DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם Ambystoma מקסיקניום

סיכום

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

תקציר

טכניקות זלוף שימשו במשך מאות שנים כדי להמחיש את זרימת הרקמות. Axolotl (Ambystoma mexicanum) הוא מין של סלמנדרה שהתגלתה כמודל חיוני ללימודי התחדשות. מעט ידוע על איך מתרחשת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות אצל בעלי חיים אלו. כאן אנו מדווחים על שיטה פשוטה להדמיה של כלי הדם ב axolotl באמצעות זלוף של 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI הוא צבע lbophilic carbocyanine כי מוסיף לתוך קרום פלזמה של תאים האנדותל באופן מיידי. זלוף נעשה באמצעות משאבת peristaltic כך DiI מזין את זרימת הדם דרך אבי העורקים. במהלך זלוף, צבע זורם דרך כלי הדם של axolotl ומשלב לתוך bilayer השומנים של תאים אנדותל כלי הדם על קשר. הליך זלוף לוקח בערך שעה אחת עבור axolotl שמונה אינץ '. מיד לאחר זלוף wiDiI, axolotl ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ה- DiI פולט אור בטווח כתום אדום כאשר מתרגש עם מסנן פלואורסצנטי ירוק. הליך זה זלוף Di ניתן להשתמש כדי לדמיין את המבנה של כלי הדם של axolotls או להדגים דפוסים של רה-וסקולריזציה ברקמות התחדשות.

מבוא

ויזואליזציה של כלי הדם משחק תפקיד חיוני בהבנת המבנה והתפקוד של אורגניזמים על פני מינים רבים. החל מהמאה ^ה -16 עם לאונרדו דה וינצ'י, נחקרו מודלים וייצוגים גרפיים של המחזור. באמצעות שעווה ותבניות גומי, רקמות היו perfused כדי ליצור מודלים תלת מימדיים של כלי הדם, אשר אפשרה את המחקר של אורגנוזה ו פתוגנזה ^{1 , 2} . שרפים ושעווה היו בצבע עם צבעים כגון הודו דיו או אדום carmine כדי לאפשר להדמיה קלה שלהם ^{1 , 2} . עם זאת, טכניקות אלה גרמו לבעיות רבות בגלל צמיגות גבוהה שלהם מנעו זלוף מלא של הרקמה של עניין ¹ . ככל שהשדה נעשה מתוחכם יותר, השימוש במיקרוסקופים קונפוקליים ואלקטרוניים נכנס לפעולה, והעביר את הטכנולוגיות של הזלוף Ues במרחק של תבניות יצוק לעבר נוזלים נוזלי של כלי הדם, שחלקם מותר זלוף הדמיה של כלי הדם מבלי להרוס את הרקמה הראשונית ³ . DiI, צבע קרבוזינין פלואורסצנטי, הוא כתם אחד כזה המאפשר זלוף של בעלי חיים ללא נזק לרקמות כלי הדם.

צבעים Carbocyanine הם צבעים lipophilic המשלבים לתוך קרום התא על המגע. צבעים אלה מאפשרים מכתים קל מיידית של תאים אנדותל כלי דם, אשר לאחר מכן ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ confocal ניאון. DiI נע דרך דיפוזיה לרוחב בקרום השומנים של תאים, כפי שמוצג תיוג ואת מעקב של נוירונים ⁴ . מבחינה כימית, שתי שרשראות אלקיל של DiI לתת לצבוע את זיקה גבוהה של קרום התא, בעוד שני טבעות מצומדות מ fluorochrome אשר אחראי על פליטת אור אדום אדום כאשר נרגש על ידי מסנני אור פלואורסצנטי ירוק> 4. DiI כבר מנוצל יכולות רבות, כולל תיוג מוצלח של קרום פלזמה וגם אנטרוגרד ו תיוג מדרדר נוירונים ^{5 , 6} . DiI בעבר נעשה שימוש בפרוטוקולים זלוף תוך הדמיה vasculature של עכברים ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) הם סלמנדרס שחיים אך ורק אגמים מליחים ליד מקסיקו סיטי, מקסיקו. בעלי חיים אלה הפכו למודל חשוב להבנת תהליכי התחדשות, שכן הם יכולים ליצור מחדש את הגפיים המלאות, הזנב (כולל כבל עצב), חלקים של הלב ואיברים פנימיים אחרים, וחלקים בעין כמבוגרים ^{8 , 9} . בנוסף, עם היישום האחרון של כלים גנטיים ב axolotls, תובנה חסרת תקדים של מולקולות ותאים המניעים תהליכים אלה כעת אפשרי ⁸ . את regen מוצלחהקצבה של איבר שלם דורש תהליך רחב של רה-וסקולריזציה, אשר עשוי לשחק תפקיד משמעותי התחדשות מעבר פשוט את הפונקציות המסורתיות של כלי הדם במתן חמצן וחומרים מזינים. הבנת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות רקמות היא הכרחית. כלי הדם Axolotl בעבר דמיינו באמצעות הודו דיו, בעוד התוצאות היו מסקרנות, תהליך זה לא היה revisited בעשורים הבאים ¹⁰ . ביקשנו להתאים פרוטוקול Diusion זלוף שפותחה לשימוש יונקים כדי לאפשר זלוף מלא ויזואליזציה של כלי הדם axolotl ⁷ . פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו בהצלחה perfuse ולאחר מכן לדמיין את זרימת axolotl עם טכניקה מכתים DiI. הליך זה יאפשר הדמיה מדויקת של כלי הדם הפטנט ברקמות הומיאוסטיות, כמו גם ברקמות התחדשות, ומספק שיטה חדשה visualisatioN וניתוח של תהליך רה-וסקולריזציה ב axolotl.

