מאמר שיטה

בידוד של האוכלוסייה בצד Myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה דג הזברה

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55711

⸱

4 במאי 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים טכניקה לבודד את האוכלוסייה תאים בצד מ מודל דג הזברה של myc- המושרה T- תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). זה assay האוכלוסייה בצד רגיש מאוד מתואר דג הזברה T-ALL, אבל זה עשוי להיות ישים סוגים אחרים של תאים ממאירים ולא ממאיר דג הזברה.

תקציר

אוכלוסיות תאים הטרוגניות, ברקמות בריאים או ממאירים, עשויות להכיל אוכלוסיה של תאים המאופיינים ביכולת דיפרנציאלית להפרדת צבע ה- DNA מחייב 33342. זה "אוכלוסיית הצד" של תאים ניתן לזהות באמצעות שיטות זרימה cytometric לאחר Hoechst 33342 צבע נרגש על ידי לייזר אולטרה סגול (UV). אוכלוסיית הצד של סוגי תאים רבים מכילה תאים דמויי גזע או אב. עם זאת, לא כל סוגי התאים יש אוכלוסייה בצד לזיהוי. Danio rerio , דג הזברה, יש חזקים במודל vivo של תא T-ALL לוקמיה חריפה (T-ALL), אבל אם אלה דג הזברה T-ALLs יש אוכלוסייה צד לא ידוע. השיטה המתוארת כאן מתאר כיצד לבודד את התאים האוכלוסייה בצד דג הזברה T-ALL. כדי להתחיל, T-ALL דג הזברה נוצרת באמצעות microinjection של פלסמידים tol2 לתוך עוברים שלב אחד תא. לאחר הגידול גדלו לשלב שבו הם מתפשטים לתוך יותר ממחצית האניהגוף של mal, תאי T-ALL ניתן לקצור. התאים אז מגואלות Hoechst 33,342 ובחנו ידי cytometry זרימה עבור תאי אוכלוסייה בצד. לשיטה זו יישומים רחב של דג הזברה T-ALL המחקר. אמנם אין סמנים פני תא ידוע של דג זברה כי לאשר תאי אוכלוסייה בצד אלה הם תאים דמויים גזע סרטני, in vivo מבחני השתלה פונקציונליים אפשריים. יתר על כן, transcriptomics מתא בודד יכול להיות מיושם כדי לזהות את המאפיינים הגנטיים של תאי האוכלוסייה בצד אלה.

מבוא

את assay האוכלוסייה בצד מנצל את היכולת המשופרת של תאים מסוימים בתוך רקמה כדי בזרימת צבע מחייב DNA Hoechst 33,342 בשל רמות גבוהות של קלטת מחייב ATP (ABC) חלבונים טרנספורטר על קרום התא. התאים בזרימת הצבע Hoechst 33,342 ניתן לזהות באמצעות ניתוח תזרים cytometric גל כפול אחרי צבען הוא נרגש על ידי לייזר UV. Assay זה שימש הראשון לזהות תאי גזע hematopoietic בעכברים (HSCs) 1, אבל זה ומאז משמש לזיהוי אוכלוסיות תאי גזע / ובתאים רבים רקמות סרטן (הנסקרת תוך התייחסות 2). עם זאת, לא כל האוכלוסיות של תאים יש אוכלוסייה בצד, ולא כל אוכלוסיות הצד מועשרות עבור תאי גזע / אב.

דג הזברה היא מערכת מודל גנטי חוליות עצמה לחקר סרטן 3 אנושי, 4, עם מספר היתרונות על פני mo בעכברים המסורתיdels של סרטן. עוברי דג זברה הם מופרים חיצוניים, ברורים אופטיים, הקלת transgenesis ואת תצפית in vivo של תהליכים פתולוגיים, לרבות ייזום התקדמות סרטן. נכון להיום, assay האוכלוסייה בצד לזהות תאי גזע או ובתאים פוטנציאל יושם רק עד לשד הכליה דג הזברה לזהות HSCs, ולא לכל דגמי סרטן דג הזברה 5, 6.

