מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו

סיכום

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .

תקציר

Muriomyocytes Murine כבר בשימוש נרחב עבור במבחנה מחקרים של פיזיולוגיה של הלב ואסטרטגיות טיפוליות חדשות. עם זאת, הכנות רב תאיים של cardiomyocytes ניתק אינם נציג של מורכבות במבנה vivo של cardiomyocytes, שאינם myocytes ו מטריקס תאיים, אשר משפיע הן תכונות מכניות אלקטרו electiysiological של הלב. כאן אנו מתארים טכניקה להכין פרוסות חדרתי קיימא של לבבות העכבר הבוגרים עם השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, ולהפגין את התאמתם הקלטות אלקטרו. לאחר כריתה של הלב, החדרים מופרדים מן אטריה, perfused עם Ca ^{2 +} ללא פתרון המכיל 2,3-butanedione monoxime ו מוטבע ב 4% נמוך להמיס agarose לחסום. הבלוק ממוקם על microtome עם להב רוטט, פרוסות רקמות עם עובי של 150-400 מיקרומטר מוכנים לשמור על רטט חופשיתשל הלהב ב 60-70 הרץ והעברת הלהב קדימה לאט ככל האפשר. עובי הפרוסות תלוי ביישום נוסף. פרוסות מאוחסנים פתרון קרח קר של Tyrode עם 0.9 מ"מ Ca ^{2 +} ו 2,3-butanedione monoxime (BDM) במשך 30 דקות. לאחר מכן, פרוסות מועברים 37 מעלות צלזיוס DMEM למשך 30 דקות לשטוף את BDM. פרוסות ניתן להשתמש עבור מחקרים אלקטרופיזי עם אלקטרודות חדות או מערכים אלקטרודה מיקרו, עבור מדידות כוח לנתח את הפונקציה התכווצות או לחקור את האינטראקציה של cardiomyocytes נגזר בתאי גזע המושתל ואת רקמת המארח. לקבלת הקלטות אלקטרודה חדה, פרוסה ממוקמת לתוך צלחת 3 ס"מ תרבות התא על צלחת חימום של מיקרוסקופ הפוך. פרוסת הוא מגורה עם אלקטרודה חד קוטבית, ואת הפוטנציאל פעולה תאיים של cardiomyocytes בתוך הפרוסה נרשמות עם אלקטרודת זכוכית חדה.

מבוא

פרוסות רקמות דקות נעשה שימוש תכוף במדע בסיסי מאז ימאמוט ומקלווין הראה בשנת 1966 כי הפעילות החשמלית של פרוסות המוח נשמרת במבחנה ¹ . מאז, מחקרים אלקטרוכימיים ופרמקולוגיים נערכו על פרוסות מהמוח ² , כבד ³ , ריאה ⁴ ורקמת שריר הלב ^{5 , 6 , 7} . הראשון תיקון מהדק הקלטות בפרוסות חדרית לבבות חולדה בילודים תוארו בשנת 1990 ⁸ , אבל טכניקה זו נפל לתוך שכחה במשך זמן מה. יותר מעשור לאחר מכן, הקבוצה שלנו הקימה שיטה חדשה להכין Murine עובריים ⁹ , neonatal ¹⁰ ומבוגר ¹¹ פרוסות לב. אלה פרוסות רקמות קיימא ניתן להשתמש עבור ניסויים חריפים (פרוסה למבוגריםS יכול להיות מעובד במשך כמה שעות) או ניסויים תרבות לטווח קצר (פרוסות עובריים ו neonatal יכול להיות מעובד במשך כמה ימים). פרוסות להראות in vivo כמו מאפיינים electrophysiological ו עירור הומוגני להתפשט כפי שהוערך על ידי פעולה אלקטרודה חדה פוטנציאל הקלטות מיקרו אלקטרודה מערך ¹¹ . בשל המורפולוגיה "דו מימדי" שלהם, הם מאפשרים גישה ישירה של אלקטרודות הקלטה לכל האזורים של החדר, מה שהופך אותם כלי מעניין עבור חקירות אלקטרופיולוגיות מעלה אפשרויות ניסיוניות חדשות בהשוואה Langendorff-perfused לב שלם. תגובה של סמים של פרוסות לחסיני תעלות יונים כמו verapamil (L-Ca Ca ^{2 +} -channel blocker), lidocain (Na ⁺ -חוסך חוסך), 4-aminopyridine (מתח לא תלוי ב- K ⁺ -channel blocker) ו- linopirdine (KCNQ K ⁺ -חוסך חשמל) ^{9 , 11} התואם השפעות ידועות על cardiomyocytes ניתק. מדידות כוח איזומטרי חשף קשר חיובי תדר כוח והציע בתוקף תפקוד שלם שלם. ממצאים אלה הראו כי פרוסות החדר Murine מתאימים כמודל רקמות במבחנה עבור מחקרים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים. יתר על כן, פרוסות חדר הלב של לב המקבל בשילוב עם הקלטות אלקטרודה חדה הוכיחו להיות כלי מועיל מאוד לאפיין אינטגרציה חשמלית ומכנית כמו גם התבגרות של העובר השתלה ^{12 , 13 , 14} ותאי גזע נגזר ¹⁵ cardiomyocytes.