פרוטוקול

כל הניסויים axolotl בוצע בהתאם בית החולים בריגהם של נשים (BWH) מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. הגדרת ניסוי perfusion

1. מניחים axolotl מבוגר במיכל פלסטיק מלא עם פתרון 0.1% tricaine (MS222) במשך 15-20 דקות או עד הרדים לחלוטין. ודא כי מיכל מלא פתרון tricaine מספיק כך axolotl הוא שקוע לחלוטין.
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. ב BWH, axolotl נחשב להרדים לחלוטין כאשר הוא נכשל מבחן רגל קמצוץ, כלומר אין תנועה רפלקסיבית כאשר כף הרגל הוא סחוט בעדינות.
   זהירות: למרות tricaine הוא חומר הרדמה המשמש במיוחד עבור אורגניזמים מימיים, מגע ישיר העור עם פתרון tricaine יש להימנע.
2. הגדרת תחנת זלוף axolotl.
   1. מניחים אתמשטח סופג על משטח שטוח, שטוח עם הצד סופג כלפי מעלה.
   2. חותכים חור במסגרת קצף פוליסטירן כי הוא בגודל המתאים ואת הצורה עבור axolotl הרדים להניח במצב שכיבה. מניחים את המסגרת על משטח סופג.
      הערה: ניתן למקם מגבות נייר נוספות מיד מתחת למסגרת לקבלת ספיגה נוספת.
   3. טען את המשאבה peristaltic עם צינורות זלוף. הגדר את המשאבה בקצב זרימה של 0.7 מ"ל / דקה, זורם בכיוון השעון.
   4. הפוך את הפתרון מדולל עם 0.7x PBS ו 5% גלוקוז בתערובת 1: 4.
   5. מערבבים 10 מ"ל של פתרון diluent עם 200 μL של פתרון המניות DiI בצינור 50 מ"ל חרוטי. כיפה ומערבבים על ידי היפוך. כיסוי זה צינור עם נייר אלומיניום לסכל כדי להגן על פתרון העבודה מחשיפה לאור.
      הערה: כרכים צריך להיות שונה בהתאם לגודל של axolotl באופן יחסי. ערכים אלה הם עבור axolotl כ 15 ס"מ (אורך snout-to-tail). אנימלים בגודל זה אולי לא הגיעו לבגרות מינית מלאה ולכן המין החיה לא ייקבע בשלב זה.
   6. ממלאים צינור חרוטי 50 מ"ל עם 0.7x PBS.
      הערה: PBS ישמש עבור תחול לולאה exxanguination axolotl.
   7. צרף את המחט 27-מד פר כדי סוף היציאה של צינורות זלוף. מקפלים את כנפי פרפר אחד על השני ומניחים בעמדה מהדק.
   8. מניחים את הקצה החופשי של צינורות זלוף בצינור 50 מ"ל חרוטי מלא 0.7x PBS ולהפעיל את משאבת זלוף עד צינורות כולו מלא פתרון. להשהות את המשאבה פעם את כל צינורות מלא PBS.
      הערה: ודא צינורות ללא בועות אוויר בכל עת, כמו אלה יגרום האוויר emboli ב axolotl ולמנוע זלוף מלא.
   9. מניחים מגבת נייר בצורת axolotl בצורת מסגרת קצף פוליסטירן. באמצעות פיפטה העברה, להשרות את המגבת עם פתרון tricaine.
      הערה: חותכים ריבוע קטן באמצע מגירת הנייראל כדי לאפשר ניקוז של נוזלים במהלך הליך זלוף.
   10. מניחים את שסתום axolotl הרדים על מגבת נייר בתוך מסגרת קצף פוליסטירן.