המודל דג הזברה של לוקמיה לימפובלסטית חריפה תאי T (T-ALL) היא מורפולוגית גנטית דומה האנושי T-ALL 7, 8, 11. T-ALL הוא ממאירות אגרסיבית כי, בבני אדם, מהווה 10-15% של ילדים ו 25% מכלל הבוגרים במקרים 9. בעוד הטיפול של T-ALL השתפר, הישנות עדיין נפוצה קשורה פרוגנוזה גרועה. T-ALL גידולים הם heterogeneיחידות ארגוניות ומכילות תת-אוכלוסיות תאים סרטניים רבות שונות, כוללים תאי ייזום לוקמיה (LICs). LICs מוגדר על ידי יכולתי להצמיח מחדש את הגידול כולו מתא בודד, ואת התדירות של LICs בתוך אוכלוסיית תאים סרטניים יכול להיות מחושב על ידי השתלת תאים במינונים משתנים לתוך נמענים באמצעות assay השתלת דילול מגביל (LDA). בעוד ניסויי LDA בוצעו דג זברה כדי לחשב את התדירות של 8 LICs, 10, 11, קביעה זו נעשית בדיעבד ואינה מאפשרת את הבידוד הפוטנציאלי של LICs. לכן, שיטה לבודדת פרוספקטיבית אוכלוסייה המועשרת עבור פעילות תאי גזע סרטני חסרה. זיהוי ובידוד תאי האוכלוסייה בצד מן דג הזברה טי יכלתי היא הצעד הראשון לקראת פונה חסר זה.

הפרוטוקול המובא כאן מתאר כיצד ליצור ביעילות T-ALL גידולים zebrafish ניצול transgenesis בתיווך-tol2, לקצור את T-ALL תאים גידולים, ואת להכתים אותם עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה בצד של תאים. עתיד בניסויי vivo עם דג הזברה T-ALL יכול לכלול בין תאי האוכלוסייה בצד מועשרים עבור LICs או בעלי תכונות stem- או ובתאים אחרות דמויים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים עם דג הזברה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת שיקגו. אוניברסיטת שיקגו הוא מוכר על ידי האגודה להערכת ההסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים (AAALAC).