לסיכום, פרוסות חדרית הם בעלי ערך רב להקים מודל רקמות רב תאיים ויש לראות משלימים cardiomyocytes ניתק Langendorff- perfused לבבותב מחקר קרדיווסקולרי, עם היתרון העיקרי של מתן in vivo כמו מבנה רקמות (בניגוד לתאי ניתק) כמו גם גישה ישירה של טכנולוגיות מדידה כמו הקלטות אלקטרודה חדה לכל אזורי הלב (בניגוד כל ההכנות הלב).

פרוטוקול

טיפול בבעלי חיים צריך להיות תואם את הנחיות הוועדה המקומית לרווחת בעלי חיים ואת הדירקטיבה 2010/63 / EU של הפרלמנט האירופי.

1. הכן פתרונות

1. הכן את הפתרון של Tyrode ללא Ca ^{2 +} (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH ₂ PO ₄ 0.33, MgCl ₂ 1, גלוקוז 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. התאם pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C.
2. הכן פתרון של Tyrode עם Ca ^{2 +} (הרכב ב mM): NaCl 136, KCl 5.4, NaH ₂ PO ₄ 0.33, MgCl ₂ 1, גלוקוז 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl ₂ 0.9. התאמת pH 7.4 עם NaOH ב 4 ° C.
3. הכן 4% נמוך להמיס agarose: לשים 0.6 גרם נמוך להמיס agarose ב 15 מ"ל הפתרון של Tyrode ללא Ca ^{2 +} . מחממים את התערובת בתנור מיקרוגל פעמיים ב 750 W עבור 10-15 s עד agarose הוא מומס. שמור את הפתרון בטמפרטורה קבועה של 37 &# 176; C ומערבבים ברציפות.
4. שמור Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) ללא סרום ב 37 מעלות צלזיוס מבעבע עם carbogen (5% CO ₂ , 95% O ₂ ).

הכן את המיקרוטום

1. הפעל את המיקרוטום.
2. ממלאים את החדר microtome החיצוני עם קרח.
3. ממלאים את החדר microtome פנימי עם פתרון קרח קר של Tyrode ללא Ca ^{2 +} ו oxygenate ברציפות הפתרון עם O ₂ % 100.
4. מניחים להב פלדה לתוך בעל הלהב של microtome.

3. עכבר לב בידוד

1. להזריק 2,500 U הפרין תת עורי. חכה 15 דקות.
2. להקריב את החיה על ידי נקע צוואר הרחם.
3. פתח את החזה על ידי sternotomy.
4. בזהירות לנתח את קרום הלב באמצעות מספריים קטנים מלקחיים # 5.
5. הכנס צינורית לתוך אבי העורקים עולה ו perfuse העורקים הכליליים באתרו עם קר הקרח Tyrode שלפתרון ללא Ca ^{2 +} עד שנותר דם מוסר.
6. בעדינות לכרות את הלב עם מלקחיים ומספריים ולהעביר את הלב בקורפת פתרון Tyrode קר רכוב ללא Ca ^{2 +} .
7. להפריד את אטריה מן החדרים עם אזמל או מספריים.