2. פתיחת חזה האקסולוט

1. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה של axolotl, ממש מתחת לקו הכתפיים. לַעֲקוֹר.
2. השתמש אזמל לבצע חתך קטן שבו העור כבר משך.
3. הסר פיסת עור מרובעת על החזה כדי לחשוף שתי צלחות סחוס.
   1. הסר את העור כדי לפתוח חלון מעל חלל בית החזה גדול מספיק כדי לראות בבירור את הלב כ 5 מ"מ של אבי העורקים הסתעפות של הלב.
4. בזהירות לקרוע את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים או מספריים סגורים על מנת למנוע חיתוך כל כלי הדם העיקריים.
5. הרם כל צלחת הסחוס בנפרד באמצעות מלקחיים ובלו אותם WIth את המספריים כירורגית.
6. בזהירות לצבוט את קרום הלב עם מלקחיים, למשוך למעלה, לנקב אותו באמצעות מספריים כירורגית; חתך זה צריך להיות רק מספיק עמוק כדי לנקב את קרום הלב דק מאוד צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר הסרת קרום הלב. הקפד לא לחתוך את הלב.
7. הסר בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים.
   הערה: באמצעות פיפטה העברה, מעת לעת לשטוף את חלל החזה ואת הזימים עם פתרון tricaine לשמור על האזור ברור ולשמור על axolotl הרדים.

3. זלוף של Axolotl

1. מניחים את עמדת מהדק עם מחט פרפר טעון ליד מסגרת קצף פוליסטירן, כך זרוע של מהדק יכול בקלות להיות מניפולציה כדי להכניס את המחט לתוך אבי העורקים axolotl. הצבע את קצה המחט לכיוון היבט מקורי של החיה במהלך ההכנסה ולשמור על המחט מקבילים אבי העורקים, כדי למנוע ניקוב זה דרך opצד חיובי.
2. הפעל את המשאבה peristaltic. 0.7x PBS צריך להמשיך לזרום דרך צינורות.
3. הכנס את המחט לתוך אבי העורקים.
   1. החלק את מלקחיים מתחת לקשת אבי העורקים ולמשוך מעט כדי לאפשר גישה קלה.
   2. לתמרן את שילוב מחט המחט כך המחט פועל לאורך אורך של אבי העורקים, מצביע לכיוון הראש. הכנס את המחט תוך שימוש במלקחיים עבור תמיכה מאחורי אבי העורקים.
      הערה: המחט צריך להיות מוכנס עמוק מספיק לתוך אבי העורקים כדי להבטיח שזה לא יחליק החוצה במהלך זלוף. זה יכול להיות על 5 מ"מ עבור 15 ס"מ axolotl. ודא כי המחט היא באופן מושלם בקנה אחד עם אבי העורקים, כדי למנוע לנקב מוחלט של כלי השיט. באמצעות ו-נקבים יכול לגרום דימום מסיבי ולהפחית את שיעורי ההצלחה של זלוף. ההכנסה מוצלחת ניתן לאשר על ידי הגדלה גלוי של אטריה של הלב.
4. מהר laterate אטריום אחד עם sciSsors ולאפשר דם להתרוקן.
   1. שטוף עם פתרון tricaine כדי למנוע הצטברות דם היווצרות קריש בחלל החזה.
5. Perfuse את axolotl עם כ 20-30 מ"ל של PBS. הבהמה צריכה להשתנות מ ורוד בהיר בצבע לבן על זלוף מוצלח.
6. להשהות את המשאבה peristaltic ולהזיז את הקצה החופשי של צינורות לתוך צינור 15 מ"ל של פתרון DiI. הפעל מחדש את המשאבה, היזהר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בצינור.
7. Perfuse את axolotl עם מלאי העבודה כולו של DiI.
   הערה: ב זלוף מוצלח, axolotl עם שינוי צבע ורוד בהיר של DiI. זה יהיה בולט ביותר הזימים.
8. להשהות את המשאבה לאחר זלוף עם DiI הושלם במקום סוף חינם של צינורות לתוך פתרון Paraformaldehyde 4% (PFA) לתקן את הרקמה. הפעל מחדש את המשאבה ואת perfuse לפחות 10 מ"ל של PFA.
   זהירות: PFA הוא רעיל צריך להיות מטופלים ו dispoSed של כראוי. כפפות וכוסות בטיחות צריך להיות משוחק, ופתרונות צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע קטר. זלוף של axolotl עם PFA לתקן את הרקמה תוצאות המוות של החיה.

