המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הטכניקה יכולה להיות מנוצל כמו כלי בדיקה במבחנה במחקרי שמיעה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
אמנם יש התקדמות בולטת במחקר השמיעה בעשורים האחרונים, עדיין אין תרופה עבור אובדן שמיעה Sensorineural (SNHL), מצב זה בדרך כלל כרוך נזק או אובדן של מבנים מכאנסנסורי עדין של האוזן הפנימית. מתוחכם מבחני חוץ גופית vivo לשעבר צמחו בשנים האחרונות, מה שמאפשר את ההקרנה של מספר גדל והולך של תרכובות טיפוליות פוטנציאליים תוך מזעור משאבים מאיצים המאמצים לפתח תרופות עבור SNHL. למרות תרבויות הומוגניות של סוגי תאים מסוימים ממשיכים לשחק תפקיד חשוב במחקר הנוכחי, מדענים רבים כיום להסתמך על תרבויות organotypic מורכבים יותר של האוזן הפנימית Murine, הידוע גם בשם explants cochlear. שימור מבנים תאיים מאורגנים בתוך האוזן הפנימית מקנה הערכה באתרו של מרכיבים שונים של תשתית השבלול, כולל תאי שיער פנימיים וחיצוניים, נוירונים גנגליונים ספירליים, נוירוניםItes, ותאים התומכים. כאן אנו מציגים את הכנה, תרבות, טיפול, immunostaining של explants מון neonatal cochlear. הכנה זהירה של explants אלה מאפשרת זיהוי של מנגנונים אשר תורמים SNHL ומהווה כלי רב ערך עבור קהילת המחקר השמיעה.
מבוא
אובדן שמיעה חושבי (SNHL) משקף נזק לאוזן הפנימית או מסלול שמיעתי עולה. בעוד אובדן שמיעה הוא הגירעון הסנסורי הנפוץ ביותר בבני אדם 1 , טיפולים מרפא עדיין לא קיים 2 . למרות שתלות שתלי המוח או השמיעה השמיעתית יכולות לשקם מידה מסוימת של שמיעה לחולים עם SNHL חמור עד עומק, השימוע שסופק על ידי מכשירים אלה עדיין שונה מאוד משימוע "טבעי", במיוחד במהלך ניסיונות להבין דיבור ברעש או להאזנה למוסיקה.
בעוד שתנועת תאי השיער נחשבת מזה זמן רב לתוצאה העיקרית של אירועי השמיעה הטראומטיים ( למשל, חשיפה לרעש חזק), יש ראיות גוברות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה (IACUC) של מסצ 'וסטס עין ואוזן. ניסויים בוצעו על פי קוד האתיקה של האיגוד הרפואי העולמי.
1. הכנת הדיסקציה
- הכנת השולחן הניתוח
- השתמש באתנול 70% לחטא את השולחן כירורגי.
- מקום שני רפידות הכנה nonsterile ליד המיקרוסקופ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעוד פרוטוקולים רבים מתמקדים באיבר של explants קורטי, טכניקה זו מנסה לשמר את האנטומיה של התור כולו cochlear, כולל SGNs. זה נותן לחוקרים את ההזדמנות לנתח את ההשפעות של טיפול נתון על neurites ו somata של SGNs בנוסף האיבר של קורטי. ביצוע דיסקציה שמשמרת חלק מהמודולוס, כפי שמתואר כאן, מאתגר יותר מבחינה טכנית מאשר חשיפת האיבר של קורטי בלבד. עם זאת, האזור neurite ו SGN חשוב, כי השפעות פתולוגיות משמעותיות נצפו באזור זה לאחר החלת הפרעות שוואנומה שיווי המשקל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
החוקרים חייבים להשלים את הטכניקה לנתיחה לפני ביצוע ניסויים מעורבים explants cochlear. תאי שיער נפגעים בדרך כלל במהלך ניתוחים המבוצעים בשלב מוקדם בעקומת הלמידה, ורגע בעייתי במיוחד בשלמותם הוא הסרת הממברנה הטקטוריאלית, המחייבת ידיים יציבות, כלים מתאימים וניסיון. כדי לחסוך זמן ומשאבים, שליטה חזותית צריכה להתבצע תחת מיקרוסקופ לנתיחה ואזורים שנפגעו פוטנציאלית יש לציין. במקום להשתמש נוגדנים ראשוניים ומשניים יקרים, ריאגנטים זולים יותר כמו phalloidin מתאימים יותר עבור ניסויים ראשוניים. אק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של חירשות הפרעות תקשורת אחרות מעניקה R01DC015824 (KMS) ו T32DC00038 (תמיכה SD), משרד ההגנה מענק W81XWH-15-1-0472 (KMS), קרן ברטרלי (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS) ומרכז המחקר לאואר טיניטוס (KMS). אנו מודים לג 'סיקה E. Sagers, BA עבור הערות תובנה על כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ampicillin, נתרן מלח | Invitrogen | 11593-027 | |
| נוגדן נגד CtBP2, עכבר (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| נוגדן נגד Myo7A, ארנב | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| נוגדן נגד NF-H, עוף | EMD Millipore | AB5539 | |
| נוגדן נגד PSD95, נוגדנים לעכבר (IgG2a) | בע"מ | 75-028 | |
| נוגדן נגד TuJ1, עכבר | BioLegend | 801202 | |