1. יצירת בידוד בידוד fluorescently T- כל תאים דג הזברה

  1. Microinjection לתוך עוברי דג הזברה הסיניגנית
    1. באמצעות ערכות זמין מסחרית, לבודד rag2 עגול: c-myc ו rag2 : חלבון פלואורסצנטי ירוק (Rg2: GFP) פלסמיד DNA המכיל חוזר מסוף הפוך המוכרת על ידי טרנספוזיס tol2 (ראה טבלה של חומרים עבור המקור של פלסמיד DNA) 12 ו elute DNA במים סטריליים.
      הערה: GFP משמש במחקר זה, אבל כל חלבון פלואורסצנטי יעבוד.
    2. הכן pCS2-transposase (tol2) RNA
      1. בידוד tol2 פלסמיד DNA באמצעות ערכות זמין מסחרית (ראה tטבלה של חומרים הוא עבור מקור פלסמיד דנ"א) 12 ו elute DNA במים סטריליים.
      2. דגירה 1 מיקרוגרם של ה- DNA tol2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות עם 5 יחידות של אנזים הגבלה NotI במאגר המתאים ליניארי הפלסמיד. חום-להשבית NotI ב 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      3. לתמלל את RNA tol2 עם RNA פולימראז SP6 מן ה- DNA לינארית באמצעות ערכת שעתוק RNA זמין מסחרית 13. חנות RNA ב aliquots לשימוש חד פעמי ב -80 ° C.
    3. מכינים את תערובת הזרקה על הקרח על ידי הוספת 250 ננוגרם של rag2: פלסמיד דנ"א c-myc, 250 ננוגרם של rag2: DNA פלסמיד ה- GFP, 150 ננוגרם של רנ"א tol2, ו 0.5 μL של פנול אדום. כוון את עוצמת הקול 10 μL עם מים nuclease חינם.
    4. להזריק ~ 1 NL של תמהיל הזרקה לתוך תא של העובר דג הזברה syngeneic בשלב אחד התא באמצעות microinjector ו מחט משך מן צינור נימי זכוכית, בעקבות בעבר estabשיטות lished 8, 14.
      הערה: דג הזברה syngeneic שנוצר בשכפול גנטי 15 משמשים כאן כדי לחסל הטרוגניות גנטית ודחייה החיסון לאחר השתלת. עם זאת, דג הזברה wildtype או כל זן הרצוי יכול לשמש גם.
    5. סור מת, לא מפותח, או עובר פגום ב 24 שעות ולאחר 48 שעות לאחר הזרקה 16.
    6. מניחים את הדג מוזרק על מערכת דגים 6 ימים לאחר ההזרקה ולהעלות אותם על פי פרוטוקול סטנדרטי 6.
  2. הקרנת דג זברה מוזרקת וניטור צמיחת גידולים
    1. בשעת 21 ימים לאחר הזרקה, במקום זחל אחד מוזרק אגל של מדיום העובר על צלחת פטרי מסך עבור GFP קרינה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent (bandpass עירור: 470/40, bandpass פליטה: 525/50) 8.
      הערה: זחלי דג זברה כי hAve משולבת הן rag2 : c-myc ו rag2 : GFP יהיה תימוס ניאון ירוק (דגים חיוביים) ועשויים כבר להפגין את הרחבת תאים ממאירים ירוק ניאון מעבר התימוס. כל הדג עם התימוס GFP + ימשיך לפתח GFP + T-ALL. הזחלים שאינם מראים שילוב של פלסמידים לא יהיה כל תאים פלואורסצנטיים ירוקים (דגים שליליים).
    2. להפריד את הדגים השליליים (על בסיס חוסר הקרינה) לתוך טנק אחר לפקח על הדג שוב ב 28 ו -35 ימים שלאחר ההזרקה. ב 28 ו -35 ימים לאחר ההזרקה, להרדים את הדג עם 0.02% שנאגרו tricaine (MS-222) במי המערכת של מערכת דגים לפני ההקרנה.
