מאמר שיטה

מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק

DOI:

10.3791/55769

⸱

30 באוגוסט 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Materials and Mineral Resources Engineering, National Taipei University of Technology

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-חלקיק Upconversion (UCNP)-photoactivation בתיווך היא גישה חדשה מרחוק שליטה bioeffectors עם הרבה פחות phototoxicity ועם חדירה לרקמות עמוקות יותר. עם זאת, המכשור הקיים בשוק אינה תואמת ברצון upconversion היישום. לכן, שינוי זמין מסחרית לכלי חיוני עבור מחקר זה. בנייר זה, אנו קודם ממחישים את השינויים של fluorimeter קונבנציונלי ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי להפוך אותם תואם לניסויים upconversion פוטון. לאחר מכן נתאר את הסינתזה של-סגול (ניר)-עוררה בכלובים קינאז A קטליטי יחידת משנה של חלבונים (PKA) ותשמרו על מתחם UCNP. פרמטרים עבור microinjection ונהלים photoactivation ניר מדווחים גם. לאחר בכלוב PKA-UCNP הוא microinjected לתוך תאי פיברובלסט REF52, ההקרנות ניר, אשר עדיפה משמעותית על-קונבנציונאלי הקרנת UV, מפעיל ביעילות מסלול התמרה חושית אות PKA בתאים חיים. בנוסף, ניסויים בקרה חיובית ושלילית לאשר כי מסלול PKA-induced שמוביל התפוררות של סיבי סטרס המופעלת באופן ספציפי על-ידי ניר הקרנה. לפיכך, השימוש של חלבון-השתנה UCNP מספק גישה חדשנית לשלוט מרחוק מאופנן אור הסלולר ניסויים, שבה יש להימנע חשיפה ישירה לאור UV.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים ששונו כימית זה יכול להיות photoactivated (למשל, חלבונים PKA בכלוב) פותחו כשדה המתעוררים בביולוגיה כימי לטיפול לא פולשני תהליכים ביוכימיים המערכת1,2 ,3. באמצעות אור כמו גירוי מספק רזולוציה מעולה ייתכן בעת הפעלת אלה בכלוב חלבונים. אולם אור UV יכולה לגרום שינויים מורפולוגיים רצויה אפופטוזיס, נזק לדנ א תאים4,5. לפיכך, ההתפתחויות האחרונות בעיצוב של קבוצות photocaging מתמקדים הפעלת photocleavage על עירור הגל או שני הפוטונים כדי להפחית את phototoxicity, כמו גם כדי להגביר את רקמות עמוק חדירה6,7. קבוצות שכולאת המגיבות אורך גל ארוך יותר המאפשר לנו לבחור מתאימים אורכי של uncaging גל (קרי, ערוצי) באופן סלקטיבי להפעיל bioeffectors כאשר שני או יותר קבוצות caging נוכח7. בהינתן התכונות השימושיות הבאות, פיתוח קבוצות חדשות photocaging האורות האדומים היא עבודה מאד חשובה במעלה הזרם של מתודולוגיות פוטו אטמוספרי מחקרים ביולוגיים החל בודק את המנגנון של תגובות לשליטה פעילות הסלולר8. בכל זאת, קבוצת caging שני הפוטונים הוא בדרך כלל גם הידרופוביות בזכות מבנה הטבעת הארומטית מאוחה, קבוצה caging האור הוא בדרך כלל אורגנומתכתית, עם ליגנדים ארומטי. מאפיין זה הידרופובי/ארומטי אינה מתאימה כאשר bioeffector הוא חלבון או אנזים, כפי שהוא denatures באתר האקטיבציה של החלבון/האנזים גורם לאובדן של הפונקציה, אפילו אם ההטיה ואת פוטוליזה עדיין עובד ברמה הכימית2 ,9.

