מאמר שיטה

ההשפעות של טסיות דם עשיר Allogeneic פלזמה (PRP) על תהליך ריפוי של אכילס משרטוטי הגידים של חולדות: תיאור מתודולוגיים

8.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55759

⸱

19 במרץ 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההערכה של ריפוי גידים אצל חולדות זה מוזרק עם טסיות allogeneic פלזמה עשיר (PRP) או תמיסת מלח לאחר הסרת חלק גיד אכילס. ההתקדמות של גיד ריפוי מוערך במספר נקודות זמן באמצעות סוגים שונים של ניתוחים.

תקציר

מאמר זה מתאר את ההליכים ניסיוני המשמש כדי לבחון אם PRP יכול בהחלט להשפיע על גיד ריפוי. ישנם 4 שלבים עיקריים לעקוב: לגרום פגיעה בגיד אכילס; להכין PRP ולהזריק אותו (או תמיסת מלח); להסיר את הגיד; ולבצע הערכות biomechanical מולקולרית, היסטולוגית. בכל שלב, כל הנהלים והשיטות מתוארים בפירוט, אז הם יכולים להיות מועתק בקלות.

אכילס הגידים כבר בניתוח משרטוטי (הסרת קטע ארוך 5 מ מ). לאחר מכן, PRP או תמיסת הוזרק ללמוד אם PRP יש השפעה חיובית על הריפוי של הגיד. שלוש קבוצות של בעלי חיים 40 (סה"כ 120 חולדות השתמשו במחקר זה) היו מחולק 2 קבוצות: קבוצה קבוצה הזרקת PRP ובקרת זריקה מלוחים. חולדות הוקרבו בהגברת נקודות זמן (קבוצה א': 5 ימים; קבוצה ב': 15 ימים; קבוצה ג': 30 ימים), גידים הוסרו. הגידים 90 עברה בדיקות ביו-מכני לפני ביצוע ניתוח transcriptomic, הגידים הנותרים 30 הוגשו ניתוח היסטולוגית.

מבוא

קרישה, תהליכים דלקתיים התפקידים אפנון חסינות של טסיות הינם ידועים1. לאחרונה, זה הוכח שיש להם גם מאפיינים מבריא2,3. אכן, ציטוקינים וצמיחה גורמים שונים (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-שאני, דבורה שחר) שפורסמו על ידי טסיות בתקופת degranulation. אלה גורמי גדילה לקדם אנגיוגנזה, רקמות ו פצע ריפוי (עצם, עור, שריר, גיד)2. צריך שתוציאו דם עצמיים מייצרת טסית דם עשיר פלזמה (PRP אשר מכיל ריכוזים טסיות גבוהה בהתאם לשיטת הבידוד) (בין 3 10 פעמים דם ריכוזים בסיסית). אכן, טכניקות שונות של הכנת PRP אינו יכול לספק מוצר סופי זהים. עד עכשיו, כבר אין הסכמה כללית הבינלאומי בנושא זה. בסך הכל, PRP יכול להיות אופציה טיפולית אטרקטיבי לטיפול בבעיות כרוניות השלד והשרירים, כגון tendinopathy, מחלת החיתולית הכפית, דלקת מפרקים ניוונית, התביעה4. הוא שימש בפעם הראשונה תוך ניתוח אוראלי implantology4 כדי לשפר ולהאיץ את עצם ריפוי לאחר הצבת שתל דנטלי. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ישימה המאפשר רכישת PRP עבור ניסויים בבעלי חיים4.

מאז נגעים של הגידים הם נצפו לעתים קרובות ספורטאים ועובדי גופנית, שיפור את תהליך הריפוי, ובכך להקטין את זמן ההחלמה הם עניין רב5. שיטות טיפול חדשות זה מפתחים לעיתים קרובות כרוך השימוש של גורמי גדילה, הממשל של PRP דרך פשוטה ולא פולשנית לספק שילוב של גורמי גדילה אנדוגני4.

