מאמר שיטה

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

11.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55751

⸱

24 בינואר 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

נתאר כאן עבור microinjection במוח מכרסמים המשתמשת קוורץ מחטים פרוטוקול. מחטים אלה לא לייצר נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח משלוח אמין אפילו באזורים עמוקים. יתר על כן, הם יכולים להיות מותאם לצרכי מחקר מאת עיצובים מותאמים אישית, ניתן להשתמש מחדש.

תקציר

Microinjections שימשו במשך זמן רב למסירה של סמים או רעלים בתוך אזורים ספציפיים במוח, לאחרונה, הם השתמשו כדי לספק מוצרי טיפול גנטי או התא. למרבה הצער, טכניקות microinjection הנוכחית להשתמש במחטים פלדה או זכוכית כי הם שיוצרת מסיבות רבות: בפרט, מחטים פלדה עלול לגרום נזק לרקמות, זכוכית מחטים אולי אעקם כאשר יורדת עמוק לתוך המוח, חסר באזור היעד. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול להכין ולהשתמש מחטים קוורץ המשלבות מספר תכונות שימושיות. מחטים אלה אינם מייצרים נזק לרקמות לזיהוי ולהבטיח, להיות נוקשה מאוד, משלוח אמין באזור המוח הרצוי אפילו בעת שימוש בקואורדינטות עמוק. יתר על כן, זה אפשרי להתאים אישית את העיצוב של המחט על ידי עשיית חורים מרובים לקוטר הרצוי. חורים מרובים להקל ההזרקה של כמויות גדולות של פתרון בתוך שטח גדול יותר, ואילו חורים גדולים להקל על ההזרקה של תאים. בנוסף, מחטים קוורץ אלה יכולים להיות מנקים את מחדש בשימוש, כך ההליך הופך להיות חסכונית.

מבוא

Microinjections שימשו במשך זמן רב למסירה של חומרים פעילים פרמקולוגית כדי לווסת את פעילות. עצבית באזורים מסוימים במוח. בנוסף, הם השתמשו כדי להזריק רעלים בקרבת אוכלוסיות עצביים מסוים, לחקות אירועים ניווניות האופיינית של מחלות מסוימות, לדוגמה 6-הידרוקסי-דופמין במערכת דופמין nigrostriatal לחקות מחלת פרקינסון 1 , 2 או את saporin IgG immunotoxin 192 את הנגע שימוש במערכת3. לאחרונה, הליכים microinjection שימשו להעברת נגיפי שתלי וקטורים או תאים לטיפול גנטי או תא של המוח ניסיוני הפרעות4,5.

הסוג הקלאסי של מחטים המועסקים במחקרים אלה עשוי פלדת אל-חלד. אמנם קל ומעשי לשימוש, מחטים פלדה יש מספר בעיות6: הם גדולים יחסית, עלול לגרום נזק לרקמות, עם דליפה של מחסום הדם - מוח והפעלה של האסטרוציטים; יתר על כן, הם עשויים לייצר גלעון של רקמת המוח מקבל לתוך המחט יצירת מכשול או אפילו לגמרי הימנעות זרימה של הפתרון הרצוי. לאחרונה, מחטים זכוכית מוכן אד הוק של נימים הוכנסו להשתמש7,8. אלה אינם גורמים ההפעלה נזק ולא אסטרוציט לרקמות משמעותי, אבל יחסית גמישה, אולי אעקם הציג מבנים עמוק, להפחית את הדיוק של לוקליזציה (תצפיות אישי).

לכן יש צורך להפחית ככל האפשר נזק (במיוחד בעת ביצוע ניסויים כדי לרפא את הנזק) תוך הגדלת דיוק הפארמצבטית (קרי, להבטיח כי כל פתרון מועבר ולהבטיח לוקליזציה הנכון). יתר על כן, רצוי להשתמש עיצובים שונים מחט כדי להבטיח הפצה אופטימלית של הפתרון מוזרק, באזורי המוח גיאומטריות שונות. במאמר זה, אנו מתארים לפרוטוקול להכין ולהשתמש קוורץ מחטים microinjections במוח מכרסמים. בשל נקודת התכה גבוהה, נימים קוורץ לא יכול להיות עשה של פולר המקובלת, ולכן לא השתמשו בעבר כדי להפיק מחטים. קוורץ, עם זאת, מציע כמה יתרונות חשובים לעומת זכוכית, בפרט גבוהה קשיחות ו- break ההתנגדות9. בגלל קשיחות שלהם, קוורץ מחטים מתאימים באופן אידיאלי עבור זריקות לתוך אזורי המוח הגחון. בגלל שלהם עמידות גבוהה בפני שבירה הם שניתן למדל כדי לכלול חורים מרובים, קבלת עיצובים שיוכיחו היעיל ביותר גם כאשר פילוח אזורי המוח עם לסימולציה10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים ניסיוני אושרו על ידי הוועדה האתית אוניברסיטת פרארה לניסויים בבעלי חיים על ידי משרד הבריאות איטלקית. יגיעו (חיה מחקר: דיווח ב- Vivo ניסויים11) הנחיות הופעלו.

