חומצות מרה תלויי-המעי הדק התחדשות וניגוד משוב של סינתזה של חומצות מרה הכבד חשוב הומאוסטזיס מערכתית ובריאות. במחקר זה, נתאר מודל העכבר עבור כריתה ileal להעריך malabsorption מרה הנוצרות על-ידי ileectomy, overaccumulation, ורעילות במעי העכבר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Ileectomy-induced מרה Overaccumulation במעי העכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
כריתה מעי היא גישה טיפולית משותפת עבור מחלות אנושיות כגון השמנת יתר, מחלות מעי דלקתיות, קרוהן, סרטן המעי הגס, כי לעתים קרובות התוצאות תופעות לוואי של כמו תסמונת המעי הקצר חמורות כולל חומצות מרה שלשולים, התייבשות הפרעות אלקטרוליט, תת ספיגה של מזון. כאן אנו מציגים מודל כריתה ileal מאתר, הנקרא ileectomy, כדי להעריך את רקמת תקשורת ותחזוקה של הומאוסטזיס מערכתית. לאחר כריתה ileal, כלי-דם נטול לצמיתות מעי ספציפיות הורמון האנדוקרינית פיברובלסט גורם גידול 15 (FGF15), אשר משחרר את עיכוב endocrinal של סינתזה של חומצות מרה בכבד. בשילוב עם ייצור מוגבר, ביטל התחדשות של חומצות מרה לאחר הסרת מעי, עכברים נותח סובלים מלח מרה overaccumulation של המעי, משויכת שלשול, התחלואה והתמותה. השימוש הרומן של המודל לניתוח הציגה מחקר זה עשוי לספק תובנות מכניסטית ופונקציונליים ileal שליטה מערכתית רגולציה חילוף החומרים בפיזיולוגיה ומחלות.
מבוא
במחקר ביו-רפואי מודרני, חייתיים גנטי מנוצלים נרחב כדי ללקט תובנות מחלות אנושיות. בפרט, רקמות או פונקציות ייחודיות תא רווח-הפסד של גנים שימשו ללמוד תקנה מולקולרית, כמו גם השפעות ביולוגיות המושרה. למרות החידושים מניפולציה היעד גנים ויוו, קיימות מגבלות מתמשכת. ראשון, הרבה תאים או רקמות ספציפיות מחיקות ישפיעו על איברים מרובים. לדוגמה, מחיקת הגן אפיתל יבטל ביטוי epithelia של רקמות מרובים. עוד יותר, גם אם המחיקה היא מוגבלת לרקמות ספציפיות, השליטה במרחב הוא לעיתים רחוקות ריאלי. לדוגמה, בטישו כמו המעי, מקטעים נפרדים לבצע פונקציות ספציפיות מאוד זה לא יכול להיות מניפולציות עם דיוק ויוו. במצבים אלה, נחשב כריתה של הרקמות המכילות ג'ין בגישה לימוד יעיל יותר כדי לקבוע את המשמעות מכניסטית ופונקציונליים של רקמות תקשורת.
Ileectomy היא בעיקר בשימוש חולי קרוהן ומחלות דלקתיות המערבים את2, 1,מעי דיסטלי3. מעי בדרך כלל מייצר מספר הורמונים אחסון אנרגיה כמו פיברובלסט גורם גידול 15/19 (FGF15/19), פפטיד YY (PYY) ופפטיד דמוי גלוקגון 1/2 (GLP1/2); הורמונים אלה תפקיד חשוב האנדוקרינית ומקומיים רבים תפקודים ביולוגיים4,5,6. בין אלה ההורמונים, זוהה FGF15 מעכב האנדוקרינית חזקים של סינתזה של חומצות מרה בכבד. ברגע נספג מחדש לתוך ileal enterocytes חומצות מרה להפעיל את הקולטן farnesoid X קולטן הגרעין (FXR) כדי לעורר את הביטוי Fgf15 , אשר מוביל לאחר מכן משוב עיכוב של סינתזה של חומצות מרה בכבד 7. במחקר שנערך לאחרונה, הצגנו את המודל ileectomy העכבר ללימוד הגורם kruppel דמוי ileal 15 (KLF15) -Fgf15 איתות ציר המסדירה ייצור חומצות מרה היממה הכבד 8. והכי חשוב, הצגנו משפחה הרומן, הגורמים כמו kruppel, במיוחד KLF15, חומצות מרה לביולוגיה. על סמך מחקרים תפקודית כולל ניתוח ileectomy, קבענו את סינתזה חומצות מרה upregulates KLF15 באמצעות מנגנון שאינו ולשננו עקיף. לבסוף, ileal KLF15 גם מזוהה המתקן הראשון שלילי אנדוגני של Fgf15.