4. הטבעה של החדרים ב 4% נמוכה להמיס Agarose

1. מניחים את החדרים עם השיא פונה כלפי מעלה עובש agarose ( איור 1 ). מניחים את הסיכה באמצע התבנית בחדר החדר השמאלי.
2. ממלאים את התבנית עם 4% נמוך להמיס agarose ב 37 מעלות צלזיוס, עד הלב מכוסה לחלוטין.
3. מניחים את התבנית על הקרח עבור התקשות מהירה יותר של agarose מניעת צף של הרקמה.
4. הסר את בלוק agarose המכיל את החדרים מן התבנית עם אזמל.
5. הפעל את הבלוק הפוך ולמלא חדרי החדר ואת הפער על הישבן של בלוק agarose, אשר אניS נותרו על ידי סיכה של מולט, עם 4% נמוך להמיס agarose באמצעות מזרק עם מחט 20 G.
6. חתוך את הבלוק agarose עם אזמל כדי להשיג תחתית שטוחה של הבלוק ואת המיקום זקוף של איפקס לב.

5. פרוסת רקמת חדרית

1. תקן את הבלוק על בעל הדגימה של microtome עם טיפה של דבק cyanoacrylate. הפנים את הקודקוד העליון כלפי מעלה.
2. מניחים את בעל הדגימה לתוך החדר הדגימה הפנימית של microtome, אשר מלא Tyrode קר כקרח ללא Ca ^{2 +} . לגמרי לכסות את הבלוק agarose עם הפתרון של Tyrode.
3. הכנת פרוסות ציר קצר בעובי של 150-400 מיקרומטר, בהתאם ליישום נוסף (עבור הקלטות אלקטרודה חדה 150-200 מיקרומטר), לשמור על תדירות הרטט של הלהב ב 60-70 הרץ ולהזיז את הלהב קדימה לאט ככל האפשר .
4. השתמש במברשת עדינה כדי להסיר בזהירות את agarose הנותרים מן הפרוסות.
5. בעדינות transfeR פרוסות עם פיפטה פסטר לתוך הפתרון של Tyrode עם 0.9 מ"מ Ca ^{2 +} סודה עם 100% O ₂ ולאחסן אותם לפחות 30 דקות על הקרח להתאושש מההליך חיתוך.
6. לאחר מכן, לשמור על פרוסות דקות 30 ב DMEM ב 37 מעלות צלזיוס, מוגז עם carbogen, כדי לשטוף את BDM לפני שימוש נוסף.

6. הכנת הגדרת אלקטרודה חדה

1. לחימום מראש, הדלק את כל המכשירים החשמליים 30 דקות לפני שההקלטה מתחילה.
2. שים צלחת 3 ס"מ תרבות התא על צלחת חימום ממוקם על מיקרוסקופ הפוך.
3. מניחים את אלקטרודה טבעת אישית ( איור 2 ) בצלחת לחבר חוטי הארקה של מגבר מראש אלקטרודה גירוי.
4. חבר את צינורות גמישים של מערכת זלוף לצלחת.
5. ממלאים את המאגר של מערכת זלוף עם DMEM, סודה עם carbogen.
6. הפעל את משאבת זלוף ולהגדיר את זלוף raTe עד 2-3 מ"ל / דקה.
7. התאם את הטמפרטורה של DMEM בצלחת ל 37 מעלות צלזיוס על ידי הסדרת תנור החימום ואת צלחת החימום.

7. פעולה הקלטות פוטנציאליות

1. מניחים פרוסה חדרית לתוך צלחת DMEM מלא.
2. בדוק את שלמות המבנית ואת הכדאיות (מבוסס על פונקציה התכווצות) של הרקמה עם מיקרוסקופ הפוך.
3. מלא אלקטרודה ההקלטה זכוכית עם 3 M KCL.
4. ממלאים אלקטרודה גירוי עם DMEM.
5. מניחים את האלקטרודה הקלטה אלקטרודה גירוי על מחזיקי האלקטרודה.
6. מניחים את האלקטרודה גירוי בזהירות על פרוסה ולהפעיל את המאיץ החשמלי. התחל עם תדר גירוי של 1-2 הרץ.
7. העבר את האלקטרודה הקלטה עם micromanipulator מעל עמדת ההקלטה המיועד.
8. לאט לאט להוריד את האלקטרודה הקלטה עד קצה נוגע רקמה.
9. החל דופק חשמלי מלבני קצר דרךהקלטה אלקטרודה לחדור את קרום התא.
10. בזהירות למקם את האלקטרודה הקלטה עד אות יציב מובטחת.
11. התחל להקליט פוטנציאל פעולה.