מספר מחקרים במבחנה או בעל חיים הראו כי המינהל של פלסמה המכילים רמה גבוהה של טסיות דם, על ידי שחרור מתווכים ביולוגי, יכול לעורר תיקון גיד, רצועה על ידי שחרור מתווכים ביולוגי6 ,7,8,9. יתר על כן, מחקרים אחרים הראו כי PRP יכול לעורר סוג III סינתזה קולגן גיד ואני תאים9,10,11. גם הוצע כי PRP יכול להקטין את ההפעלה של מטריקס metalloproteinases (MMPs), לכן להפחית את ההשפלה של המטריקס. התאים המעורבים בתהליך דלקת יכול לייצר MMP-9, אשר ממלא תפקיד רקמות (הפיזיולוגיות, פיפטות) הנגרמת על ידי דלקת12.

על סמך מידע זה, שיערנו זריקה אחת PRP לתוך הגידים אכילס המחולקת למקטעים של חולדות יכול לשפר את תהליך ההחלמה, חוזק מכני רב, הרקמה לתיקון. זה נבדק על ידי מדידת המאפיינים ביו-מכני של הגידים הריפוי במהלך תהליך ההחלמה, על ידי ביצוע ניתוחים היסטולוגית ומולקולרית להעריך קולגן שיפוץ בתוך הרקמה החדשה. מטרת המחקר הייתה לבחון אם זריקה אחת של allogeneic PRP להשפיע ריפוי של הגידים אכילס המחולקת למקטעים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

טיפוח וטיפול של החיות בוצעו על פי המדריך על הטיפול, השימוש של חיות מעבדה שהוכנו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסמו על ידי מוסדות הלאומית לבריאות (ארה"ב). החקיקה האירופית ולאומיים עקבו בזהירות.

1. הכנה בעלי חיים

  1. השתמש 132 2 - חודש בן זכר ספראג-Dawley חולדות שקילה 320-450 גרם (120 חולדות לניסויים) וחולדות 12 עבור לקיחת דמים, איור 1. בהתבסס על Dell13, חולדות 15 עבור כל קבוצה הייתה מספיק כוח של 0.8 (80% הסיכוי למצוא מובהקות סטטיסטית, אם קיים האפקט שצוין).
  2. בית כל העכברושים בכלובים קלאסית בתנאים בידוד במתקן קונבנציונאלי מצוידים עם תחנת המשתנים. לעורר הרבייה בארון תקשורת IVC (כלוב בנפרד מאוורר), חולדות SPF (חינם ספציפי פתוגן) הנרכשים באופן ספציפי.
  3. להשתמש בתנאי דיור הבאים: טמפרטורת מ 19-24 מעלות צלזיוס; לחות יחסית: 40-60%; אוורור: תדירות של התחדשות אוויר: 10-15 לכל h; מחזור/כהה: 12 h - 12 שעות.
  4. לעקר את כל הציוד caging ולהשתמש מצעים לקרינה. מערכתית ליישם את הכלוב העשרה על-ידי הצבת מגשי קרטון סטרילי ומגבות בתוך הכלובים.
  5. לאפשר גישה לאזור בתנאים מוגבלים: המעבדה המעיל, מסכה, כפפות, נעליים, שיער המצנפת החדשה בכניסה.
  6. לבצע את המושבה לניטור תקינות בלוטת הזקיף בבעלי חיים שוכנו על מצעים מלוכלך על בסיס שנתי, על פי המלצות14 Felasa למתקנים קונבנציונליים. לשמור על ארבעה או חמישה בעלי חיים לכל כלוב, עם המתאים מוקרן דיאטה ולספק acidified מים ad libitum. צג מדי יום.
  7. העברת חולדות נבחר להתערבות כירורגית ב סינון הכלובים המובילים לחדרי ניתוח 2 h לפני הניתוח.