הקטעים המעי היורד proximal לאזורים דיסטלי אחראים ספיגת חומרים מזינים שונים. מעי היא קטע מרכזי אחראי חומצות מרה וויטמין B12 (VB12) הקליטה 9. מחקר קודם המועסקים דגם העכבר של הבטן proximal כריתה ללמוד תסמונת המעי הקצר; שונים באורכים כריתה, דיאטות וסוגי תפירה הוצעו כדי לשמור על קצב של האופטימלית הישרדות לאחר הניתוח 10. יתר על כן, סקירה עדכנית יותר מציין שכי כריתה ileal בדרך כלל מתבטא במחלות חמורות יותר מאשר שאר כריתות קטע במערכת העיכול (GI) בגלל יכולת אדפטיבית ירד מ בדרכי הנותרים 11. נושא זה צבר אינטנסיבית האינטרסים של קבוצות מחקר בסיסי וקליני, ואילו ההבנה של שחזור וגישות טיפוליות יעיל הן עדיין מוגבל.
שלשול חומצות מרה היא תוצאה של חוסר איזון של חומצות מרה הומאוסטזיס enterohepatic 12,של מחזור13. זה יכול להיות תוצאה של כריתה ileal, מחלות במערכת העיכול או תוצאה של תת ספיגה של חומצות מרה אידיופטית. יותר מ- 80% מהחולים נמצאו להציג עם שלשול לאחר שעברו כריתה ileal 14. Ileectomy יש את הפוטנציאל להיות מודל ניתוח חשוב עבור החקירה של חומצות מרה שלשול. במחקר זה, סדרה של כריתות ileal לספק הערכה הדרגתי של מחסור FGF15, כמו גם תת ספיגה של מלח מרה מעיים, overaccumulation נזקים רעילים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בעלי חיים פרוטוקול נבדקה, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד שימוש Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת, נערך על פי המדריך הלאומית המכונים לבריאות (NIH) טיפול ושימוש של חיות מעבדה (המהדורה השמינית, 2011). עכברים היו מורדמים על ידי שיטות תואם ההנחיות אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) המתת חסד של בעלי חיים (2013 מהדורה). עכברים בשבוע 8-16 בן זכר, C57BL/6J, שימשו פרוטוקול זה. עכברים שוכנו בסביבה כהה/אור מחזור 12 h.
1. הכנה מראש פעיל
- עכברים העברת לכלוב נקי 24 שעות לפני ההליך. לאפשר חיות גישה חופשית למים. החלף צ'או מזון מזון רך (תוסף תזונה ג'ל) 4-6 שעות לפני הניתוח כדי להפחית את התוכן של המעי הדק לניתוח.
- לעקר כל מכשירי ניתוח והכן החומרים כירורגי סטרילי חד-פעמיים. לנקות את אזור הניתוח והחרוט האף הרדמה עם אתנול 70%-
- להגדיר מיקרוסקופ לנתיחה, מאדה הרדמה איזופלוריין, כלי נגינה, מבוקרי טמפרטורה בעלי חיים כירורגי שולחן קטן לתחזוקה טמפרטורת הגוף. לארגן כלי נגינה, תפרים, מזרקים במיקום עבור גישה חופשית במהלך הניתוח.
- להגדיר את מקור אור כדי לספק מספיק אור עבור האזור כירורגי.
- הכנת מלח סטרילית 0.9% במזרק מ לניקוי המעיים והבטן.
2. Ileectomy והשקה
- Anesthetize עכברים עם איזופלוריין (2-3%) בחדר דגירה בעלי חיים קטנים. לקבוע ההרדמה נאותה בטכניקה הבוהן קמצוץ בעוד החיה נמצאת באיזופלוריין.