1. הכנת קוורץ מחטים

  1. לנקות ולחטא את הנימים קוורץ (ראה טבלה של חומרים) על-ידי הצבתם עבור 5 דקות במים מזוקקים, 5 דקות אתנול 99% ו- 5 דקות בדיאתיל אתר.
  2. השאר נימים מתחת למכסה המנוע לפחות שעה לתת להם להתייבש לחלוטין.
  3. הכינו את המחטים באמצעות של פולר לייזר בהתאם לפרמטרים לאפשר הייצור של מחט מספיק זמן, מספיק דק, בהתאם לצרכים בודדים.
    הערה: אנו משתמשים של פולר לייזר (ראה טבלה של חומרים). השתמש בתוכנית שתי שורות עבור משיכת. השורה הראשונה משתמשת מתח גבוה, אורך הסריקה הגדולים (תואם לערך חוטים), אין כוח מושך. שילוב זה של פרמטרים מוביל אל כור ההיתוך של החלק הגדול ביותר של נימי עם מהירות סיומת הנמוך ביותר, המאפשרות עיצוב מחט ארוכה עם גודל פנימי/חיצוני גדול, מופחתת shank. בדרך זו, המחט שומר על עמידות מכנית גבוהה בעלת קוטר פנימי רחב המאפשר המעבר של תאי גזע או נגיפים ללא סתימת. מהירות ועיכוב של הקו התוכנית צריך להפסיק את הסיומת נימי לפני הטיפ הופך להיות קטן מדי ולא ארוכה, חסר מכני נדרש ומאפייני הצורה. השורה השניה של התוכנית מושך מבוצע באופן אוטומטי, ברגע הקוורץ מתקררת (5 s). הפרמטרים של כוח, הלהט, משיכת כוח פונקציונליים לחתוך טיפ עם נשק תלול, הימנעות ההפרדה של שתי מחטים עם קרע עצה לאורכה עצה אפשרית הקצר. באופן שגרתי, עם הציוד שלנו אנו משתמשים הבאות: (א) קו 1 = כוח 990, נימה 5, מהירות 130, עיכוב 110, אינץ למשוך 0; (ב) קו 2 = כוח 970 פילמנט 3, מהירות 0, עיכוב 70, למשוך 0.
  4. ! תניח את המחטים בצלחת פטרי בעבר לנקות עם אתנול 70%.
    1. מכסים את סרט פרפין פלסטיק.
  5. חותכים את נימי הדם המיקרו-בניתוח.
    1. בהפעלה של, תן את לייזר להפעיל תהליך autocalibration כדי לוודא כוח ואנרגיה נמסר. לאחר מכן הגדר את פרמטרי חיתוך.
      הערה: אנו משתמשים של מיקרו-בניתוח (ראה טבלה של חומרים) והפרמטרים הבאים: לייזר כוח פולס אנרגיה (63 µJ), קוטר אלומת לייזר של 20% של הצמצם המקסימלי (צמצם מקסימלי: 1.0 מיקרומטר), ומהירות חיתוך של 10% מהירות מירבית (מקסימלי מהירות: 30 מיקרומטר/s).
    2. בחוזקה לתקן את המחט על השולחן מיקרוסקופ ומקם את קצהו במרכז של מסך המחשב.
    3. בשורת התפריטים, לחץ על סמל העיפרון ולהשתמש בו כדי לצייר סימן לחיתוך לייזר של המחט.
      הערה: החתך צריך להיות בזווית של 45 מעלות ביחס השטח המחט.
    4. הפונקציה בר לצד, בחר את הדגל המכיל לחצן "התחל CUT" כדי לאפשר את הלייזר לחתוך את המקום בעבר מסומנים.
    5. אם יש צורך, חתך צד hole(s) חוזרת בהליכים המתוארים תחת 1.5.2-3; יש צורך למקם מחדש את המחט (איור 1).
  6. פוסט-חותכים ניקוי.
    1. לחבר את המחט משאבה void דרך צינור פלסטיק.
    2. הפעל את המשאבה ולאחר להגדיר באופן ידני את קצב זרימה קדימה במהירות בינונית (3 µL/דקה).
    3. האחות האתנול 99% הראשון ולאחר מכן את מים מזוקקים להסרת זיהומים עקב חיתוך.
    4. האחות האתנול 99% שוב כדי להקל על ייבוש.
      הערה: כל שלב צריך להימשך לפחות 3 דקות.
  7. אחסן את המחטים צלחת פטרי המכוסה כראוי עד היום של הניתוח.
  8. מחטים ניתן להשתמש מחדש; בסוף הניסוי, לנקות עם אקונומיקה, אתנול כדי להסיר את שאריות רקמת פתרון ואפשרי. להשלים את הניקוי, תניח את המחטים בתוך צנצנת אחסון micropipette עם קצה מצביע כלפי מטה, למלא את הצנצנת במים מזוקקים עד הטיפים מכוסים, מרתיחים 1.5 דקות להסיר את כל שאריות של רקמות, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול.