UCNPs הם מתמרים יעיל זה להמיר את האור עירור ניר UV. מאפיין זה ייחודי ומרתק של UCNPs הציע רזולוציות מציאותי להתייחס לאתגרים הקשורים photoactivation ועורר שחרור מבוקר של מולקולות קטנות, כולל חומצה פולית10, ציספלטין נגזרים11 , DNA/siRNA12קופולימר שלפוחית13, חלקיקים חלול14. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, photoactivation UCNP בסיוע של אנזימים או חלבונים לא נבדקו עד כה. כי אין שום תיק מוצלח של שימוש באור אדום או ניר photoactive אנזים, לנו היו מתבקש לבצע את ההפעלה המופעלות ניר של מבנה חלבון/אנזים מורכב מתחמי ששונו כימית אנזים בכלוב עם סיליקה מצופים, לנתניד מסטול UCNP15. במחקר זה, היה UCNP מצומדת עם קינאז התמרה חושית מגיבים במהירות האות בצורה של PKA בכלובים. PKA שולט סינתזה הגליקוגן ורגולציה cytoskeletal המגיבה לגירויים חיצוניים באמצעות מחזורית אדנוזין פוספט (מחנה) תקנה ציטוזול16. למדנו את הכדאיות של הפעלת אנזים נימוסים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית בניסוי הסלולר לאחר הקרנה ניר. פלטפורמה זו בסיוע UCNP photoactivation הוא מתודולוגיה חדשה photoactivate אנזים באמצעות ניר ומונעת את התגובה התמרה חושית אות בלתי רצויה מתאי הנגרמת על ידי קונבנציונאלי UV הקרנה2,4.

. זה קשה מאוד translocate גדול bioeffectors (למשל, חלבונים) על פני קרום התא כדי לשלוט פעילות תאית. למרות חלבון חלקיקים. מרותק למיטה עשוי להיות קל יותר translocate באמצעות אנדוציטוזה לתוך ציטוזול, ייתכן אנדוציטוזה פגום או מושפל באמצעות מלכודת endosomal ו-2,את הסוגר השפלה lysosomal4. גם אם החלבון בכלוב הוא עדיין מתפקד לאחר רוברטסונית ממברנה, הכמויות translocated אולי לא יהיה מספיק כדי לעורר תגובת תאי ה-2,17 בניגוד חריף, microinjection היא גישה ישירה ולא כמותיים כדי לספק bioeffectors גדולים אל הציטופלסמה של התא. יתר על כן, bioeffector UCNP. מרותק למיטה דורש אור upconverted להיות מופעל. לכן, מכשור אופטי דורש שינוי כדי למדוד באופן חזותי, לנצל את האור upconversion. בעבודה זאת, המסירה של מתחם PKA-UCNP בכלובים לתא באמצעות microinjection ו חיוניים ספקטרוסקופיה ו מיקרוסקופ השינויים הבאים עבור ניר photoactivation יתוארו בפרוטרוט.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול מתארת שינוי נתונים היסטוריים אינסטרומנטציה עבור photoactivation בסיוע upconversion, הליך סינתטיים כדי להפיק בכלוב PKA-UCNP, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) של UCNP מצופה סיליקה ו בכלוב דגימות PKA-UCNP, UV ו ניר פוטוליזה, הכנה תא, PKA-UCNP microinjection, מחקר photoactivation הקמה מתח סיבים ההכתמה של תאים REF52.

1-Fluorimeter ההתקנה עבור מדידת ספקטרום Upconversion

  1. להתקין עדשה המטרה X 4 ליד cuvette האוחז ספקטרומטר פלורסצנטיות כך הלייזר ממוקדת אמצע cuvette.
  2. מקום tunable 0.5 - ל 8-W 980-ננומטר לייזר דיודה ב- 90° נגד העדשה המטרה.
    התראה: המפעיל צריך ידע בטיחות לייזר ולחבוש משקפי לייזר ניר-
  3. יש להתקין מראה השתקפות מלאה בצומת נתיב האור של העדשה אובייקטיבי, לייזר. המקום שחור בציפוי אנודייז לוח מתכת כדי לחסום את החלון עירור של ספקטרוסקופיה וכדי להגן על החלקים הפנימיים.
  4. המקום את cuvette של פתרון UCNP מצופה סיליקה (0.2 - 0.6 מ"ג/מ"ל) בהמחזיק cuvette כך קרן upconversion בהיר, ניתן לאבחן והוא יכול לשמש כדי להתאים את היישור אור הטוב ביותר עבור ההתקנה המראה.
  5. למצב ספקטרוסקופיה של הפריה חוץ גופית עם הנמוכה מתח PMT (להסתגל הגדרה גבוהה יותר אם האות חלש מדי). להתאים את המראה היישור הטוב ביותר, כאשר הקרן הוא על אמצע cuvette ו- PMT מרים את האות החזק ביותר.
  6. למדוד הקשת upconversion, לאחר יישור, עם הגדרת הכוח הרצוי. להשתמש מד כוח ערימת תרמית כדי לבנות את עקומת כיול של עוצמת הלייזר נגד הקריאה הנוכחית חשמל הזרם לייזר. כל הזמן לבדוק את ביצועי לייזר כדי לוודא הביצועים בטווח מכוילת.