- להסיר שיער בטן על-ידי החלת מוצרים להסרת שיער, לנגב את השיער משם באמצעות ניתוח ספוגים תוך שמירה על הרדמה. הצב את העכבר על טמפרטורה מבוקרת בעלי חיים כירורגי שולחן קטן ( איור 1 א') כדי לשמור על טמפרטורת הגוף ב- 37 מעלות צלזיוס. שמור על הרדמה עם איזופלוריין (1-2%) דרך facemask. לטיפול בעיניים עכבר עם משחה עינית.
- לנקות את העור באמצעות povidone יוד ו- 70% אלכוהול ולכסות את האזור הכירורגי של הבטן עם גזה סטרילית כירורגי ( איור 1 B).
- עושים חתך בבטן קו האמצע באמצעות אזמל כירורגי לאחר הרדמה בתוקף. להשתמש המוליך שקצהו כותנה כדי להגן על המעי ולמשוך העכבר שריר הבטן עם רטרקטורים מלא לפתוח ולחשוף את חלל הבטן ( איור 1 ג).
- אתר המעי. החל מהמעי, הזז בזהירות את מעי מחוברים וחלק מעי צם מתוך חלל הבטן ( איור 1 D).
הערה: המעי האטום ניתן לזהות בקלות בגלל הגודל שלה גדול גם לאחר צום. - מאתרים ומפסיקים את הענף העליון של עורק מצע המעי העליון סופריור 7-0 בתפר משי כדי occlude ויישם על קטע ileal כדי להוציא את הדם. צבע ileal משתנה מורוד כהה לאחר מצדו. (E - F איור 1).
- בהתאם מטרת הניסוי, באמצעות מספריים, בלו ולהסיר את 50% או 90% של מעי.
הערה: עבור ניתוח דמה, אל תבצע את מצדו סופריור עורק מצע המעי העליון ואל תסיר מעי. - סומק לומן שני הקצוות ileal עם סליין 0.9%.
הערה: כמו מעי ללא פגע הנותרים עדיין מקבל הספקת דם נורמלי של עורק מצע המעי העליון מעולה, כמות קטנה של דם יבוצע ריקון בתהליך. זה גם מציין כי אספקת הדם הקצוות ileal נורמלי ומבטיחה אין איסכמיה במהלך ההליך השקה ( איור 1 G)- - לאתר את mesenteries בצד שני הקצוות ileal. יישר את mesenteries, תפר את הקצוות ileal יחד באמצעות 8-0 בתפר ( איור 1 G - H).
- תפר הצד contralateral של מעי לשמור מעי anastomosed באופן טבעי ( איור 1 אני).
- תפר הצד העליון והתחתון בין התפרים המקורי שני ביסודיות צירוף השני ileal הקצוות יחד ( איור 1 J).
- מאשרים כי קיים אין נזילה מתוך אתר השקה לאחר סיום ההליך הפתולוגיים שלושה שלבים ( איור 1 G-אני). להחזיר את המעי האטום של המעי הדק לתוך חלל הבטן למיקום האנטומי המקורי. לשטוף את אזור הניתוח עם מלחית 0.9% באמצעות מחט בוטה. ( איור 1 K).
- לסגור את החתך של השכבה שריר הבטן 6-0 בתפר. יישר את החתך בעור בטן באמצעות מלקחיים, תפר בעור בטן כדי להקל על ריפוי הפצע אופטימלית ( איור 1 L).
3. טיפול לאחר הניתוח
- העברת הניתוח שלאחר עכברים נמרץ להתאוששות. בית אותם בתוך כלוב נייר-מצעים על כרית החימום טמפרטורה מבוקרת כדי להמשיך את ההתאוששות לאחר הניתוח בן לילה. מספקים עכברים עם מזון רך בנוסף מקבלים מזון ומים.
- לנהל הבופרנורפין (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג) עם הזרקה תת-עוריים כל ה 8-12 עבור כאבים.
הערה: המתת חסד עכברים ב- CO 2 אם חולה קשות. - -מובילים, להקריב עכברים באמצעות מנת יתר איזופלוריין ו הקציר דגימות לפי הצורך (סעיף 4).
