדוק מתחת למיקרוסקופ (הגדלה 50X) כי הדגימה היא בכיוון הנכון. ודא כי האזור של תאים שיער שממנו הממברנה הטקטורי הוסר הפנים כלפי מעלה. ודא כי הממברנה basilar, יחד עם החלק התחתון, הבסיאלי של modiolus, פונה כלפי מטה דבק coverslip.
    1. אם הדגימה מכוונת הפוך במהופך על הבדיקה, להפקיד את HBSS שנותר קצה פיפטה לתוך שיבוץ למקם את חתיכת עד שהוא בכיוון הנכון.
      לאTE: זה ימנע תאי שיער מן צף בינוני תרבות ללא תמיכה מבנית מן coverslip, אשר עלול להוביל להתנוונות.
  5. לשאוב HBSS עודף באמצעות פיפטה 1 מ"ל. המתן 15 שניות.
  6. פיפטה 60 μL של המדיום תרבות מוכן חם (98% DMEM, 1% N-2, ו 1% ampicillin) ישירות על הדגימה. הקפד לא לגעת הדגימה עם פיפטה. החלף את צלחת פטרי הפנימי והחיצוני מכסה דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. החזירו את כל פתרונות המלאי למקומם הנכון, השליכו פגרים ופסולת שיורית, חיטטו את השולחן הכירורגי על פי הנחיות מוסדיות ( למשל, באמצעות אתנול או היפוכלוריט), נקו את החיטוי ואת החיטוי, והשליכו את החדים במיכל המתאים .

4. הוספת סופי תרבות מדיה ותכנים של עניין

הערה: explants Cochlear יהיה מוכן לשימוש 10-16 שעות מאוחר יותר.

  1. הכן mixtuמחדש של 97% DMEM, 1% בסרום שור עוברית (FBS), 1% N-2, ו 1% ampicillin (65 μL לכל טוב בצינור microcentrifuge, חם הפתרון 25 מעלות צלזיוס לפני השימוש).
  2. הוסף חומרים אחרים המעניינים את הפתרונות לקבוצות הטיפול המתאימות. אם חומרים פלואורסצנטיים מתווספים ( לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -חשוף וירוסים, בפרסום האחרון, ריכוז של 10 10 GC של Adeno- המשויכים וירוסים (AAVs) שימש במשך 48 שעות ב 50 μL) 18 , להגן מפני אוֹר.
  3. מעבירים את cochlear explant המכילים מנות פטרי מן החממה ומניחים אותם מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
  4. לשאוב בינוני המדיום הישן (w / o FBS) עם פיפטה מן שיבוצים.
  5. הוסף 60 μL לכל טוב של התרבות החמה מוכנה (טיפול) בינוני (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicillin, ואת החומרים של עניין).
  6. מניחים את צלחת פטרי בחזרה לתוך החממה (37 מעלות צלזיוס).
  7. הצג rבמיוחד מתחת למיקרוסקופ לזהות סימנים של זיהום, נדידה סלולרית, או ניתוק של cochlear explant ולבצע מכתים לאחר מקסימום של 7 ימים.

5. Immunofluorescence - יום 1

  1. הכן פתרון חסימה (94% פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), 5% עזים נורמלי או הסרום סוס (NGS / NHS, בהתאם הנוגדנים המשניים), ו 1% Non- יונית פעילי שטח (ראה טבלה של חומרים )) ומלאי נוגדנים (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% ללא פעילי שטח יוניים עם נוגדנים בהתאמה).
    הערה: נוגדנים כוללים ארנבת נגד Myo7A בריכוז של 1: 400+ (מיוזין 7A, עבור תאי שיער פנימיים וחיצוניים) ועכבר נגד TuJ1 1: 200 + (β- טובולין, עבור SGNs) או עכבר (IgG1) נגד -CtBP2 1: 200+ (c- מסוף חלבון מחייב, עבור presynapse), עכבר (IgG2a) נגד PSD95 1: 50 + (צפיפות postsynaptic, עבור postsynapse), ועוף נגד NF-H 1: 1000 + (neurofilament, עבור SGNs וסיבי עצב). "+" MeNs "ומעלה".
  2. לשאוב את המדיום תרבות באמצעות פיפטה. הקפד לא לגעת הדגימה.
  3. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, לשטוף את explants cochlear פעמיים עם PBS סטרילית, הצבת דגימות על שייקר במשך 5 דקות לאחר כל לשטוף.
  4. תקן את הרקמה paraformaldehyde 4% (PFA - זהירות) במשך 20 דקות על שייקר (מתחת למכסה המנוע). לשאוב את PFA.
  5. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  6. מניחים את explants cochlear בפתרון חסימת מוכן (94% PBS, NHS 5%, ו 1% Non- יונית פעילי שטח) במשך 30 דקות על שייקר.
  7. מניחים את explants cochlear בפתרון נוגדנים מלאי מוכן (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% ללא פעילי שטח יוניים) עם נוגדנים העיקריים בהתאמה (מערבולת לפני השימוש) O / N על מונה ב RT.
    הערה: לעטוף את צלחות פטרי עם מגבות נייר לחים עטוף בניילון נצמד (או רדיד אלומיניום אם הוסיף סולוטיון מכיל חומרים ניאון כגון GFP- להביע וירוסים) כדי לשמור על לחות כלים כדי למנוע אידוי של פתרון נוגדנים O / N.