2. ניתוח

  1. הכנת מכשירי הניתוח: בסדר מספריים, מלחציים, שני תופסנים, בעל מחט. במהלך כל ההליכים, ללבוש כפפות, מסיכה, ברדס, חלוק מעבדה.
  2. באופן אקראי לחלק את החולדות לשתי קבוצות (PRP ותמיסת מלח).
  3. קח את החולדה מהכלוב, שוקל אותה. להשתמש בתגיות האוזן ממוספרים כדי לזהות את החולדות. כדי להימנע לייבוש של העיניים, במקום טיפות מים על הקרנית.
  4. עזים ומתנגד העכברוש intraperitoneally עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף). כדי לאשר ההרדמה, במקום החיות תחת ניטור cardio-הנשימה של סימון עבור כל רפלקסים בעין.
  5. מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously (0.01-0.05 מ"ג/ק"ג כל h 8-12) באזור הצוואר כמשכך כאבים.
  6. לגלח את האיבר הינד השמאלי עם מכונת גילוח חשמלית, לחטא אותה עם 3 לסירוגין קרצוף של iso-betadine/אלכוהול (מדולל 1:10) פתרון ולמקם את החולדה על משטח חם (20 ° C) תחת מיקרוסקופ ויבתר. מניחים את החולדה על עגלות לרוחב עם הרגל צריכה לעבור ניתוח במצב מעולה. להחזיק את הכף עם מלקחיים כירורגיים.
  7. בעזרת המספריים, עושים חתך לרוחב קטן (20-25 מ מ) של העור סביב גיד אכילס השמאלי, ומנתחים fascia באמצעות מספריים בסדר לחשוף את גיד אכילס מורכבים (איור 2 א).
  8. הסר את הגיד plantaris עם זוג מספריים (איור 2b).
  9. חתך גיד אכילס ערמוני 5 מ מ מקורב אל הכניסה calcaneal שלה ולהסיר חלק ארוך 5 מ מ באמצעות מספריים. תפר לא הגיד (איור 2 c, 2d).
  10. תפר fascia ולאחר מכן העור עם חוט resorbable עושה עם תפר overjet (בתפר רצוף). התפרים monofilament יכול לשמש גם כדי למנוע הפתילה מן העור לתוך החתך כירורגי.
  11. למקם את החולדה תחת מנורת חימום עד ער ולאחר מכן מקם את החולדה בחזרה בכלוב (58, 38 ס מ) (Nota bene: אין קיבעון שהוטלה עליו).