    3. מניחים כל זחל דג הזברה כי חיובי עבור תימוס שכותרתו fluorescently או גידול שכותרתו fluorescently בטנק בודד לניטור הגידול הגידול שלוש פעמים בשבוע.
  3. אוסף של תאים שכותרתו fluorescently T-ALL מדג הגידול הראשוני
    1. הכן לפחות 20 מ"ל של 10% חום- inactivated בסרום שור עוברית ב 0.9x פוספט שנאגרו מלוחים (FBS / PBS).
    2. הוסף 1 מ"ל של FBS / PBS לבקבוקון אחד של מלח נתרן הפרין (300 יחידות).
    3. בחר דגים הנושאים גידולים ביותר מ 50% של הגוף, או דגים אלה מתקשים לאכול או לשחות. להקריב את הדגים על ידי מינון יתר עם טריקין או על ידי טבילה במים הקרח. לאשר את המוות על ידי חוסר של זיל תנועה דופק.
    4. השתמש סכין גילוח כדי להסיר את ראש הדג.
    5. לשטוף את חלל הדגים עם פתרון הפרין כדי להסיר עודף כדוריות דם אדומות.
      1. באמצעות פיפטה, להזריק 100 μL של פתרון הפרין (מוכן בשלב 1.3.2) לתוך חלל הגוף של הדג. הסר את כל הנוזל שנשפך החוצה (זה יכיל תאי דם) ופיפטה אותו לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.
      2. השתמש קצה פיפטה טרי לשטוף את הגוף שוב. בצעו לפחות שלושה שוטפים, או עד שהנוזלים שנשפכו מופיעים ללא צבעאוד.
      3. מחק את כל הנוזל מן השטיפות ב 1.3.5.1 צעדי 1.3.5.2, כפי שהוא לא ישמש בניתוחים נוספים.
    6. אוספים את התאים לוקמיה.
      1. להזריק 100 μL של FBS / PBS לתוך חלל הגוף של הדג.
      2. להפעיל לחץ עדין החלק החיצוני של הגוף של הדג עם קצה פיפטה לסחוט / לדחוף את תאי הגידול.
        הערה: אם שלב זה מבוצע באמצעות מיקרוסקופ לנתח, תאי גידול השפיכה מתוך חלל הגוף יהיו ברורים.
      3. אסוף את הנוזל ותאי מכל לשטוף לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
      4. חזרו על שלבים 1.3.6.1-1.3.6.3 עד שרוב תאי הגידול נאספים (בדרך כלל 5-10 פעמים). לאסוף את כל התאים הסרטניים לתוך 1.5 מ"ל microcentrifuge צינור זהה. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
    7. מערבבים את התאים הסרטניים שנאספו צעד 1.3.6 ידי pipetting אותם בעדינות כדי לנתק את גושים של תאים. סנן את ההשעיה התא דרך 4מסנן רשת 0 מיקרומטר. שטפו את המסנן 1-2 פעמים עם 100 μL של FBS / PBS. שמור את התאים בטמפרטורת החדר.
    8. מערבבים 2 μL של ההשעיה תא עם 18 μL של trypan כחול (0.4%, בדילול 01:10 ומסוננים) בצינור חדש. טען 10 μL על hemocytometer ולספור את מספר חי (לא כחול) תאי ניאון כדי לחשב את מספר תאים סרטניים בודדים.
      הערה: Non-כחול תאי GFP-שלילי צפויים נורמלים, לא ממאיר T-תאים ולא צריך לספור. לפחות 2 x 10 6 תאים נדרשים להכתים את התאים עם Hoechst 33,342.