| דבק תאים ורקמות Cell-Tak, 5 מ"ג | צינורות | ||
| CELLSTAR 15 מ"ל, תחתית חרוטית, סיום לימודים, | של Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR, 100 x 20 מ"מ | גריינר ביו-וואן | 664160 | |
| צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 35 x 10 מ"מ, 4 טבעות פנימיות | Greiner Bio-One | 627170 | |
| צלחת תרבית תאים CELLSTAR, 60 x 15 מ"מ | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה, תחתית חרוטית, סיום לימודים, | גריינר סטרילי Bio-One | 227261 | |
| לק שקוף | מדעי מיקרוסקופיה | אלקטרונית 72180 | |
| כלים תחתונים מזכוכית שקופה (זכוכית 40 מ"מ), PELCO®, שרוול/20, 50 x 7 מ"מ | טד פלה בע"מ. | 14027-20 | |
| כיסויים, עגולים, זכוכית, קוטר 10 מ"מ, עובי #1, 0.13 - 0.16 מ"מ | טד פלה בע"מ. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| מים מזוקקים, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), גלוקוז גבוה, פירובט, ללא גלוטמין, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 מלקחיים | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 מלקחיים (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| אלכוהול אתילי (EtOH), טהור, 200 הוכחה, נטול מים, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, אזורים מאושרים על ידי USDA, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot בצינורות של 50 מ"ל ומאחסנים ב-20° C מקפיא |
| עיזים נגד עוף-647 נוגדן משני | תרמו פישר סיינטיפיק | A-21469 | |
| עיזים נגד עכברים (IgG)-568 נוגדן משני | תרמו פישר סיינטיפיק | A-11004 | |
| עיזים נגד עכברים (IgG1)-568 נוגדן משני | תרמו פישר סיינטיפיק | A-21124 | |
| עיזים נגד עכברים (IgG2a)-488 נוגדן משני | תרמו פישר סיינטיפיק | A-21131 | |
| נוגדן משני נגד ארנב-488 Thermo | Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, סטרילי, מים טהורים במיוחד של EmbryoMax, 500 מ"ל | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), סידן, מגנזיום, ללא פנול אדום, 500 מ"ל | מגש מכשירים Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| עם מכסה נירוסטה | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| סכין מיקרו (חיתוך) – זווית 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| שקופיות מיקרוסקופ, VistaVision, מקודד צבע, 75 x 25 מ"מ (3 x 1 אינץ'), עובי 1 מ"מ, לבן, חבילה של 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 תוסף (100X), 5 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, נתרן ביקרבונט 7.5% תמיסה, 100 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, תמיסת נתרן הידרוקסיד, 1 ליטר | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| סרום סוס רגיל (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| מספריים הפעלה | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), דרגת ריאגנט, | סיגמא-אולדריץ | P6148 | לפני השימוש: קבע נהלי הפעלה סטנדרטיים המבוססים על פרוטוקולים זמינים באינטרנט |
| PBS, pH 7.4, 500 מ"ל | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | חיטוי לפני השימוש |
| פלואידין, אלקסה פלואור 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| כרית הכנה, לא סטרילי | Medline | 05136CS | |
| צינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 0.5 מ"ל | Eppendorf | 022363719 | חיטוי לפני השימוש |
| בצינורות מיקרוצנטריפוגה עם נעילה בטוחה, פוליפרופילן, 1.5 מ"ל | Eppendorf | 022363204 | אוטוקלאב לפני השימוש |
| להבי אזמל - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| ידית אזמל - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| סטמי 2000-C מיקרוסקופ סטריאו | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי TCS SP5 | Leica | N/A | |
| Triton-X (פעילי שטח לא יוניים) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield אמצעי הרכבה נגד דהייה עבור מעבדות וקטור פלואורסצנטיות | , בע"מ | H-1000 | |
| , ניתן לסגירה חוזרת, 0609132541599 אומגה בעובי 4 x 6 אינץ' - 2 מ"מ |
מקורות
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