4. הערכה של Ileectomy-induced מרה Overaccumulation
- שוקל ומנתחים את העכברים יום אחד לאחר כריתה של 0% (דמה), 50% או 90% של מעי.
- להסיר GI בדרכי, שוקל אותה. לחשב את המשקל GI ליחס משקל הגוף כדי להעריך את חומרת תת ספיגה של מלח מרה, overaccumulation.
- להעביר את ספינלי GI לתוך צינורות חרוט 15 מ"ל וחותכים אותם למקטעים קצרים באמצעות מספריים. לאחר חיתוך, צנטריפוגה ב 3000 g x עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (GI נוזל המכיל מלחי מרה) צינור נקי.
- למדוד את הנפח הכולל ומשקל של נוזל GI ולחשב את משקל נוזל GI בדרכי יחס המשקל להעריך עוד יותר overaccumulation מרה ב- GI בדרכי.
- לקבוע את הסכום הכולל מרה ב תגובת שיקוע על ידי חומצות מרה assay כפי שמתואר הפניה 8.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נהלי ileectomy מוצגים באיור1. השלב הראשון כולל הכנת בעור בטן העכבר, ביצוע חתך בבטן ושימוש רטרקטורים לחשוף באופן מלא את המעי (איור 1A-C). בשלב הבא, המעי העכבר היה ממוקם (איור 1D); נתון כי הגודל והצורה שלה לעשות את זה נקודת ציון הניתנות לזיהוי בקלות. המעי האטום, מעי, וחלק מעי צם דיסטלי היו חשופים ומוסר מן חלל הבטן (איור 1D...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
על מנת לבצע ileectomy מוצלח, עורק מצע המעי העליון מעולה חייב להיות מאתרים מראש כדי לחסום את אספקת הדם קטע resecting. קטע ileal איסכמי יהפוך סגול כהה לאחר מצדו. בטח קטע ileal תור הודעות ' ואז resected לחלוטין. הספקת דם נורמלי והקפדה על יתרת הקצוות. זה חיוני כדי למנוע דימום והסרת פסולים, אשר יכול בקלות לגרום כשל כירורגי עקב נמק איסכמי לאחר תפירת. במהלך ההשקה, חשוב להצטרף יחד את הקצוות ileal מיקומם האנטומי טבעי. מצע המעי נחשב את ציון הכי אמין עבור התפר הראשוני להימנע המופע פוטנציאלי של הקצוות מעוות. בעקבות התפר השני על הצד ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אין לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי קרן פיטרסון טום ולהעניק NIH R01-HL119780 (Jain, ח"כ).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מיקרוסקופ דיסקציה | אולימפוס | SZ61 | לניתוח |
| בקר טמפרטורת בעלי חיים | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | לבקרת טמפרטורת הגוף |
| וופורייזר הרדמה איזופלורן | VetEquip | 911104 | להרדמה |
| מלקחיים לדיסקציה | כלי מדע עדינים בע"מ | 11274-20 | לניתוחים |
| מספריים | כלי מדע עדינים בע"מ | 14084-08 | לניתוח |
| מחזיק מחט | רובוז מכשירים כירורגיים ושות ' | RS-7882 | לניתוח |
| להב מיקרו סכינים-מחט | פישר סיינטיפיק | 10318-14 | לניתוח |
| 6-0 תפר מונופילמנט | Ethicon | 1698G | לסגירת עור הבטן |
| 7-0 תפר משי | Ethicon | 766G | לקשירה |
| 8-0 תפר מונופילמנט | Ethicon | 1714G | לספוגי אנסטומוזה |
| כירורגיים | Dynarex Corp. | 3333 | לניתוח |
| אפליקטורים קטנים עם קצה כותנה | פישר סיינטיפיק | 23-400-118 | לכירורגיה |
| Isoflurane | Piramal Healthcare Limited | 66794-013-25 | להרדמה |
| בופרנורפין הידרוכלוריד | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | 12496-0757-1 | לשיכוך כאבים |
| 0.9% נתרן כלורי הזרקה | B. Braun Medical Inc. | 0264-7800-10 | לשטיפה/הזרקה |
| תמיסת הכנה ליוד Povidone | Dynarex Corp. | 1413 | להכנת העור |
| Puralube משחה וטרינרית | Dechra מוצרים וטרינריים | 17033-211-38 | להגנה על העיניים |
| קרם מסיר שיער | Church & דווייט ושות', בע"מ | להכנת העור | |
| יחידת טיפול נמרץ | ThermoCare | FW-1 | להתאוששות לאחר ניתוח |