3. PRP הכנה15

  1. עזים ומתנגד העכברושים תורם עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן. PRP ההזרקה מבוצעת 2 h במשככי ללא re-הרדמה.
  2. מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously כמשכך כאבים.
  3. לאסוף דם מלא (20 מ לכל עכברוש, הדימום הסופי) על ידי ניקוב הלב לתוך צינורות סטרילי המכיל 3.2% buffered סודיום ציטרט (מ' 0.109, נוגד קרישה). ואז המתת חסד העכברוש על ידי זריקה intracardiac.
  4. כדי להשיג PRP, centrifuge הדם למשך 10 דקות ב 150 x g ובטמפרטורת החדר. שלב צנטריפוגה זו מהירות נמוכה הראשוני מניב בשני שלבים ברורים: שלב נמוך בהיקף של תאי דם אדומים (RBCs) מהווה כ- 80-90% מהנפח הכולל ולאחר שלב העליון המורכב של טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) (בדרך כלל 10-20% של הדם דוגמה).
  5. בעדינות לאסוף את PRP (שלב העליון) צינור פלסטיק משני באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק. כמו הממשק בין PRP תאי דם אדומים הוא מאוד רפוי, לא פיפטה קרוב מדי לממשק. כשמטפלים נכון, מזהם RBCs ב PRP צריך להיות מתחת 0.05 x 10 תאים3 / µL. להיפטר השלב התחתון הנותרים של הצינור אוסף דם ראשיים.
  6. לקבוע את עוצמת הקול של PRP שנאספו ולמדוד את ספירת טסיות על מנתח המטולוגיה. ערכים אלה דרושים עבור חישובים להתאים את ריכוז טסיות בשלב הבא. ספירת תאי הדם גם שימושי להעריך את פוטנציאל זיהום עם RBCs, ריכוז WBCs. טסיות ב PRP בשלב זה הוא בדרך כלל 1-1.5 x106/µL.
  7. לבצע צנטריפוגה השני של PRP 10 דקות-1000 g x ובטמפרטורת החדר. שלב זה צנטריפוגה במהירות גבוהה מניבה גלולה טסיות רופף, של תגובת שיקוע המורכב של טסית דם מסכן עצמיים פלזמה (PPP). שימוש בערכים נקבע בשלב 3.6, לחשב את עוצמת הקול של תגובת שיקוע כדי להיות מושלך לרכז את PRP ולהגיע ריכוז סופי של 2.5 x106/µL.
  8. בעדינות לאסוף את תגובת שיקוע (PPP) צינור פלסטיק משני באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק, עוזב כשני שלישים של הכרך האחרון שחושבו בצעד 3.7. כמו בגדר הוא רופף, כמות משמעותית של טסיות אובדת כאשר PPP נמחקת, ולכן פוטנציאל להפחית את הריכוז הסופי הרצוי.
  9. בזהירות resuspend בגדר טסיות עם תגובת שיקוע הנותרים על-ידי pipetting חוזרות עדינה. למדוד את ספירת טסיות-PRP המרוכז הזה. אם יש צורך, להוסיף נפח מתאים של PPP עצמיים להגיע ריכוז היעד הסופי.
    הערה: השתמש את PRP תוך 3 שעות של הכנה.
  10. להוסיף µL 50 CaCl2 (11 mEq 10 מ ל) לכל מיליליטר PRP כדי להפעיל את טסיות הדם.
  11. מזריקים µL 50 PRP טריים או תמיסת עם מחט 21G ישירות לתוך האתר מבצע sutured בערך 1 h לאחר ההכנה. במהלך תקופה זו, תמשיך PRP בטמפרטורת החדר.
  12. לפקח התאוששות פונקציונליות של החולדות מקרוב במהלך הימים לאחר הניתוח ואת לפני ההסרה של גיד אכילס.

4. הסרה של גיד אכילס ובדיקות Biomechanical16

  1. 5, 15 או 30 ימים מאוחר יותר5, שוקל את החולדה. לאחר מכן, עזים ומתנגד עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן.
  2. מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously כמשכך כאבים. הסר הגיד לפני הקרבת החיה כדי לשמור על התנאים הפיזיולוגיים זמן רב ככל האפשר.
  3. לגלח את האיבר השמאלי הינד ולמקם את החולדה תחת מיקרוסקופ ויבתר. מניחים את החולדה על עגלות לרוחב עם הרגל צריכה לעבור ניתוח במצב מעולה. החזק את פאו עם האצבעות.
  4. עושים חתך קטן (10 מ מ) באתר המבצע הקודם ולהרחיב עד suralis התלת חשוף.
  5. כדי להסיר את גיד אכילס הריפוי, לחתוך עצם calcaneal ערמוני 5-10 מ מ דיסטלי לקיצוץ גיד אכילס שלה. ואז לנתח חלק suralis התלת, שמחובר גיד אכילס (איור 3b). החלק שריר צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים את הקפאה-הלסת (איור 3 c-d). למקם את הדגימה באופן מיידי הקפאה-הלסת בעזרת מלקחיים (איור 3e).
  6. לאחר הסרת המתחם גיד-שריר-עצם, המתת חסד העכברוש באמצעות הזרקת intracardiac מסקלין (200 מ"ג/ק"ג). לאשר מוות על-ידי הערכת העדר של קצב הלב ואת הנשימה למשך 15 דקות.
  7. למקם את יחידת שריר בלסת העליונה (איור 3e), לסגור או למקם אותו אנכית אוניברסלי בודקים מכונת (106.2 kN, איור 3a). אז תתקן את העצם בין התפסים התחתון של המכונה (איור 3f).
  8. להוסיף חנקן נוזלי לתוך שניהם בעיטור הלסת העליונה כדי להקפיא את השריר, כך היא בסדר גודל נוקשה מאשר הגיד, אינו עיוות במהלך הבחינה מתיחה.
  9. כאשר אזור הקפואים מגיע לגבול מהדק מתכת, להתחיל את בדיקת מתיחה, אז הגיד תשמר את המבנה שלו. הגדרת הקצב הזחה של המכונה במהירות קבועה של 1 מ מ/s עד קרע. להקליט את כוח מתיחה האולטימטיבי (UTS) בהתחשב ניוטונים (N) במחשב.
  10. כדי לחשב את האזור חתך הרוחב, במקום שתי מצלמות ניצבים זה לזה, ויוצרים צורה אליפטית, לצלם תמונות.
  11. כדי להסביר את ההבדל בין האזור חתך הרוחב של הגידים הריפוי, לנרמל את UTS לאזור יחידה (N לכל מילימטר מרובע), אשר מייצג את מכאניים מנוסים על ידי הרקמה.