2. הליך

  1. בעקבות ההוראות שסופקו על-ידי המדריך למשתמש משאבה, בחר בתפריט ' הגדרות ' כדי לכייל את המשאבה על פי הנפח/הקוטר של המזרק microinjection ולהגדיר את קצב הזרימה ב- µL 0.3/דקה.
  2. ממלאים מזרק 10-mL (המצוידים מחט בוטה (למשל, המילטון מחט, 30 גרם), צינור טפלון קצר) במים סטריליים ולהשתמש בו כדי למלא את המזרק microinjection (לאחר כך הוסר בזהירות את הבוכנה) ואת הזריקה קיט חלקים הרכבה על המשאבה microinjection ידנית (MMP).
    הערה: ערכת MMP משמש בצורה מאובטחת לטעון את המחט בתוך המסגרת סטיאוטטי (איור 2). הערכה כוללת: אבובים טפלון, סכינים סטריליים-כדי-אבובים מצמד, מחזיק פיפטה, אטמים עבור פיפטות עם קטרים שונים החיצוני.
  3. לחבר את המחט ערכת MMP.
    1. ריקון מים בכל המערכת דרך המזרק 10-mL, לבדוק אם המים שיוצא המחט.
      הערה: הקפד להסיר את כל בועות האוויר בתוך המערכת על ידי המדרגות מילוי חוזר.
  4. נתק את המזרק 10-mL המזרק microinjection בעת לאט דוחף את הבוכנה כדי להשאיר טיפת מים בחלק העליון של המזרק microinjection. הכנס את הבוכנה במזרק microinjection.
  5. להתחבר המזרק microinjection המשאבה ולהגדיר את קצב הזרימה ב- µL 0.3/דקה.
    הערה: המתן עד שיתפנה טיפה דולף מהקצה של המחט, אז תעזבו את זה בשביל עוד 3 דקות.
  6. להעביר את הזרימה ב- 0.1 µL/דקה ולהתחיל בהליך ניתוח. המשאבה צריכה להיות שוטף בעת ביצוע הניתוח.
    הערה: עבור הניסויים דיווחו במאמר זה, אנו משתמשים חולדות ספראג Dawley הגברי של 300 גרם (3 חודשים של גיל). עם זאת, הנוהל הוא החלים על מינים אחרים, עכברים בפרט.
  7. לגרום הרדמה כללית באמצעות שיטה שאושרו על-ידי תקנות מקומיות.
    הערה: אנו משתמשים שילוב של הזרקה בקרום הבטן (i.p.) של 85 מ"ג/ק"ג קטמין ו- 8 מ ג/ק ג חריגות השירותים הווטרינריים עבור 20-50 דקות של הרדמה. חשוב כי צובט זנב ו/או הבוהן משמשים על מנת להבטיח שהחיה היא הרגעה. רמת בסיסיים החיוניים והרדמה הם העריכו לפני הניתוח מתחיל ולעקוב אחר כל 10 דקות תוך כדי ביצוע הניתוח. טמפרטורת הגוף החי נשמר קבוע לפני, במהלך ואחרי ניתוחים באמצעות מים מחדש במחזור כרית החימום. חיות מנוטרים עד החלים לחלוטין (למשל הם ישר ועם אמבולטורי). בנוסף, בעלי החיים מקבלים משככי כאבים (טרמדול, 5 – 7 מ"ג/ק"ג i.p.) וכאב לאחר הניתוח כל 24 שעות במשך שלושה ימים.
    1. לגלח את הראש של החיה ולהתכונן כראוי באתר כירורגית ניתוח אספטי. לבצע קרצוף בשני שלבים עם יוד מבוססי פתרון (Betadine) ואחריו 70% אתנול. יתר על כן, כדי לשמור על asepsis, לעטוף את האתר כירורגית עם תלוי כירורגי (וידאו הושמט למטרות הדגמה).
  8. מקמו את החולדה במסגרת stereotaxic מים מחדש במחזור חימום שמיכה. כדי לספק הקלה בכאב נוספים, באתר של ניתוח להחיל פתרון לידוקאין 0.5% (לא יעלה על 7 מ"ג/ק"ג). מראש לעקר כל מכשירי ניתוח באמצעות immerging את הציוד בחדר או 2% גלוטראלדהיד בתוספת 7.05% פנול (Sporodicin או Cidex) חרוז קר מעקר או נוזל חיטוי ואחריו שטיפה עם מים סטרילי או תמיסת מלח. יש לבצע חיטוי אפילו בין הליכים. לבצע חתך האורך על הגולגולת באמצעות אזמל מעוקר. להיות עדין כדי למנוע דימום יתר. לפתוח את הקרקפת באמצעות מרית שטוחה ולהחיל כירורגיים על המשק של העור כדי להשאיר אותה פתוחה. מאוד בעדינות, ניתוק קרום העצם כדי לחשוף את bregma ואת האזור של הגולגולת שדרכם יתווסף את המחט.
  9. לטעון את הזרוע על המסגרת stereotaxic (בעוד הזרם הוא מתמשך) ולהעביר את קצה המחט בדיוק מעל bregma, תשומת לב לא לשבור את קצהו. ביאור את הקואורדינטות גישה antero-אחוריים ו medio-הצד של bregma, לתרגם נקודות הציון הרצוי. מונחה על ידי stereomicroscope, להנמיך את המחט עד את קצהו כמעט נוגעת הגולגולת, מארק קידוח ספוט לאחר שהקים קצת את הזרוע stereotaxic
  10. תרגיל (לקדוח עצה Ø: 0.8 מ"מ; מהירות התרגיל: 1,000 סל ד) הגולגולת על המקום המסומן. חייבים להקפיד לא לחדור את השכבה הקשה של המוח במהלך ההליכים קידוח. במהלך קידוח, לטפטף תמיסת מלח סטריליים כדי למנוע נזק לעצם נמק.