2. מגירה על תאים-ALL T שכותרתו fluorescently עם Hoechst 33,342 כדי לזהות את האוכלוסייה Side

  1. לדלל Hoechst 33,342 01:10 עם H nuclease- חופשית 2 O כדי להפוך את הריכוז בעבודה 1 מ"ג / מ"ל. אחסן את הצבע על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
  2. הכן פתרון 100 מ"מ של verapamil ידי המסת 49.1 מ"ג ב 1 מ"ל של sulfoxide דימתיל (DMSO).
    הערה: Verapamil הוא מעכב של מובילי ABC והוא פקד חשוב עבור ניסויי אוכלוסייה בצד. הוספת verapamil כדי דגימות תמנע את היכולת של מובילי ABC כדי בזרימת צבע Hoechst 33,342. לכן, אוכלוסיית צד אמיתית תיעלם כאשר verapamil מתווסף המדגם.
  3. הגדר באמבט מים 28 מעלות צלזיוס.
  4. הכינו דגימות ובקרות בחושך על ידי הוספת תאים ופתרונות צינורות סדרן התא המופעל פלואורסצנטי (FACS).
    1. הכן את הדגימות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של DMSO לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ"ל עם FBS / PBS.
    2. הכן את הבקרות על ידי הוספת 10 6 תאים, 15 μL של 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33,342, ו 2.5 μL של 100 מ"מ verapamil לצינור FACS. כוון את עוצמת הקול 1 מ"ל עם FBS / PBS.
      הערה: מינימום של 10 6 תאים / מדגם מומלץ, אבל מכתים יותר בתאים עדיף, במיוחד אם הצד populatתאי יון ימוינו לניתוח נוסף. אין לעבור 10 6 תאים / מ"ל, ולשמור על ריכוז Hoechst 33,342 ב 15 מיקרוגרם / מ"ל. אם 10 x 10 6 תאים מגואלות, נפח התגובה הכולל הוא 10 מ"ל.
  5. דגירה באמבט מים C 28 ° בחושך במשך 120 דקות.
  6. לאחר הדגירה, למקם את התאים מיד על הקרח ולשמור אותם בחושך.
  7. גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. לשטוף עם 1 מ"ל של FBS / PBS.
  8. גלולת התאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 דקות ב g 300 x. הסר את supernatant. Resuspend התאים 1 מ"ל של FBS / PBS.
  9. שמור על 4 מעלות צלזיוס עד מיון התא.
  10. 15 דק 'לפני מיון תאים, להוסיף 2 μL של יודיד propidium המניות (PI) (1 מ"ג / מ"ל) לכל 1 מ"ל של FBS / PBS (ריכוז סופי: 2 מיקרוגרם / מ"ל). לערבב היטב.