תוצאות

אוטם שריר הלב מוביל לאובדן כמעט בלתי הפיך של cardiomyocytes. טיפול חלופי נייד באמצעות cardiomyocytes נגזר בתאי גזע עבור התחדשות לב אקסוגני הוא גישה טיפולית מבטיחה. אינטגרציה חשמלית והתבגרות של התאים המושתלים הם חיוניים לבטיחות ויעילות של טיפול החלפת תאים.

כדי להעריך את האינטגרציה ואת ההבשלה, אנו השתילו cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה...

דיון

פרוסות חדרית מאפשרים מחקרים אלקטרו-מכאניים, פרמקולוגיים ומכניים עם שימור במבנה רקמות ויוו וגישה ישירה של טכנולוגיית המדידה לכל אזורי הלב. תכונות פוטנציאליות פעילות פיזיולוגית הוכחו בפרוסות עובריים, ילודים ומבוגרים ^{9 , 10 , 11} . החיוניות של פרוסות, למעט שכבות פני השטח שנפגעו ישירות על ידי הליך חיתוך, אושרה על ידי מכתים חיוניות ⁹ . פעולות פוטנציאל הקלטות בתו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, גרמניה		Microtome עם להב רוטט.
להבי נירוסטה	Campden Instruments, Loughborough, אנגליה	7550-1-SS
Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב	Z627992
מברשת עדינה, למשל גודל 6 (4/32 אינץ')	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
שולחן			מתוצרת עצמית
Molt להטמעת חדרים ב מזרק אגרוז			מתוצרת עצמית
של 1 מ"ל	בקטון, דיקינסון; פרנקלין לייקס, ארה"ב	300013
27 גרם x 3/4 אינץ' מחטים	בראון, מלסונגן, גרמניה	4657705
20 גרם 11/2 אינץ' מחטים	4657519
מספריים קטנים	WPI, סרסוטה, ארה"ב	501263
פינצטה #5, 0.1 x 0.06 מ"מ קצה	WPI, סרסוטה, ארה"ב	500342
גז חמצן (דרגה רפואית O2)	Lindeמינכן, גרמניה
גז קרבוגן (95% O2, 5% CO<>sub2)	Linde, מינכן, גרמניה
NaCl	Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"ב	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, סנט לואיז, ארה"	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	S5761
D(+)-Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	G8270
MgSO4	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיז, ארה"ב	M7506
NaOH	סיגמא-אולדריץ', סנט לואיז, ארה"ב	S8045
דבק ציאנואקרילט	הנקל, Dü סלדורף, גרמניה
Agarose Roth נמס נמוך	, קרלסרוהה, גרמניה	6351.2
Heparin-sodium-25000 כלומר/5 מ"ל	רציופארם, אולם, גרמניה
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), גלוקוז גבוה, GlutaMAX	ThermoScientific, וולת'אם, ארה"ב	10566016
מגבר SEC-10LX	npi אלקטרוני GmbH, Tamm, גרמניה	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, למברכט, גרמניה
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, גרמניה
מיקרומניפולטור בהגדלה נמוכה	Narashige, טוקיו, יפן	Nm-3
הגדלה גבוהה, מיקרומניפולטור תלת צירי	Narashige, טוקיו, יפן	MHW-3
משאבת	זלוף פריסטלטיתמערכות רב ערוציות, רויטלינגן, גרמניה	PPS2
בקר טמפרטורה דו-ערוצי	מערכות רב ערוציות, רויטלינגן, גרמניה	TCO02
ממריץ דופק מרובע	Natus Europe GmbH, Planegg, גרמניה	דשא SD9
נימי זכוכית	WPI, סרסוטה, ארה"ב	1B150F-1

הכנה ב