4. סיום זלוף ההכנה ויזואליזציה

1. עצור את המשאבה peristaltic ולהסיר את המחט מן האאורטה axolotl.
2. מניחים את axolotl על צלחת פלסטיק.
   הערה: שימוש של חצי צלחת פטרי גדול עובד היטב ומאפשר לשפוך כמות קטנה של Tricaine או PBS על axolotl כדי לשמור על העור רטוב ולשפר את איכות הדמיה.
3. להשליך את כל החומרים בשימוש בפחים פסולת המתאימים. נקי כלים כירורגיים עם אתנול 70%, לחטא באמצעות מעקר זכוכית חרוז בין בעלי חיים, וכן לעקר ידי מעוקר בעקבות ההליך. צנרת צינורות עם פתרון PBS ולאחר מכן לנקז, יבש לחלוטין, ולאחסן לשימוש נוסף.

5. ויזואליזציה של Axolotl perfused

1. מניחים את axolotl תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי.
2. כבה את האורות כמו הדמיה של כלי מוכתם DiI הוא מונע על ידי האור.
3. השתמש ירוק הקרינה הקרינה פליטה קוביית ( למשל ET-CY3) עם מיקרוסקופ confocal לדמיין את כלי הדם של axolotl. השתמש אור עירור 545 ננומטר.
   הערה: כדי להשיג תמונה באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בפרמטרים הבאים: חשיפה ל -1.1 s, רווח של 1x, רוויה של 1.0, הגדלה של 2X.

תוצאות

עם מכתים DiI, vasculature של axolotl ניתן דמיינו בקלות. כלי דם של בעלי חיים perfused עם צבע lipophilic נראים מיד תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. איור 1-1-1.5 הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזלוף. לאחר זלוף עם צבע ורוד בהיר, axolotl perfused בהצלחה יופיע ורוד. באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ confocal אדום פליטה של ​​רשת כלי הדם יופיע. מכתים DiI מתרחשת בכל רקמות הגוף כאשר זלוף מוצלח, כולל הזנ...

דיון

ויזואליזציה של כלי הדם של axolotl ניתן להשיג בהצלחה באמצעות זלוף עם צבע lbophilic carbocyanine, DiI. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור זלוף של axolotl עם DiI באמצעות משאבת peristaltic. כמו כן, אנו מראים את ההדמיה שלאחר מכן של vasculature axolotl באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. פרוטוקול זה היה הסתגלות של המכרסמים DiI זלוף פרוטוקול לראות Li et al. ⁷ , אולם ההבדלים העיקריים בין מכרסם לבין axolotl נדרש עדכון של הפרוטוקול כדי להתאים את המוד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
משאבה פריסטלטית	מרשל סיינטיפיק	RD-RP1
	מעבדת אקסלון & צינורות ואקום		436901705 גודל S1A
27 גרם מחט פרפר	EXELint מוצרים רפואיים	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
			מזוקקים
HCl	AmericanBio	7647-01-0
גלוקוז	תרמו-פישר	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- טטרמתיל-אינדוקרבוציאנין פרכלוראט	סיגמא אולדריץ'	468495
אתנול (100% נפח/נפח)	סיגמא אולדריץ'	64-17-5
קדמות כירורגיות	Medline	MDG0748741
		קצף פוליסטירן	כל ריבוע קצף פוליסטירן עם מספריים כירורגיות בצורת אקסולוטל  חתוך
מספריים כירורגיות	Medline	DYND04025
אזמל	Medline	MDS15210
תחתון סופג	Avacare רפואי	PKUFSx
מגבות
פיפטה העברה חד פעמית סטנדרטית	Fisherbrand	50216954
מעמד מהדק	Adafruit	291
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט	Sigma Aldrich	E10521	טריקאין אבקת
אקסולוטל
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
מיכלי			בגודל משתנה המתאים לאקסולוטל
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica מיקרוסקופ Leica Leica		M165 FC
ET-CY3 מסנן פלורסנט	Leica	M205FA/M165FC
MS-222