  11. לחתוך חתיכה קטנה של פרפין פלסטיק הסרט ומניחים אותו על הגולגולת. שימוש של pipet µL 10, גורם טיפה של הפתרון להזריק על הסרט פלסטיק פרפין. לעצור את המשאבה, מעט לאחזר הסוחר של המשאבה, ליצור בועת האוויר קצת נימי על-ידי מושך בעדינות את הבוכנה של המזרק microinjection.
  12. . תנמיכי את הזרועות סטיאוטטי עד קצה המחט מגיע הירידה לצייר את הדגימה על ידי משיכת (לאט לאט) את הבוכנה של המזרק microinjection, הימנעות כל היווצרות בועה. להחליף את הסוחר משאבת בקשר עם הבוכנה, תדליק את המשאבה בספיקה של 0.3 לדקה µL לחכות עד היווצרות של טיפה (מספר דקות) לפני שתמשיך לשלב הבא.
    הערה: דוגמה לניסוי הנוכחי, נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) היה חדורים ב סטריאטום (AP: +1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0), בהיפוקמפוס הגבי (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; במ מ דורא), µL 2/האתר. כדי להקל על ההשוואה בין הזרקת שתי השיטות, כל אזור המוח היה חדורים באמצעות מחט קוורץ באונה אחת, עצה 26 גרם בוטה או מחט נירוסטה מסגרת משופעת-עצה 30 G ביד השניה.
  13. הנמך את זרימת µL 0.1/min, ניק השכבה הקשה של המוח עם מחט שיקוע-טיפ פלדת אל-חלד, הורידו לאט את היד סטיאוטטי על הגרזן dorso-הגחוני /, הזנת על רקמת המוח. כאשר במיקום הרצוי, פתח למטה מ מ 0.1 נוספים, לעצור את המשאבה, להעלות את הזרוע סטיאוטטי על ידי 0.1 מ מ, הפעל שוב את המשאבה-זרימת µL 0.3/min.
    הערה: הסיבה כדי לשמור על זרימה איטית תוך כדי הנמכת המחט היא להבטיח לחץ חיובי זה מונע חדירה של קטעים קטנים של רקמות במחט עצמה. אירוע כזה להכשיל הטיפ, ופוגע המסירה של פתרון. מאז קצב הזרימה איטית מאוד אמנם מנמיך את המחט ואת המהירות של הנמכת כ-10 מ"מ/s, זה מרמז כי הכמויות של פתרון שנותרו לאורך המסלול המחט הם זניחים בהשוואה לאלו מוזרק באתר היעד. ייתכן להימנע אמצעי זהירות בעת שימוש מחטים עם חורים בצד.
  14. להתחיל את הטיימר ולא לחכות את הזמן הדרוש בהתאם לנפח הרצוי כדי להזריק (לדוגמה, 6 דקות 40 s אם הזרקת 2 µL). לפקח על התנועה בועה בזמן הזרקת. בסוף, עוצרים את המשאבה, להמתין 5 דקות לפני לאט מאחזר את המחט. כאשר המחט קוורץ מופק לחלוטין, הפעל את המשאבה שוב ולבדוק היווצרות טיפה בקצה המחט.
  15. לאטום את הפתח פני הגולגולת עם שעווה לאיטום, להסיר את הקליפים hemostatic, תפר את הקרקפת, להרגיע את האזור סביב הפצע עם גלידה אנטיביוטיקה (למשל, נאוספורין) ולחזור החיה לכלוב הביתה.
    הערה: בעקבות פרוטוקול המתת חסד אושרו על ידי ועדת אתית מוסדית, הניסויים המתוארים במאמר זה, בעלי חיים היו עמוקות מרדימים עם זריקה i.p. של קטמין 43 מ"ג/ק"ג ו- 7 מ"ג/ק"ג חריגות השירותים הווטרינריים, ערף. המוח הוסרו, סיומת בפורמלין במשך 48 שעות, פרפין מוטבע. קטעים הילתית (8 מיקרומטר) של המוח נחתכו באמצעות מיקרוטום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השווינו את הנזק הנגרם על ידי microinjection ישירה היפוקמפוס הגבי עכברוש, סטריאטום באמצעות מחט קוורץ (עצה קוטר חיצוני מיקרומטר 60; אחד 20 מיקרומטר קוטר חור בצד; סוג C, איור 1) לעומת קלאסי שני, 26 גרם הקהה, קצוות מסגרת משופעת 30 גרם מחטים פלדת אל-חלד. מטרה זו, הזרקנו 2 µL של חנה המבר בפינה השמאלית ולחצו שמאל היפוקמפוס הגבי, סטריאטום באמצעות בהתאמה של הקוורץ ו מחט פלדה, 48 שעות לאחר ההזרקה, הערכנו נזק לרקמות באמצעות ההכתמה Hematoxylin-אאוזין (HE). בחרנו נקודת זמ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בטכניקה המתוארת במאמר זה ממלא את הצרכים המתוארים מבוא לאופטימיזציה microinjections המבוצעות למטרות שונות12. המחטים המתוארים כאן להפחית נזק לרמה מינימלית, בעיקרו של דבר נסתרים; -סטיה עם מחטים זכוכית (כי הם נוטים לכופף), קוורץ מחטים נוקשה, להבטיח התאמה אמין של האזור הרצוי במוח אפילו בקואורדינטות עמוק. יתר על כן, החור בצד מבטיחה מסירת הפתרון גם אם החור עצה נחסם במהלך הכניסה בתוך רקמת המוח.