3. השתמשו FACS כדי למצוא את אוכלוסיית הסייד בתוך אוכלוסיית תאי T-ALL שכותרתו fluorescently

  1. לנתח את דג הזברה מוכתמים T-ALL התא השעיות על סדרן התא מצויד לייזר UV עבור Hoechst 33342 עירור צבע ו לייזר 488 ננומטר עבור עירור PI ו לזיהוי של ה- GFP + T-ALL תאים.
  2. קביעת שער לחיות, GFP + T-ALL תאים.
    1. השתמש קדימה פיזור (FSC) ופיזור בצד (SSC) אזור לשפכים החוצה החוצה.
      הערה: FSC משמש כדי להבדיל בין גודל התא ו SSC משמש כדי להבדיל את הפירוט של התא.
    2. השתמש FSC רוחב SSC כדי להפלות כפילויות.
      הערה: ישנם שלושה מרכיבים שזוהו על ידי גלאי cytometer זרימה: שטח, גובה ורוחב. שטח משמש בדרך כלל למדוד את הקרינה של התא. רוחב מודד את זמן הטיסה, והוא רחב פי שניים, אם שני תאים מחוברים זה לזה.
    3. עבור תאים סרטניים חיים, לצייר שער סביב התאים החיוביים עבור ה- GFP ושלילי עבור PI באמצעות גלאים המתאימים ( למשל , FITC עבור ה- GFP ו PerCP Cy5-5 עבור PI).
  3. בשער תא חי, למדוד את Hoechst 33342 הקרינה דרך Hoechst כחול Hoechst האדום bandpass מסננים (450/50 ו 670/30, בהתאמה).
    הערה: אוכלוסיית הצד, אם קיימת, תוצג לאחר הקמתה. חשוב לציין, האוכלוסייה בצד חייב להיעלם שליטה verapamil על מנת שזה ייחשב אוכלוסייה בצד אמיתי.
  4. אם מיון תאים האוכלוסייה בצד לניסויים נוספים, להשתמש קצה זרבובית גדולה (100 מיקרומטר) ולאסוף את התאים לתוך צינור FACS המכיל 3 מ"ל של 100% FBS. השתמש קצה זרבובית גדולה יותר (100 מיקרומטר) במקום קצה קטן (70 מיקרומטר) כדי לשפר את הכדאיות התא לאחר מיון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי ליצור ניאון ביעילות המושרה myc T-ALL גידולים דג הזברה, בונה DNA מעגלי מוקף אתרים transposase tol2 יכול להיות שותף מוזרק עם RNA tol2. מחקרים קודמים מן ההזרקה של ה- DNA לינארית לתוך עוברי דג זברה לדווח על שיעור 5% transgenesis 8. עם הפרוטוקול מותאם כולל transgenesis בתיווך-tol2, שיעורי transgenesis החל 10-44% ניתן לראות (לוח 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Assay האוכלוסייה בצד הוא רגיש מאוד; לכן, שינויים קטנים בפרוטוקול יכול לגרום לקושי באיתור תאים באוכלוסייה בצד. ראשית, הטמפרטורה במהלך שלב מכתים הוא ספציפי לכל חיה / מערכת התא. עבור מערכות יונקים, assay האוכלוסייה בצד מבוצע בדרך כלל על 37 מעלות צלזיוס. כאשר דג הזברה T-ALL תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, רבים של תאים מת, מה שגרם טמפרטורת הדגירה מקובל (הנתונים לא מוצג). כאשר Kobayashi ועמיתיו (2008) גזור דג הזברה מוח העצם עבור assay האוכלוסייה בצד, האינקובציות בוצעו ב 25 ° C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת דירקטוריון שיקגו נשים, קרן Case וונדי וויל, ואוניברסיטת גרנט מרכז התמיכה הסרטן שיקגו מקיף (CA014599 P30). ברצוננו להודות Core cytometry זרימה באוניברסיטת שיקגו עזרתם בהקמת הניסוי הזה, גם שאר חברי המעבדה דה יונג, במיוחד לסלי Pedraza ושון מקונל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דג זברה סינגני (CG2)ראה Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc פלסמידLangenau Laboratory
rag2:GFP פלסמיד שנבנה במקדם de Jong Labrag2 ממעבדת לנגנאו
pCS2-transposase פלסמידChien מעבדה
NotI -אנזים הגבלת HFניו אינגלנד ביו-מעבדות בע"מR3189S500 יחידות ב-25 ומיקרו; L
mMessage Machine SP6 ערכת תמלולאמביוןתרמו פישר סיינטיפיק - AM134025 תגובות
QIAGEN פלסמיד ערכת מידיQiagen, Inc.12643
SteREO Discovery V8 מיקרוסקופקרל זייס מיקרוסקופיה495015-0008-000
מיקרו-מזרק דיגיטליTritech ResearchMINJ-D
פליז מחזיק מחט זרוע ישרהTritech ResearchMINJ-4
בסיס ומעמד מגנטיTritech ResearchMINJ-HBMB
מיקרומניפולטורNarishige בינלאומיMN153
נימי זכוכיתSutter Instrument Co.B100-50-1010 ס"מ ללא נימה
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter Instrument Co.P-97
קצות פיפטה MicroloaderEppendorf North America Inc.
תמיסת פנול אדוםסיגמא מדעי החייםP0290ריכוז 0.5% 100 מ"ל
פיפטות העברת פלסטיקפישרברנד137119Dבוגר 7.5 מ"ל
נורת טריקאין מתאן סולפונאט (MS-222)Western Chemical, Inc.פישר סיינטיפיק - NC0342409100 גרם
סרום בקר עוברי (FBS)HyClone Laboratories, Inc.פישר סיינטיפיק - SH3007103500 מ"ל
מלח פוספט חוצץ (PBS)Gibco by Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 מ"ל
מלח נתרן הפריןסיגמא-אולדריץ'210615 - 300 יחידות בקבוקונים
40 ומיקרו; מסנן רשת mFalcon Corning Brand352340מארז של 50
טריפן כחולSigma Life ScienceT815420 מ"ל - תמיסה (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 מ"ל
VerapamilSigma Life ScienceV46291 גרם
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 מ"ל
פרופידיום IodideLife TechnologiesP356610 מ"ל
FACSAria ממיין תאי היתוךBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
930001007

מקורות

  1. Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
  2. Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research. Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).
  3. Dooley, K., Zon, L. I. Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).
  4. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  5. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).
  6. Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties. Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).
  7. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, 887-890 (2003).
  8. Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish. J Vis Exp. , e2790(2011).
  9. Martelli, A. M., et al. Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells. Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).
  10. Smith, A. C. H., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).
  11. Blackburn, J. S., et al. Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation. Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).
  12. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
  13. Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
  14. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
  17. Hirschmann-Jax, C., et al. A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).
  18. Komuro, H., et al. Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines. J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).
  19. Moshaver, B., et al. Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia. Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Hoechst 33342T ALLT

מאמרים קשורים