5. ניתוח היסטולוגית

הערה: 15 גידים של כל קבוצה עברה ניתוח היסטולוגית.

  1. לאחר הוצאתה, להטביע את גיד אכילס מיד ב- 4% paraformaldehyde כדי לשמר את מבנהו (1 מ מ של רקמות הוא קבוע לשעה, כך הזמן של קיבעון משתנה בהתאם לגודל של הגיד).
  2. להחליף את paraformaldehyde על ידי 70% אתנול, ולהשאיר את הדגימה ללילה אחד לפחות בפתרון זה.
  3. מקום הגיד במיכל פלסטיק קטנה עם חורים ולמקם את המיכל פתרון טריים של אתנול 70% עבור 1 h.
  4. חזור על המקום הגורם המכיל אתנול 95% עבור ה 1.
  5. חזור על המקום הגורם המכיל 100% אתנול עבור ה 1.
  6. חזור על המקום המיכל בתוך 100% קסילן עבור ה 1.
  7. כעת הכנס את מיכל פלסטיק, אשר מכיל את הגיד, שמן פראפין (56 ° C), להשאיר את זה בן לילה.
  8. באמצעות תחנה ההטבעה (מצויד עם שעווה מותכת, צלחת חמה צלחת קר), בחר תבנית מתכתי המתאימה ביותר דגימת הרקמות, ולמלא אותה עם קצת שמן פראפין כך הבסיס מכוסה.
    הערה: להתמצא הדגימה כדי להשיג מקטעים אנכיים-האזמל הקטן.
  9. כאשר המדגם ימוקם בצורה נכונה, ממלאים את התבנית עם שמן פראפין ומניחים אותו על גבי המכונה קירור. . תן לזה להתקרר למשך 15 דקות לפחות.
  10. הסר הבלוק פרפין ומניחים אותו על קרח במשך לפחות 30 דקות.
  11. להכין כמה שקופיות זכוכית נקי, לשים כמה טיפות של מים יונים עליהם.
  12. -האזמל הקטן, חותכים את בסעיפים 5 מיקרומטר (רק סעיפים שימוש מהחלק האמצעי של הגיד) ומניחים את המקטע בשקופית.
  13. המקום השקופיות בתנור חימום-65 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות, כך הפרפין רק מתחילה להימס להתחבר הרקמה אל הזכוכית.
  14. מקם את השקופיות המכיל מקטעים פרפין בעל פרוסה.
  15. עכשיו deparaffinize, נתרענן הרקמה על-ידי הצבתו של המרחצאות רצופים הבאים:
    8 דקות של קסילן (אמבט 1)
    4 דקות ב קסילן (אמבט 2)
    2 דקות ב- 100% אתנול
    2 דקות ב- 95% אתנול
    2 דקות ב-70% אתנול
    2 דקות במים יונים
  16. עבור Hematoxylin-אאוזין מכתים, מקם את רקמת הפתרונות הבאים.
    1. לטבול את הרקמה במשך 8 דקות ב hematoxylin פתרון (1 g hematoxylin מונוהידראט, 0.2 g קיו3, 50 גרם AIK (אז4)2.12H2O; 200 מ"ל גליצרין; התאם ל 1 ליטר מים מזוקקים).
    2. לטבול את הרקמה במשך 8 דקות תחת ברז מים זורמים.
    3. לטבול את הרקמה ב-30 s באאוזין פתרון (0.25% אאוזין ב- 100 מ של מים מזוקקים המכילים µL 200 של חומצת חומץ מדולל).