| DietGel recovery | ClearH2O | 72-06-5022 | להתאוששות לאחר ניתוח |
| ערכת רקמות שומן וסיביות Aurum Total RNA | Bio-Rad | 7326830 | לבידוד RNA |
| iScript שעתוק הפוך סופרמיקס עבור RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | עבור בדיקת שעתוק הפוך |
| TaqMan מהיר מתקדם מאסטר מיקס | יישומי ביוסיסטמס/Life Technologies | 4444965 | לניתוח QPCR |
| ערכת בדיקת חומצת מרה כוללת Genzyme | Diagnostic | DZ042A-K01 | לבדיקת חומצת מרה |
| C57BL/6J | ג'קסון |
מקורות
- McLeod, R. S. Surgery for inflammatory bowel diseases. Dig Dis. 21, 168-179 (2003).
- Hancock, L., Windsor, A. C., Mortensen, N. J. Inflammatory bowel disease: the view of the surgeon. Colorectal Dis. 8, 10-14 (2006).
- Polle, S. W., Bemelman, W. A. Surgery insight: minimally invasive surgery for IBD. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol. 4, 324-335 (2007).
- Fon Tacer, K., et al. Research resource: Comprehensive expression atlas of the fibroblast growth factor system in adult mouse. Mol Endocrinol. 24, 2050-2064 (2010).
- Pournaras, D. J., et al. The role of bile after Roux-en-Y gastric bypass in promoting weight loss and improving glycaemic control. Endocrinology. 153, 3613-3619 (2012).
- Spreckley, E., Murphy, K. G. The L-Cell in Nutritional Sensing and the Regulation of Appetite. Front Nutr. 2, 23(2015).
- Inagaki, T., et al. Fibroblast growth factor 15 functions as an enterohepatic signal to regulate bile acid homeostasis. Cell Metab. 2, 217-225 (2005).
- Han, S., et al. Circadian control of bile acid synthesis by a KLF15-Fgf15 axis. Nat Commun. 6, 7231(2015).
- Christl, S. U., Scheppach, W. Metabolic consequences of total colectomy. Scand J Gastroenterol Suppl. 222, 20-24 (1997).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. J Am Coll Surg. 183, 441-449 (1996).
- Tappenden, K. A. Pathophysiology of short bowel syndrome: considerations of resected and residual anatomy. J Parenter Enteral Nutr. 38, 14-22 (2014).
- Camilleri, M. Bile Acid diarrhea: prevalence, pathogenesis, and therapy. Gut Liver. 9, 332-339 (2015).
- Camilleri, M. Advances in understanding of bile acid diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 8, 49-61 (2014).
- Mottacki, N., Simren, M., Bajor, A. Review article: bile acid diarrhoea - pathogenesis, diagnosis and management. Aliment Pharmacol Ther. 43, 884-898 (2016).
- Rao, A., et al. The organic solute transporter alpha-beta, Ostalpha-Ostbeta, is essential for intestinal bile acid transport and homeostasis. Proc Natl Acad Sci. 105, 3891-3896 (2008).
- Hofmann, A. F., Poley, J. R. Cholestyramine treatment of diarrhea associated with ileal resection. N Engl J Med. 281, 397-402 (1969).
- Kir, S., et al. FGF19 as a postprandial, insulin-independent activator of hepatic protein and glycogen synthesis. Science. 331, 1621-1624 (2011).
- Kuipers, F., Bloks, V. W., Groen, A. K. Beyond intestinal soap--bile acids in metabolic control. Nat Rev Endocrinol. 10, 488-498 (2014).
- Buchman, A. L., Scolapio, J., Fryer, J. AGA technical review on short bowel syndrome and intestinal transplantation. Gastroenterology. 124, 1111-1134 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