6. Immunofluorescence - יום 2

  1. הכן את 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) כתם (300 ננומטר) ולהשתמש פתרון נוגדן המניות כדי לקבל את תערובות נוגדנים משני הנכון, משלימים את הנוגדנים העיקריים בשלב 5.1. ( למשל , עזים נגד ארנב 488 1: 200 + ו עז נגד עכבר 568 1: 200 + או עז נגד עכבר (IgG1) 568 1: 1000 +, עז נגד העכבר (IgG2a) 488 1: ו עזים נגד עוף 647 1: 200 + OR Phalloidin 568 1: 200 + (עבור תאי שיער פנימיים וחיצוניים)).
  2. לשאוב את הפתרון נוגדנים ראשוניים.
  3. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  4. מניחים את explants cochlear בפתרון נוגדן מלאי מוכן (98.6% PBS, 1% NHS, ו 0.4% פעילי שטח לא יוניים) עם resנוגדנים משני משנית (מערבולת לפני השימוש) עבור 1.5 שעות על הדלפק ולהגן מפני האור.
  5. לשאוב את הפתרון נוגדנים משני ולשטוף את explants cochlear עם כתם DAPI (הנחת על שייקר במשך 1 דקות ולאחר מכן לשאוב).
  6. החל 60 μL של PBS כדי explants cochlear ומניחים את צלחת פטרי על שייקר במשך 5 דקות. לשאוב את PBS. חזור על 3x.
  7. השתמש מלקחיים כדי להסיר coverslips עם דגימות מהצלחת 4-היטב, לטבול אותם לתוך נמען מלא מזוקק H 2 O, ויבש את coverslips על ידי אנכית להביא אותם במגע עם מגבות נייר.
  8. מניחים טיפה של המדיום גובר antifade על השקופית מיקרוסקופ להפוך את coverslips לטבול את הרקמה הפונה כלפי מטה במדיום.
  9. חותם את coverslip באמצעות לק לציפורניים ברור מכסה את הקצה (בלי לרסק את הדגימה מתחת לזכוכית). השאירו את השקופיות שוכב שטוח באזור מכוסה הרחק מן האור במשך 15 - 20 דקות עד יבש הלשים אותם בקופסה או לבחון תחת מיקרוסקופ confocal.
    הערה: מכתים פלואורסצנטי נשמר הטוב ביותר על ידי אחסון שקופיות ב 4 או -20 מעלות צלזיוס.

7. הדמיה confocal

  1. קבל סקירה כללית zoomed בתמונות עבור האיבר של האזור Corti, כולל neurites ו SGNs.
    הערה: הגדרות סטנדרטיות עבור תהליך ההדמיה: תבנית של 1,024 x 1,024 פיקסלים, מהירות של 400 הרץ, ממוצע מסגרת של 3, 20% עוצמת הלייזר הכוללת, ובדרך כלל 20x ו 63x עדשה עם טבילה שמן (בשילוב עם זום דיגיטלי 2x). הגדרות ערוץ עבור פרוטוקול DAPI, Myo7A ו- TuJ1 מתוארים לעיל: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0.0% - 488 15% פלואורסצין איזותרפיאנט (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "חכם אופסט" 0.0% - 561 13% tetramethylrhomadine isothiocyanate (TRITC), "חכם רווח" 562.4V, "חכם אופסט" 0.0%.
  2. למזג את התמונות בערימה z באמצעותתוכנה כדי לקבל תחזית ציר z.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעוד פרוטוקולים רבים מתמקדים באיבר של explants קורטי, טכניקה זו מנסה לשמר את האנטומיה של התור כולו cochlear, כולל SGNs. זה נותן לחוקרים את ההזדמנות לנתח את ההשפעות של טיפול נתון על neurites ו somata של SGNs בנוסף האיבר של קורטי. ביצוע דיסקציה שמשמרת חלק מהמודולוס, כפי שמתואר כאן, מאתגר יותר מבחינה טכנית מאשר חשיפת האיבר של קורטי בלבד. עם זאת, האזור neurite ו SGN חשוב, כי השפעות פתולוגיות משמעותיות נצפו באזור זה לאחר החלת הפרעות שוואנומה שיווי המשקל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