2. מיקרוסקופ ההתקנה

הערה: ההתקנה הבאים מתאים מיקרוסקופים מצויד נתיב אופטי בשתי שכבות. אם המשתמש בכוונת התקן מתג מקור האור עירור היציאה האחורית כדי להפוך את הלייזר ניר את הליד לשתף אותה היציאה, קולימטור בנמל גב באופן משמעותי יחסום את ניר כי הוא נועד להפחית את הדגימה חימום. המשתמש חייב לעשות החלטה קשה: לשמור את קולימטור, סובלים יעילות upconversion נמוכה מאוד, או להסיר את קולימטור ולהקריב האינטנסיביות של עירור לאור epifluorescence.

הערה: דיאגרמה שוט הסחה מציג את שיטת נתיב האור ששונה מצלמות-דיגיטליות, מיקרוסקופיה עבור הפריה חוץ גופית upconversion ומצב פוטוליזה ניר ועבור epifluorescence UV פוטוליזה מצב, ואת את הגדרת הניסוי משמש את הניסוי הזה מומחשים איור 2-

מדריך
  1. Equip המיקרוסקופ זריחה עם מטאל-הליד אור, ביים לחלק האחורי עם מסמרים
    הערה: בנתיב זה מהשכבה העליונה אור איפה יש צריח קוביה, תנוחה קוביה אחת להיות ריקה כדי לאפשר ניר בא שביל אור מהשכבה התחתונה
  2. להתקין לייזר דיודה tunable מסוג nm W 980 0.5 ל- 8.0 בנמל צד ימין, עם קולימטור הצדדית פתוח-
    הערה: זה הגדלת מיקרומטר אור לייזר ספוט לבערך 500 בקוטר כאשר משתמשים בעדשה המטרה X 10. הסרת קולימטור זו יוצרת כתם אור מיקרומטר-טווח והופכת ניר תא הקרנה מעשית. קולימטור הזה הוא ניר-שקוף.
  3. להתקין מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר מעברים), מסנן עירור (950 nm זמן לעבור) בשביל אור מהשכבה התחתונה
  4. להשתמש פתרון UCNP כדי להמחיש את נקודת האור ניר. להתאים את מיקום לייזר כדי למרכז את אלומת האור ניר, שדה הראייה כדי לסיים את היישור.

3. הכנה ולבנות אפיון של כלואים PKA-UCNP

  1. Incubate PKA רקומביננטי (9 מיקרומטר) עם 0.5 מ מ 2-nitrobenzylbromide (NBB) ב שכולאת מאגר (20 מ מ טריס-HCl, MgCl של 100 מ מ NaCl, ו- 10 מ מ- 2; pH 8.5) עבור h 1-2-25 ° C. דובדבני NBB עודף עם 10 מ מ dthiothreitol (DTT), אז dialyze נגד 4-(2-hydroxyethyl) מאגר חומצה piperazine-1-ethanesulfonic (HEPES) (10 מ מ, pH 7.5) כדי להסיר עודפי ריאגנטים ומלח.
    הערה: ה-pH של התמיסה caging היא יורדת מ- 8.5 7.5 במהלך דיאליזה עם HEPES pH 7.5 עבור התגובה הנייח עוקבות.
  2. מיקס לנתניד מלחי-Y(CH3CO2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.4527 g, mmol 1.38 אינץ), י. ב (CH 3 CO 2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) ו- Tm (CH 3 CO 2) 3 הידרוקסיד (99.9%, 0.0168 g, mmol 0.02 נקודות)-octadecene (30 מ ל), חומצה אולאית (12 מ ל), מחממים את התערובת עד 115 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וניתן עד 50 מעלות צלזיוס. הבא, לפזר את תערובת התגובה בפתרון methanolic (20 מ ל) עם 0.2 גרם (5.0 mmol) של NaOH גלולה, 0.2964 גר' (8 mmol) אמוניום פלואוריד על ידי sonication במשך 15 דקות ולהגדיל את טמפרטורת התגובה עד 300 ° C כדי לקבל את ליבת UCNP (β-NaYF 4 : Tm 1.0% 3 + / י. ב 30% 3 +) חלקיקים.
  3. להמיס את ליבה חלקיקים (25 מ ג) עם CO-520 (0.5 מ"ל) בציקלוהקסאן (10 מ"ל). הוספת אמוניה (wt 30% v/v, 0.08 mL) ו tetraethylorthosilicate (הפנסיון, 0.04 mL) ולהחיל בחישה מתמדת במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל את מצופה סיליקה β-NaYF 4: 1.0%Tm 3 + /30%Yb 3 + הליבה חלקיקים.
  4. דגירה של PKA (6 nmol) או בכלוב PKA (6 nmol) עם UCNP (מ ג 1) 15 מאגר HEPES (10 מ מ, pH 7.5) ב 4 ° C עבור 3 h כדי לשתק את PKA על מצופה סיליקה UCNP דרך אינטראקציות אלקטרוסטטית.
  5. לסנן את התערובת באמצעות מסנן PVDF (0.45 מיקרומטר), צנטריפוגה-17,000 x g 10 דקות ב 4 ° C, ו- redisperse בגדר ב- HEPES (50 µL, 10 מ מ, pH 7.5) 0.1% המכיל חלבון מייצב להשיג המתחם PKA-UCNP מטוהרים. צנטריפוגה-17,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את תגובת שיקוע עבור וזמינותו ברדפורד צינור 1.5-mL-
  6. לנתח את PKA מאוגדות ב תגובת שיקוע הציל מכל שלב 3.5 עם שיטת ברדפורד הגב-לחשב את רמת החלפת PKA על החלקיקים UCNP, אשר בדרך כלל יש רמה החלפה של ~ nmol 4.5 של PKA לכל מ"ג של החלקיקים.
    הערה: וזמינותו ברדפורד חושף צבע כחול חזק על כדורי, אשר מרמז על הנייח חלבון ברמה ויציבה ללא desorption, בעוד חלק מהיממה supernatant בכלוב PKA-UCNP פתרון מראה בצבע דומה (מאגר HEPES איור 4 c-4e).

4. אפיון

הערה: וזמינותו קינאז משמש לכמת את הפעילות הספציפי של פירובט קינאז. בקצרה, זירחון של פפטיד, אשר זה משולב פירובט קינאז, לקטט דהידרוגנאז, תוצאות החמצון של NADH. היווצרות של האחרונים מנוטרת על ידי מדידה של הפחתת ספיגת של NADH-340 nm.

  1. לקבוע הפעילות של PKA ו- PKA-UCNP ב- 60 µL הנפח הכולל של תערובת assay המכיל 4-morpholinepropanesulfonic חומצה (סחבות, 100 מ מ, pH 7.5), אשלגן כלורי (100 מ מ), phosphoenolpyruvate (עידוד, 1 מ מ), אדנוזין טריפוספט (ATP, 1 מ מ), β - nicotinamide אדנין dinucleotide, מופחתת טופס (NADH, 0.8 מ מ), מגנזיום כלוריד (MgCl 2, 1 מ מ), kemptide (0.4 מ מ), תערובת דהידרוגנאז קינאז/לקטט פירובט (30-40 יחידות של PK/LDH).
  2. למדוד של הפחתת ספיגת NADH לאורך זמן לאחר התוספת של PKA פתרון (2 µL) לתערובת וזמינותו. לחשב את השיפוע של קו שישקף את פעילות קינאז הנמדדים ישירות.
  3. מודדים את הפעילות של PKA-UCNP 15, את הפעילות הכללית, אשר צריכים להיות תואמים את המוצר כפל של פעילות ספציפית PKA יליד ואת הסכום המחושב משטח מצופה PKA.

5. פוטוליזה ההתקנה

  1. אותייור כל הכוח של האור מקורות באמצעות חיישן תרמי ערימת ולחשב כוח צפיפות (PD = כוח (W) / אזור (2 ס מ)) 18 בהתבסס על האזור ספוט אור.
  2. לבצע ניסויים במבחנה UV פוטוליזה על מערכת מסחרית עם 365 nm LED (200 mW/cm 2) 15-
  3. Photoactivation עבור UV על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP עם עירור אור המסוננות לפי הקוביה מסחרי 15.
    הערה: צפיפות כוח היא ~ 15 mW/cm 2, בלי מטרה העדשה למקד.
  4. עבור במבחנה ניר photoactivation על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP באמצעות לייזר nm 980 עם הגדרות מסנן/ראי upconversion מותאם אישית מותקן על השביל אור מהשכבה התחתונה, מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר-מעבר), ו מסנן עירור (950 nm ארוך מעברים).
    הערה: צפיפות כוח פלט הוא W/ס מ 5 2 לפני 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות. צפיפות כוח מוערך ~ W/cm 68 2 אחרי 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות.

6. התא הכנת הדוגמא Microinjection של מתחמי PKA-UCNP

  1. מראש לסנן את הדגימות דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לאחר PKA הנייח (שלב 3.5).
  2. דגירה התאים ב- 10% סרום שור עוברית (FBS) המכילים L-15 בינוני במהלך תקופת microinjection לשליטה יציבה pH מחוץ החממה.
    הערה: כדי לוודא השלמת microinjection, שותף להחדיר את PKA מקורי-UCNP, UCNP-PKA בכלוב או PEGylated UCNP (7.5 מ"ג/מ"ל) 15 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה) (10 מיקרומטר) ב לתאים.
  3. להתאים את ריכוז החלקיקים PKA-UCNP כזה, לאחר microinjection, הריכוז cytosolic הוא 1-3 μM PKA - טווח הריכוז פיזיולוגי עבור PKA בתא, עם ההנחה כי אמצעי האחסון הזרקת הוא 1/10 של תאי האחסון .
  4. לבצע את microinjection לתוך התאים (שלב 6.2) באמצעות מכשיר microinjector יחד עם micromanipulator הידראולי ציר אחד ( איור 3).
  5. שימוש מד לחץ דיגיטלי לעקוב אחר למידת הלחץ המופעל על ידי microinjector נמצא טווח ההפעלה (~ 50-200 hPa) לאטום את השסתום מנפק בחדר לכאורה מותאמים אישית כדי לספק פיצוי לחץ microinjection. למשוך חזרה את המחט באמצעות של פולר.
  6. לשמור על הלחץ הזרקת בין 50 ו 75 hPa, עם מועד ההזרקה של 200-300 ms והלחץ פיצוי-hPa 15 כדי למנוע התרבות בינוני זרם אחורי לתוך מחט על ידי נימיות.
  7. לבחון את הפתחים עצה של המחטים כדי להבטיח כי יש להם קוטר חיצוני בין 1.3, 1.5 מיקרומטר, אשר יכול להיות מאושרות על ידי לקיחת תמונות באמצעות עדשה המטרה 40 x.
  8. לרחוץ את התאים עם 2 מ"ל של מדיום L-15 המכיל 10% FBS לאחר microinjection. להתבונן ההדמיה פלורסצנטיות הסלולר מ 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (טמרה) כדי לאשר השלמה microinjection.

7. Photoactivation של כלואים PKA-UCNP באמצעות UV או ניר אור בתאים חיים

photoactivation
  1. עבור UV לאחר microinjection PKA-UCNP, לגדל את התאים REF52 בצלחת מיקרומטר 3.5, למקם אותם על הבמה מיקרוסקופ, להאיר אותם באור UV מסוננת על-ידי הקוביה למשך 3 דקות בלי מטרה העדשה למקד.
    הערה: REF52 התאים היו בהשתתפות DMEM המכיל 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2, ואז התאים היו subcultured confluency הגיע ל- 90% כל 2-3 ימים.
  2. Photoactivation עבור ניר לאחר PKA-UCNP microinjection, להאיר את התאים על לייזר 980-nm מההגדרות מהשכבה התחתונה מסנן/ראי, כפי שמתואר בשלב 5.4.
    הערה: הפלט צפיפות כוח הוא W/ס מ 5 2 לפני 10 X עדשה המטרה תוך התמקדות, מוערך W/cm 300 2 לאחר 10 x עדשה המטרה תוך התמקדות. Upconversion הוא תהליך הדורש צפיפות הפוטונים גבוהה, במיוחד כאשר משמרת anti-Stoke גדולה יותר יש צורך. לפיכך, תוך התמקדות נדרש במהלך photoactivation.
  3. כאשר נקודת אור גדולה יותר (650 מיקרומטר x 520 מיקרומטר) נדרשת, לעורר תאים אלה עם ניר ממוקד על ידי עדשה המטרה 10 x עם קולימטור במשך 15 דקות אפשר עבור מרווח כהה 5 דקות לאחר כל הקרנה 5-מין כדי למנוע חימום.
    הערה: כאשר מרחבית-רזולוציה גבוהה (במקום אור subcellular) יש צורך, להשתמש העדשה המטרה X 40 עם הקדמוניות מותקן בסוף היציאה של המדריך אור כדי ליצור כתם אור subcellular-מימד (5 מיקרומטר x 4 מיקרומטר). במקרה זה, 1 s של הקרנה מספיקה ניר photoactivation עקב שטף גבוה של פוטונים.
  4. פוטוליזה לאחר UV או ניר, לאפשר את התאים להתאושש ב CO 5% 2 החממה ב 37 ° C עבור h 1 בינוני מלא ליצירת תגובות הסלולר. לאחר מכן, לתקן אותם ב- 1 מ ל תמיסת 4% paraformaldehyde/פוספט-buffered (PBS) כעשרים דקות לפני עוד יותר להכתים.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד; להימנע ממגע עם העור, העיניים או הקרומים הריריים. להימנע נושם את האבקה במהלך מדידת והכנות.

8. ויזואליזציה של התפוררות סיבים מתח נגרמת על ידי ניר Photoactivation

  1. לאחר קיבוע, השתמש אלקסה 594-phalloidin (להוסיף µL 5 בפתרון מניות מיקרומטר 6.6 µL 200 ל- PBS עבור צביעת; תקופת דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר) כתם ו דמיינו את סיבי סטרס. לדמיין את התמונות של אלקסה 594-phalloidin (לשעבר 581 nm/Em 609 ננומטר) באמצעות ערכת מסנן.
  2. דגירה את התאים עבור 5 דקות 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) בטמפרטורת החדר. לאחר צביעת, לשטוף את הדגימות עם PBS ולקחת בנפרד פלורסנט תמונות של סיבי סטרס, גרעינים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העיצוב של הבונה אנזים בכלוב-UCNP מודגם באיור1. האנזים PKA היה תחילה הגיבו 2-nitrobenzyl ברומיד ליצירת של PKA בכלוב אינו פעיל, זה היה אז electrostatically ללא יכולת תנועה על פני השטח של UCNP. UCNPs פולטים אור upconverted, וכתוצאה מכך photolytically קליב הקבוצות o-nitrobenzyl על Cys 199 ואת Cys 343, יוצר את PKA מופעל. TEM תמונות ואת וזמינותו ברדפורד אישר כי PKA של PKA בכלוב היו ותשמרו על פני UCNPs, פעילות קינאז בכלובים פתרון PKA-UCNP אחרי UV photoactivation לבד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבר, הופמן ועמיתים מצא כי שינויים מורפולוגיים דרמטי נצפו בתאים REF52 לאחר microinjection של PKA חופשי19. במחקר אחר, קבוצת לורנס הוכיח כי PKA בכלוב יכול להיות מופעל ויוו, המוביל שינויים מורפולוגיים התפוררות של סיבי סטרס כאשר נתון UV פוטוליזה20. מוקדם יותר דיווח על ניצול אור עבור photoactivation הראה את ההפעלה של מספר bioeffectors מולקולרית בסיוע UCNP, בכלובים, קטן21,22,23u...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים המדע ננו טכנולוגיה תוכנית של אקדמיה Sinica, משרד המדע ואת הטכנולוגיה של טייוואן לצורך מימון (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנט
טריס(הידרוקסימתיל)אמינומתאןסיגמא154563
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמאM9272
MOPSסיגמאM1254
HEPESסיגמאH4034
נתרן כלורי סיגמא31434
אשלגן כלוריסיגמא12636
איטריום אצטט  הידראטסיגמא326046Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) אצטט הידרטAlfa Aesar14582Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) אצטט טטרה-הידראטסיגמא326011Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-OctadeceneSigmaO806
Oleicacid Sigma364525
Methanol מקרון304168
נתרן הידרוקסידסיגמא30620
אמוניום פלואורידJ.T.Baker69804
IGEPAL  CO-520Sigma238643
ציקלוהקסאןJ.T.Baker920601
אמוניום הידרוקסיד (28% - 30%)J.T.Baker972101אמוניה
טטרה-אתיל אורתוסיליקט (TEOS)Sigma8658
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
N-hydroxymaleimide (NHM)Sigma226351PKA
תמיסת מייצב חלבון Prionex חוסמת פעילות מקולגן חזירסיגמא81662תמיסת מייצב חלבון
2-ניטרובנזיל ברומיד (NBB)מגיב סיגמא107794PKA
8-(4-כלורופנילתיו) אדנוזין 3&פריים;,5&פריים;-מלח נתרן מונופוספט מחזוריסיגמאC39128-CPT-cAMP
פירובט קינאז/דהידרוגנאז לקטי אנזימים משריר הארנבSigmaP0294PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphateדיסודיום SigmaA2387ATP
β-NADH מופחת מדיפוטסיוםSigmaN4505
PhosphoenolpyruvateSigmaP7127PEP
Coomassie מגיב לבדיקת חלבון, 950 מ"לThermo Scientific23200מגיב לבדיקת ברדפורד
חלבון קינאז תלוי cAMPPromegaV5161בקרת פעילות PKA
pET15b-PKACAT פלסמידAddgene#14921
pKaede-MC1 פלסמידCoralHueAM-V0012
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), pH 7.4Thermo Scientific10010023
DMEM, גלוקוז גבוה, פירובטGibco12800-017תא מדיום
תרבית ליבוביץ L-15תעשיות ביולוגיות בינוניות01-115-1Aמדיום תרבית תאים
סרום בקרעוברי תעשיות ביולוגיות04-001-1A
פרפורמלדהידACROS416785000
DAPIInvitrogenD1306צבע צביעת גרעין אלקסה
594-פלואידיןInvitrogenA12381צבע מכתים F-actin
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine Novabiochem8.51030.9999
Pierce Coomassie (ברדפורד) ערכת בדיקת חלבוןThermo Scientific23200
CelluSep T4 צינורות/דירוג מסנן נומינלי MWCO 12,000 - 14,000 DaMembrane Filtration Products, Inc.1430-33קרום דיאליזה
Millex-HV יחידת מסנן מזרק, 0.45 ומיקרו; m, PVDF, 13 מ"מ, גמא מעוקרEMD MiliporeSLHVX13NL
<חזק>ציוד
פיזור אור דינמי/Zetapotential Zetasizer nano-ZSMalvernM104
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורJEOLJEM-1400
ספקטרופוטומטר פלואורסצנטיAgilent Technologies10075200קארי אקליפס 
ספקטרופוטומטר UV-VisAgilent Technologies10068900Cary 50 
מיקרוסקופ פלואורסצנטיאולימפוסIX-71
950 ננומטר מסנן לונגפס ThorlabsFEL0950
850 ננומטר מראה דיכרואית קצרChromaNC265609
RT3 צבע CCD מערכתSPOTRT2520
תאורה פלואורסצנטיתPREלומן 200
980 ננומטר אינפרא אדום דיודה לייזרCNIMDL-N-980-8W
UV LED ספוט מקור אורUVATAUVATA-UPS412עם UPH-056-365 ננומטר LED ב-200 mW/cm2
חיישן ערימה תרמיתOPHIR12A-V1-ROHS
Picospritzer IIIParker Hannifin052-0500-900מערכות חלוקה מיקרו-תאיות
PC-10 חולץ מחטNarishigePC-10
מד לחץ דיגיטליLutronPM-9100
ציר אחד שמן הידראולי מיקרומניפולטורNarishigeMMO-220A
Heraeus Fresco 17 צנטריפוגה, קירורתרמו מדעי75002421

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
  2. Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
  3. Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
  4. Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
  5. Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
  6. Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
  7. Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
  8. Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
  9. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
  10. Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
  11. Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  12. Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
  13. Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
  14. Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
  15. Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
  16. Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
  17. Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
  18. Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
  19. Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
  20. Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
  21. Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
  22. Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
  23. Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Protein Kinase ANIRPKA

מאמרים קשורים