    4. לטבול את הרקמה למשך 2 דקות תחת ברז מים זורמים.
  17. צביעת Trichrome של מאסון, בצע את הפעולות הבאות.
    1. לאחר התייבשות, במקום הסעיפים במיכל עם ברזל אלום (0.5 ג'י (NH4) Fe (אז4)2.12H2O 10 מ ל H2O), לסגור את המיכל. חום זה במשך 3 דקות ב 280 W במיקרוגל.
    2. . תן לזה להתקרר למשך דקה, ואז לשטוף אותו במים יונים.
    3. במקום הסעיפים במיכל סגור עם פתרון hematoxylin של Regaud (0.5 ג'י hematoxylin מומס 50 מ ל H2O ב 50 מעלות צלזיוס, ואז הוסף 5 מ ל 95% אתנול וביו -5 מ"ל גליצרין), אחמם את זה עד 90 s ב 280 W.
    4. יש לשטוף אותה במים יונים.
    5. למקם את הסעיפים פתרון חומצה picric (על הרוויה ב מתנול) למשך 3 דקות, לשטוף למשך 5 דקות תחת ברז מים זורמים ולאחר מכן מקם אותו במים יונים לכמה שניות.
    6. עכשיו מקום הסעיפים חומצה fuchsin (0.5 גרם 50 מ ל H2O המכיל 0.25 mL של חומצת חומץ מדולל) עבור 5 s ולאחר מכן לשטוף תחת ברז מים זורמים עד לצבוע נעלם.
    7. דגירה בסעיפים phosphomolybdic תמיסה חומצית (0.5 גרם 50 מ ל H2O) במשך 5 דקות, מקום זה במשך כמה שניות במים יונים.
    8. למקם את הסעיפים פתרון ירוק בהיר (0.5 גרם 50 מ ל H2O המכיל 0.25 mL של חומצת חומץ מדולל) עוד 5 דקות ומניחים אותו תחת ברז מים זורמים עד לצבוע נעלם.
  18. עכשיו מייבשים את הרקמה שוב.
    1. לטבול בסעיף 1 דקות ב- 70% אתנול.
    2. לטבול בסעיף 1 דקות ב- 95% אתנול.
    3. לטבול בסעיף 1 דקות ב- 100% אתנול.
    4. לטבול בסעיף 1 דקות בקסילן (אמבט 1).
    5. לטבול בסעיף 1 דקות בקסילן (אמבט 2).
    6. להסיר את הסעיפים מבלי להסיר קסילן מדי ולשים טיפה של הרכבה בינונית על הדגימה.
    7. לשים את coverslip על גבי (ללא מעוררות בועות) ולתת לו להקשיח כבר לפחות שעתיים.
    8. Hydrolyze 5 היסטולוגית מקטעים (כל אחד גיד שונים) של כל קבוצה ב- HCl N 6 עבור 3 h ולקבוע את הריכוז של קולגן על ידי מדידת hydroxyproline כמו אינדקס בסעיפים 5 מיקרומטר מוכתם.
  19. לנרמל את התוצאות על-ידי האזור מקטע באמצעות התוכנה של היצרן.
  20. כתם של הסעיפים עם אור ירוק כתם כדי להמחיש ולכמת קולגן fibrillar על ידי ניתוח בסיוע מחשב.
  21. לסרוק את המקטעים ולהמיר את התמונות בניואנסים של גריי באמצעות תוכנת IrfanView. להשתמש בתוכנה על כימות למחצה (למשל, כמות אחת).