מגבלות וחלופות. בשל נקודת התכה גבוהה, קוורץ נימים ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו היא נתמכה על ידי מענק של הקהילה האירופית [פרוייקט האיחוד FP7-אנשים-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נימי קוורץSutter Instruments, נובאטו, קליפורניה ארה"בQ100-50-10ללא נימה
חולץSutterP2000
צנצנת אחסון מיקרופיפטהWorld Precision Instruments (WPI), סרסוטה, פלורידה, ארה"בE210
לייזר מיקרו-דיסקטורLeica Microsystems, Wetzlar, גרמניהLMD6500
מזרקהמילטוןHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, גרמניה19138-U
משאבת מיקרואינפוזיהUniventor, Zejtun, מלטהדגם 864
ערכת משאבת מיקרו-הזרקה ידניתWPIפריט#: ערכת MMP-KITהמאפשרת הרכבה מאובטחת של מיקרופיפטות על המסגרת הסטריאוטקטית
מקדחה מדויקתProxxon28510 MicroMot 50/Eפיר הנעה מיסב כדורי עם מהירות משתנה
Artficial Cerebral נוזל עמוד השדרהTocris3525
מחטים 26 גרם קהות ו-30 גרם שיפועהמילטון26 גרם קהה: 19138-U
30 גרם שיפוע: 20757
MicrotomeLeica, גרמניהLEICA RM212RT

מקורות

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים