מאמר שיטה

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

DOI:

10.3791/55781

⸱

22 ביוני 2017

 ,  ,  , 
1Inserm U 1227, CNRS UMR 7225, 2Sorbonne Universités, UPMC, University of Paris, 3Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 4AP-HP, Hôpital de la Pitié Salpêtrière;

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים רבים הוכיחו את תפקודם של תאי החיסון, ובמיוחד מקרופאגים, בפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). ישנן שתי אוכלוסיות מקרופאגיות עיקריות במערכת העצבים המרכזית: (i) המיקרוגלים, שהם המקרופאגים של ה- CNS, והם נגזרים מאבות שק החלמון במהלך אמבריוגנזה (2), המקרופאגים הנגזרים מונוציטים (MDM), אשר יכולים לחדור CNS במהלך המחלה נגזרים אבות מח עצם. התפקידים של כל subopopulation מקרופאג שונים בהתאם הפתולוגיה הנלמדת. יתר על כן, אין הסכמה על סמנים היסטולוגיים או הקריטריונים המבדילים המשמשים subpopulations מקרופאגים אלה. עם זאת, ניתוח של פרופילי הביטוי של CD11b ו CD45 סמנים על ידי cytometry הזרימה מאפשר לנו להבדיל microglia (CD11b + CD45 med ) מ MDM (CD11b + CD45 גבוהה ). בפרוטוקול זה, אנו מראים כי צנטריפוגה צפיפות שיפועואת זרימת cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לאפיין אלה subpopulations מקרופאס CNS, וכדי ללמוד מספר סמנים של עניין לידי ביטוי על ידי תאים אלה כפי שפורסם לאחרונה. לכן, טכניקה זו יכולה לקדם את ההבנה שלנו את התפקיד של מקרופאגים מודלים העכבר של מחלות נוירולוגיות והוא יכול לשמש גם כדי להעריך את ההשפעות על התרופה תאים אלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia הם מקרופאגים תושב רקמת parenchymal של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם משחקים שני תפקידים מרכזיים תפקודית: ההגנה החיסונית ותחזוקה של הומאוסטזיס CNS. בניגוד ל- MDM, המתחדשים ללא הרף מתאי גזע ההמטופויטים במוח העצם, תאי המיקרוגליאל נבדלים מתאי האב הקדמון הפרימיטיביים שמקורם בשק החלמון (YS) שהתיישב במוח במהלך התפתחות עובריים 1 , 2 , 3 . במכרסמים, גורם שעתוק Myb ממלא תפקיד מכריע בפיתוח של כל מונוציטים מקרופאגים מוח העצם נגזר, אבל עבור YS נגזר microglia, גורם זה הוא dispensable ו הבחנה נשאר תלוי גורם שעתוק PU.1 4 .

ב CNS בריא, microglia הם תאים דינמיים כי כל הזמן מדגם הסביבה שלהם, scaNning ו מדידות עבור פתוגנים פולשים או נזק לרקמות 5 . גילוי של אותות כאלה יוזם מסלול לפתרון הפציעה. המיקרוגליה עוברת במהירות ממורפולוגיה מסועפת לאחת אמבואידית, ואחריה פגוציטוזיס ושחרור של מתווכים שונים, כגון ציטוקינים פרו-או אנטי-דלקתיים. לפיכך, בהתאם microenvironment שלהם, microglia מופעל יכול לרכוש מגוון רחב של מדינות פרימינג מובהק 6 .

Microglia השפעה עמוקה על התפתחות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות רבות. במודלים המכרסמים של מחלת אלצהיימר (AD), 7 , טרשת נפוצה (ALS) 8 , טרשת נפוצה (MS) 9 או מחלת פרקינסון (PD) 10 , המיקרוגליה מתבטאת בתפקוד כפול, או בהופעת נוירוטוקסיות מזיקה או משחק באופן נוירו-יציבותי, התלותיאת המחלה הספציפית, את שלב המחלה, והאם המחלה הושפעה על ידי תא החיסון המערכתי 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . רוב נגעים CNS שנצפתה במחלות שצוטטו לעיל מכילים אוכלוסיה הטרוגנית של תאים מיאלואידים, כולל לא רק microglia parenchymal, אלא גם מקרופאגים perivascular ו מאנגיאל, כמו גם MDM חדירת CNS. סוגי תאים אלה עשויים לתרום באופן דיפרנציאלי למנגנונים הפתופיזיולוגיים הקשורים לפציעה ולתיקון 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . האתגר הנוכחי לחוקרים הלומדים מודלים אלה של המחלה הוא לקבוע אם מונוציטים הפריפריה מקרופאגים לחדור CNS ואם כן, כדי distלהכניע את המיקרוגליה של התאים האלה. ואכן, תאים microglial הם פלסטיק מאוד; כאשר הם מופעלים, microglia מחדש להביע סמנים שבדרך כלל לידי ביטוי על ידי מונוציטים היקפיים מקרופאגים. הנושא, אם כן, מסתמך על זיהוי סמנים שיכולים להבחין בין microglia תושב מן מונוציטים חדרו מקרופאגים.

האפליה של אוכלוסיות אלה על פרוסות המוח על ידי יישומים אימונוהיסטולוגיים מוגבל בשל חוסר נוגדנים ספציפיים. עם זאת, ניתוח cytometry זרימה היא טכניקה יעילה כדי להעריך את הביטוי של כמה סמנים להבדיל אוכלוסיות תאים (למשל, לימפוציטים, מקרופאגים / MDM CD11b + CD45 גבוה , microglia CD11b + CD45 med ), כמו גם תת subpopulations 16 , 17 , 18 . פרוטוקול זה מתאר את ההליכים לבידודתאים mononuclear מ CNS העכבר במודלים של מחלות נוירולוגיות באמצעות ניתוק אופטימלי, אנזימטי רקמות צנטריפוגה צפיפות שיפוע; כמו גם, שיטה לבידול מיקרוגליה ו - MDM אוכלוסיות ב CNS באמצעות cytometry הזרימה.

גישה נוספת היא לחסל את myelin ולטהר את התאים באמצעות חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדנים ספציפיים 19 , 20 , 21 . הסרת Myelin באמצעות חרוזים מגנטיים anti-myelin הוא יקר יותר משפיע על הכדאיות והתשואה של תאים מבודדים 22 . צעד זה ואת ההפרדה החיסונית הבאה של microglia, להגביל מחקרים נוספים של אוכלוסיות תאים ספציפיים החיסון 21 , 22 .

נהלים אלה מספקים דרך קלה ללמוד את subcopulations macrophage בפיתוח מחלות, וכדי לקבוע את השפעות התרופה או שינויים גנים על פנוטיפים מקרופאג ומצבי הפעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי המוסד לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש במכון ICM ועל ידי ועדת דארווין הצרפתית בעלי חיים אתיים, והם מכוסים תחת פרוטוקול 01407.02.

1. הכנה

  1. הכן את קוקטייל העיכול בצינור 1.5 מ"ל על ידי שילוב הבאים עבור כל עכבר: 1 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS); 123 אנזים עיכול μL (ראה טבלה של חומרים) ב 13 wunsch / מ"ל ​​(פתרון המניות), ריכוז סופי 1.6 wunsch / מ"ל; ו 5 μL DNase אני (ראה טבלה של חומרים) ב 100 מ"ג / מ"ל ​​(פתרון המניות), הריכוז הסופי 0.5 מ"ג / מ"ל.

2. זלוף ו Dissection

  1. להרדים את העכברים עם מינון קטלני של pentobarbital (100 μL ב 400 מ"ג / מ"ל).
  2. מניחים את החיה במצב שכיבה ולרטב את הגוף עם אתנול 70%.
  3. חותכים את העור הגחון עם מספריים בסדר רק מתחת לתהליך cypphoid לחשוף את חלל החזהY.
  4. לעשות חתך הסרעפת לחתוך את ההיבטים לרוחב של כלוב הצלעות עם מספריים בסדר הזנב כדי לכיוון מקורי לחשוף את הלב (ולהימנע לחתוך איברים אחרים). זהה את החדר השמאלי (LV) ואת אטריום ימין (RA).
  5. הכנס קטטר פרפר עם מחט 25 G בתוך LV. לעשות חתך על RA עם מספריים בסדר בתחילת זרם הדם, להתחיל זלוף בקצב 10 מ"ל / דקות הזרימה דרך LV עם 20 מ"ל PBS להסיר תאים ודם מן כלי; זלוף מוצלח הוא ציין על ידי blanching של הריאות ואת הכבד כמו דם הוא עקורים.
  6. לערוף את החיה עם מספריים בינוניים. לנתח את עמוד השדרה עם מספריים בסדר להפריד אותו מהגוף על ידי הוצאת את שרירי דופן דופן הבטן בצד הגחון של עמוד השדרה על ידי חיתוך עמוד השדרה בבסיס הזנב.
  7. הכנס מזרק 10 מ"ל המכיל PBS ו נטען 200 פיפטה μL רכוב אל הצד המותני שלאת עמוד השדרה ואת לשטוף את חוט השדרה בצד צוואר הרחם.
    הערה: 200 פיפטה μL קצה הוא לחתוך עם מספריים בקצה הרחב ביותר שלה (כ 1 ס"מ) ומוכנס בחוזקה על מזרק 10 מ"ל בעבר מלא PBS.
  8. הסר את העור מעל הגולגולת ולהשתמש מלקחיים לחשוף את המוח. הכנס להב מספריים בבסיס הגולגולת לחתוך את הגולגולת לאחר תפר sagittal. הכנס מלקחיים קטנים לתוך לחתוך בעדינות להרים את הגולגולת. לנתח את המוח מן הראש העכבר להסיר את הנורה חוש הריח ואת המוח הקטן.
  9. איסוף המוח חוט השדרה בצינור 1.5 מ"ל המכיל 1.128 מ"ל PBS עם קוקטייל עיכול (משלב 1.1).

3. תא דיסוציאציה

  1. לחתוך דק את המוח ואת חוט השדרה בצינור 1.5 מ"ל (שלב 2.9) לתוך 1-2 מ"מ 3 חתיכות עם מספריים קטנים ( איור 1 ).
  2. דגירה צינור 1.5 מ"ל המכיל רקמות טחון במשך 30 דקות ב incubaטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 .
    הערה: הכן את שיפוע הצפיפות בשלב זה.
  3. הוסף 20 μL 0.5 M EDTA (פתרון המניה), 10 מ"מ ריכוז סופי, לצינור 1.5 מ"ל לעצור את התגובה האנזימטית.
  4. בעדינות להפוך ההשעיה התא על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה 5 מ"ל.
  5. לעבור את ההשעיה התא דרך רשת ניילון (70 מיקרומטר גודל הנקבוביות) בצינור 50 מ"ל באמצעות הבוכנה של מזרק 10 מ"ל.
  6. לשטוף את רשת ניילון עם 20 מ"ל 5% עוברית שור בסרום (FBS) -PBS.
  7. צנטריפוגה במשך 7 דקות (300 x ג ') בטמפרטורת החדר (18 ° C). מחק את supernatant על ידי שאיפה ולהמשיך לשלב הבא. היזהר מאוד בעת הסרת supernatant; לא להפריע גלולה, אשר יכול בקלות להיות aspirated על ידי פיפטה aspirating.

4. צפיפות הדרגתית

  1. הכן פתרון המניות של המדידה שיפוע צפיפות על ידי הוספת הסכום המתאים של 10x PBS למדיום שיפוע צפיפות.
    הערה: הוסף חלק אחד 10X PBS ל 9 חלקים צפיפות בינוני שיפוע.
  2. לדלל את המדידה שיפוע צפיפות מלאי עם 1x PBS עבור האחוזים השונים כמתואר בטבלה 1 .
  3. Resuspend גלולה (משלב 3.7) עם 4 מ"ל 30% צפיפות המדידה שיפוע ולהעביר צינור 15 מ"ל.
  4. מניחים פיפטה פסטר בתחתית צינור 15 מ"ל ו לאט שכבת 4 מ"ל של מדידת צפיפות 37% צפיפות 37%.
  5. הוסף 4 מ"ל של 70% צפיפות שיפוע בינוני, כמתואר לעיל.
  6. צנטריפוגה שיפוע במשך 40 דקות (800 x ג ') בטמפרטורת החדר (18 ° C). ודא צנטריפוגה מפסיק עם בלם מינימלי או לא, כך הביך לא מופרע.
    הערה: הצינור יופיע ברבדים. התאים מרובד על 70% - 37% צפיפות ממשק שיפוע הם תאי החיסון mononucleated (microglia ו macropage subpopulations); הרמות העליונות הן פסולת התא ומיאלין, בהתאמה ( איור 2 ).
  7. באמצעות פיפטה העברת, להסיר בעדינות את שכבת המיאלין.
  8. איסוף 3-4 מ"ל של 70-37% צפיפות שיפוע interphase המכיל את התאים subpopulations macrophage לתוך צינור נקי 15 מ"ל.
  9. לשטוף את התאים 3x עם PBS, נפח כולל של 15 מ"ל. ודא בינוני צפיפות שיפוע המכיל את התאים הוא מדולל לפחות שלוש פעמים עם PBS, ו לצנטריפוגה במשך 7 דקות (500 xg, 4 ° C) עם הבלם "ב".
  10. Resuspend תא גלולה עם 1 מ"ל PBS לתיוג תאים או מבחני תפקודי אחרים.

5. תא תיוג עבור זרימת cytometry

  1. מעבירים את התאים (שלב 4.10) לתוך צינור cytometry זרימה.
  2. הוסף 1 μL של לתקן תאים מתים מגיב התא מתווך לכל דגימה התא שהתקבל בשלב 4.10. דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
  3. שטפו את התאים פעם עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות (300 xg, 4 ° C).
  4. הסר את supernatant, ו resuspend תא גלולה עם400 μL PBS 1% BSA, אזיד 0.1%.
  5. הוסף 1 מיקרוגרם CD16 / CD32 נוגדנים 100 μL של תאים כדי לחסום את הקולטנים FC. דגירה 10-15 דקות על קרח, מוגן מפני האור.
  6. הכן את תערובת הנוגדן העיקרי ב PBS 1% BSA, 0.1% אזיד או PBS 1% BSA, אזיד 0.1%, 0.25% saponin, permeabilization תא מכתים תאיים.
  7. הוסף 100 μL של נוגדנים ראשוניים לערבב (2x) ו דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
    הערה: כל נוגדנים צריך להיות טיטרציה לפני ביצוע הניסוי כדי להבטיח תוצאות אופטימליות.
  8. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות (300 xg, 4 ° C). חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
  9. הוסף 100 μL של נוגדן משני אם הנוגדנים העיקריים אינם מצומדות ישירות fluorophore, ו דגירה במשך 30 דקות על הקרח, מוגן מפני האור.
  10. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 ב 4 ° C). חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
  11. תתקן את התאים עם 100 PFA 1 μL 1% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור.
    הערה: זהירות: PFA הוא רעיל. השתמש ברדס קטר וללבוש ציוד מגן אישי.
  12. לשטוף את התאים עם 2 מ"ל PBS ו צנטריפוגה 5 דקות ב XG 300 ב 4 ° C. חזור על פעולה זו שלוש פעמים.
  13. Resuspend תא גלולה עם 200 PBS μL ולהמשיך זרימת cytometry זרימה וניתוח. בצע את האסטרטגיה gating באיור 3 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות מכתים נוגדן, התאים נרכשו על cytometer זרימה ונותחו באמצעות אסטרטגיה gating מורפולוגיים כדלקמן. שער ראשון הוגדר בחלקת הנקודות קדימה-מפוזרת שטח (FSC-A) לעומת קדימה-מפוזרים גובה (FSC-H) כדי להפלות תאים בודדים מן doublets ( איור 3 א ). תאים בודדים היו מגודרים מכן על FSC-A לעומת צד מפוזרים שטח (SSC-A) מגרשים נקודה כדי להוציא פסולת התא ותאי pyknotic, בהתבסס על גודל התא יחסית ואת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הוכח כי microglia ו MDM יש פונקציות שונות פנוטיפים במערכת העצבים המרכזית, ולכן זיהוי וניתוח של subopopulations מקרופאגים אלה חיוניים על מנת להבין טוב יותר מחלות נוירולוגיות 9 , 18 , 25 . זרימת cytometry ניתוח באמצעות שני סמנים (CD11b ו CD45) מאפשר את ההבחנה בין כל subpopulation ( איור 3 ג ). אסטרטגיה זו אושרה בעבר באמצעות סמנים ספציפיים אחרים, כגון CCR2 עבור ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ הסוכנות הלאומית להפלגה Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), האגודה הצרפתית אלצהיימר Bpifrance. המעבדה שלנו נתמכת גם על ידי Inserm, CNRS, אוניברסיטת Pierre et Marie-Curie והתוכנית "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). ברצוננו להודות לעזרתו של CELIS תא התרבות הליבה מתקן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עכברים בני 5 חודשיםJanvierC57BL/6J
Liberase TL בדרגת מחקרSigma-Aldrich5401020001אנזים עיכול
Deoxyribonuclease I מלבלב בקרSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01שיפוע צפיפות מסננת תאים
בינונית גודל 70 ומיקרו; m ניילוןקורנינג731751
Venofix 25 גרםBRAUN4056370
מזרק בוכנה 10 מ"לTerumoSS+10ES1
Pasteur פיפטה 230 מ"מDustcher20420
1.5 מ"ל צינורEppendorf0030 123.328
15 מ"ל צינורTPP91015
50 מ"ל TPP91050
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגולBD Falcon352054
D-PBS (1x) ללא Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) ללא Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
סרום בקרעוברי תרמו פישר סיינטיפיק10270-106
EDTAסיגמא-אולדריץ'E4884
תמיסת אלבומין סרום בקר 30%סיגמא-אולדריץ'A7284
פרפורמלדהיד 32% תמיסהמיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי15714-Sזהירות -
ספוניןסיגמא-אולדריץ'S2002
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'47036
PerCPCy5.5 חולדה נגד עכבר CD11b (שיבוט M1/70)eBioscience45-0112
חולדה IgG2b K בקרת איזוטיפ PerCP-Cyanine5.5eBioscience45-4031
BV421 חולדה נגד עכבר CD45 (שיבוט 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 Rat IgG2b, κ בקרת איזוטיפ RUOBD Biosciences562603
ארנב נגד עכבר TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 חמור נגד ארנב IgGLife TechnologiesA31573
נגד עכבר CD16/CD32 מטוהרeBioscience14-0161עכבר Fc בלוק
ערכות כתמי תאים מתים לתיקוןInvitrogenL34969
עכבר CCR2 APC מצומד נוגדןR& DFAB5538A
חולדה IgG2B מצומד APC בקרת איזוטיפR& DIC013A
עכבר CX3CR1 נוגדן מצומד PER& DFAB5825P
עז IgG נוגדן מצומד PEמו"פ DIC108P
צנטריפוגהEppendorf5804R
מנתח תאיםBD BiosciencesBD FACSVERSE
תוכנת ניתוח נתוניםFlowJo LLCFlowJo
מספריים עדיניםFST14090-11
מלקחיים דפוס סטנדרטיFST11000-13
מספריים מאיוFST14010-15
דומונט #5 מלקחייםFST11251-20
רעיל

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).
  3. Ginhoux, F., Jung, S. Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).
  4. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  5. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).
  6. Miron, V. E., Franklin, R. J. Macrophages and CNS remyelination. J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).
  7. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).
  8. Boillee, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  9. Yamasaki, R., et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system. J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).
  10. Wu, D. C., et al. Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease. J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).
  11. Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target? Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).
  13. Funk, N., et al. Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease. Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).
  14. Butovsky, O., et al. Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS. J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).
  15. Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1. Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).
  16. Sedgwick, J. D., et al. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).
  17. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).
  18. Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology. Aging Cell. , (2016).
  19. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
  20. Jin, L. W., et al. Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).
  21. Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia. J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).
  22. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. J Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  23. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).
  24. Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes. J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).
  25. Richter, N., et al. Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions. Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).
  26. Mahad, D., et al. Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CNSCD11b CD45

מאמרים קשורים