6. מולקולרית הערכה

  1. לאחר קרע בגיד, אשר מתרחש במהלך בדיקות מכניות, לקחת את הדוגמאות, הצמד להקפיא אותם בחנקן נוזלי, ואחסן אותם ב- 80 ° C (PRP ותמיסת)17.
  2. השתמש ערכת RNA הכולל מסחרית כדי לבודד RNA סה כ17.
  3. למדוד את הביטוי של קולגן (Col I ו- Col III), Metalloproteinases מטריצה (MMP-2, MMP-3 ו- MMP-9), tenomodulin (TNMD) מאת RT-PCR17,18.
  4. לנרמל את רמות הביטוי של mRNA את רמות 28S19.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

התוצאות מבוטא הממוצע ± סטיית התקן של הממוצע, הושוו עם השונות (ANOVA). דו כיוונית ANOVA, פוסט הוק מבחן דה Scheffé, אשר הוא מבחן פרמטרית, שימשו.

כוח מתיחה האולטימטיבי (UTS) הנדרש כדי לעורר קרע של הגידים אכילס שאינם הפצועה של חולדות היה ± 42.0 5.7 N (n = 10). חוזק מתיחה גדל באופן משמעותי (p < 0.0001) בשתי הקבוצות לאחר יום 5. השוואה בין שתי הקבוצות, UTS היה גבוה בקבוצה PRP בכל עת נמדד, במיוחד ביום 15 עד 30. על ידי מדידת האז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

טסיות דם חיוניים דלקתית בשלב מוקדם הגיד תהליך הריפוי. כאשר אלה טסיות נחשפים מחייב רקמות או גורמים זירוז קרישת הדם, הם ישחררו את גורמי גדילה שמוחזקים במלאי בα גרגירים. עקב אינטראקציה זו, מטריצה חוץ-תאית מקרומולקולות synthetized, להתרבות תאים mesenchymal. טסיות הדם יש גם פעילות chemotactic ובתאים בזרם הדם, שיפור אנגיוגנזה ועירור התמיינות6,20.

בדיקה biomechanical נעשתה באמצעות התקן clamping שהוכנו במיוחד עבור ex-vivo בדיקות של גי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תקן דה Liège ומענקים לז'ן - Lechien את הכספים Frédéricq ליאון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קסילזין (Xyl-M)VMDללאהרדמה
קטמין (Jé tamine 1000 CEVA)CEVA Santé Animaleללאהרדמה
בופרנורפין (Vetergé sic Multidosis)ALSTOEללאמשכך כאבים
iso-BetadineMEDA-Pharmaללאנספג זיהומי
Vicryl 6/0Johnson & ג'ונסון
נמבוטלCEVA Santé Animaleללאהרדמה
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148משמר את מבנה הרקמה
איזופרופנול 100%VWR20,922,364
אתנול 95%VWR20,823,362
קסילןVWR28973.363
פרפיןVWRLEIC3950.1006
המטוקסיליןMillipore1.15938.0025צבע
EosinMillipore1.15935.0100צבע
EukittSigma-Aldrich3989הרכבה בינונית
CaCl2
חוט

מקורות

  1. Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
  2. Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
  3. Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
  4. Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
  5. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
  6. Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
  7. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
  8. Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
  9. Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
  10. Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
  11. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
  12. Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
  13. Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
  14. Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
  15. Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
  16. Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
  17. Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
  18. Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
  19. Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
  20. Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
  21. Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
  22. Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
  23. Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
  24. McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143(2012).
  25. Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
  26. Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PRP

מאמרים קשורים