החוקרים חייבים להשלים את הטכניקה לנתיחה לפני ביצוע ניסויים מעורבים explants cochlear. תאי שיער נפגעים בדרך כלל במהלך ניתוחים המבוצעים בשלב מוקדם בעקומת הלמידה, ורגע בעייתי במיוחד בשלמותם הוא הסרת הממברנה הטקטוריאלית, המחייבת ידיים יציבות, כלים מתאימים וניסיון. כדי לחסוך זמן ומשאבים, שליטה חזותית צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואזורים שנפגעו פוטנציאלית יש לציין. במקום להשתמש נוגדנים ראשוניים ומשניים יקרים, ריאגנטים זולים יותר כמו phalloidin מתאימים יותר עבור ניסויים ראשוניים. אק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה SD), משרד ההגנה מענק W81XWH-15-1-0472 (KMS), קרן ברטרלי (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) ומרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS). אנו מודים לג 'סיקה E. Sagers, BA עבור הערות תובנה על כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Ampicillin, נתרן מלחInvitrogen11593-027
נוגדן נגד CtBP2, עכבר (IgG1)BD Transduction Laboratories612044
נוגדן נגד Myo7A, ארנבProteus Biosciences25-6790
נוגדן נגד NF-H, עוףEMD MilliporeAB5539
נוגדן נגד PSD95, נוגדנים לעכבר (IgG2a) בע"מ75-028
נוגדן נגד TuJ1, עכברBioLegend801202
דבק תאים ורקמות Cell-Tak, 5 מ"גצינורות
CELLSTAR 15 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים,של Greiner Bio-One188161
CELLSTAR, 100 x 20 מ"מגריינר ביו-וואן664160
צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 35 x 10 מ"מ, 4 טבעות פנימיותGreiner Bio-One627170
צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 60 x 15 מ"מGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה, תחתית חרוטית, סיום לימודים,גריינר סטרילי Bio-One227261
לק שקוףמדעי מיקרוסקופיהאלקטרונית 72180
כלים תחתונים מזכוכית שקופה (זכוכית 40 מ"מ), PELCO®, שרוול/20, 50 x 7 מ"מטד פלה בע"מ.14027-20
כיסויים, עגולים, זכוכית, קוטר 10 מ"מ, עובי #1, 0.13 - 0.16 מ"מטד פלה בע"מ.
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
מים מזוקקים, 500 מ"לThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 מלקחייםFine Science Tools11241-30
Dumont #55 מלקחיים (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
אלכוהול אתילי (EtOH), טהור, 200 הוכחה, נטול מים, ≥ 99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10437-028 Aliquot בצינורות של 50 מ"ל ומאחסנים ב-20° C מקפיא
עיזים נגד עוף-647 נוגדן משניתרמו פישר סיינטיפיקA-21469
עיזים נגד עכברים (IgG)-568 נוגדן משניתרמו פישר סיינטיפיקA-11004
עיזים נגד עכברים (IgG1)-568 נוגדן משניתרמו פישר סיינטיפיקA-21124
עיזים נגד עכברים (IgG2a)-488 נוגדן משניתרמו פישר סיינטיפיקA-21131
נוגדן משני נגד ארנב-488 ThermoFisher ScientificR37116
H2O, סטרילי, מים טהורים במיוחד של EmbryoMax, 500 מ"לEMD MilliporeTMS-006-B
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום, 500 מ"למגש מכשירים Thermo Fisher Scientific14025-092
עם מכסה נירוסטהMountainside MedicalTechMed4255
סכין מיקרו (חיתוך) – זווית 30°Fine Science Tools10056-12
שקופיות מיקרוסקופ, VistaVision, מקודד צבע, 75 x 25 מ"מ (3 x 1 אינץ'), עובי 1 מ"מ, לבן, חבילה של 72VWR16004-382
N-2 תוסף (100X), 5 מ"לThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, נתרן ביקרבונט 7.5% תמיסה, 100 מ"לThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, תמיסת נתרן הידרוקסיד, 1 ליטרThermo Fisher ScientificSS266-1
סרום סוס רגיל (NHS)Invitrogen16050130
מספריים הפעלהRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), דרגת ריאגנט,סיגמא-אולדריץP6148לפני השימוש: קבע נהלי הפעלה סטנדרטיים המבוססים על פרוטוקולים זמינים באינטרנט
PBS, pH 7.4, 500 מ"לThermo Fisher Scientific10010-023 חיטוי לפני השימוש
פלואידין, אלקסה פלואור 568 Thermo Fisher ScientificA12380
כרית הכנה, לא סטרילי Medline05136CS
צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 0.5 מ"לEppendorf022363719חיטוי לפני השימוש
בצינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 1.5 מ"לEppendorf022363204אוטוקלאב לפני השימוש
להבי אזמל - #15Fine Science Tools10015-00
ידית אזמל - #4Fine Science Tools10004-13
סטמי 2000-C מיקרוסקופ סטריאוZeiss 000000-1106-133
מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP5LeicaN/A
Triton-X (פעילי שטח לא יוניים)IntegraT756.30.30
VectaShield אמצעי הרכבה נגד דהייה עבור מעבדות וקטור פלואורסצנטיות, בע"מH-1000
, ניתן לסגירה חוזרת, 0609132541599 אומגה בעובי 4 x 6 אינץ' - 2 מ"מ
צנטריפוגה 354241 צלחת תרבית תאים סטרילית 260368' גבישי תיק רוכסן

מקורות

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

שבלול עכברים ניאונטלייםניתוח תאי שיערהנוירונים של הגנגליון הספירליתרבית אורגנוטיפיתפרוצדורת צביעה אימונוהיסטוכימיתהסרת קרומית הטקטוריהחתכי סיבובים של השבלולניתוח דימוי קונפוקאלי
Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.