מאמר שיטה

כימות צפיפות הענף בבלוטת החלב עכברוש- mounts כולו באמצעות שיטת ניתוח Sholl

14.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55789

⸱

12 ביולי 2017

 , 
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

במאמר זה

סיכום

התפתחות בלוטת החלב במכרסם הוערכה בדרך כלל באמצעות הערכות תיאוריות או על ידי מדידת תכונות פיזיות בסיסיות. צפיפות הענף היא אינדיקטור להתפתחות החלב שקשה לכמת באופן אובייקטיבי. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להערכת כמותית של מאפייני הבלוטות החלב.

תקציר

מספר גדל והולך של מחקרים מנצלים את בלוטת החלב המכרעת כנקודת קצה להערכת הרעילות ההתפתחותית של חשיפה כימית. ההשפעות האלה חשיפות יש על התפתחות בלוטת החלב מוערכים בדרך כלל באמצעות מדידות ממדי בסיסי או על ידי ניקוד מאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, טווח רחב של שיטות לפרש שינויים התפתחותיים עלול להוביל לתרגומים לא עקביים על פני מעבדות. יש צורך בשיטת הערכה מקובלת, כדי שיוכלו להיווצר פרשנויות מתאימות ממידע שנאסף על פני מחקרים. המחקר הנוכחי מתאר את היישום של שיטת ניתוח Sholl כדי לכמת מאפיינים הסתעפות בלוטת החלב. שיטת Sholl פותחה במקור לשימוש בכימות דפוסי דנדריטים נוירונים. באמצעות ImageJ, קוד פתוח תמונה ניתוח חבילת תוכנה, וכן תוסף שפותח עבור ניתוח זה, בלוטת החלב צפיפות צפיפות המורכבות של AMבלוטת החלב מתוך חולדה נקבה peripubertal נקבעו. השיטות המתוארות כאן יאפשרו את השימוש בניתוח Sholl ככלי יעיל לכימות מאפיין חשוב של התפתחות בלוטת החלב.

מבוא

בלוטת החלב הסתעפות היא מאפיין זה הוא בדרך כלל מוערך כמו אינדיקטור של התפתחות בלוטות, אבל קשה לכמת אובייקטיבי. בשנת 1953, Sholl 1 תיאר שיטה למדידת arborization דנדריטים נוירונים בקורטקס החזותי והמנועי של החתול, ותוסף עבור טכניקה זו פותחה על ידי Ferriera et al 2 . בגלל שני נוירונים בלוטות החלב התערוכה מבנה דומה עץ דמוי, תוסף הועסק לכמת צפיפות הסתעפות האפיתל השד בתמונות 2D של בלוטת החלב peripubertal חולדה. השלב peripubertal נבחר לניתוח בגלל הגמילה היא שלב החיים, כי הוא מוערך לעתים קרובות במעבדות אקדמיות ומבחני מבחן המבחן. ניתוח Sholl הוא תוסף מופץ עם FIJI, המהווה את קוד פתוח עיבוד תמונה ImageJJ, עם תוספים נוספים כלולים. התוסף יוצר סדרה של טבעות קונצנטריות המקיפות פרדף(בדרך כלל סומה של נוירון או המקור של צינור הראשי של בלוטת החלב) והרחבת החוצה לחלק דיסטלי ביותר של האובייקט (רדיוס מצרף). לאחר מכן הוא סופר את מספר הצמתים (N) המתרחשים בכל אחת מהטבעות. תוסף גם מחזירה מקדם רגרסיה Sholl ( k ), המהווה מדידה של קצב ריקבון הסתעפות אפיתל.

באמצעות ImageJ, תמונה skeletized של בלוטת החלב כולו הר נוצר ואזור אפיתל החלב (MEA) נמדדת. התמונה מנותחת באמצעות תוסף ניתוח Sholl, וערכים עבור N ו- k , בין ערכים אחרים שאינם מנוצלים כאן, מוחזרים. צפיפות הסתעפות אפיתל החלב נקבעת על ידי חישוב N / MEA. המידה שבה הסתעפות נמשכת באזורים החיצוניים של האפיתל הבלוטתי הוא המורכבות הסתעפות והוא אינדיקטור לצמיחה אפיתלית אחידה דיסטלי. כמו k הוא מדד של ירידה דיסטלית epithאלירי הסתעפות, הוא מדד יעיל של המורכבות הסתעפות אינדיקטור אמין של התפתחות החלב.

פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיוע מחשב ליצירת תמונות skeletized של בלוטות החלב כולו mounts ו הערכה כמותית המאפיינים הסתעפות החלב ב עכברים peripubertal זכר ונקבה. שיטה זו מהירה יחסית ואינה דורשת שימוש בציוד מיקרוסקופי מיוחד. פיתוח ואישור של שיטה זו מתוארים Stanko et al. (2015) 3 . דוח זה מתאר גם הכנה של בלוטת החלב כולו = mounts. הליכים דומים של כל ההר-חזה תוארו ב- Assis et al. (2010) 4 ו Plante et al. (2011) 5 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל שימוש בבעלי חיים ונהלים עבור מחקר זה אושרו על ידי המעבדה NIEHS טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה וערך באגודה להערכה ו ההסמכה של מעבדה טיפול בבעלי חיים מעבדה.

1. בלוטות בלוטת החלב

  1. תווית מראש כל שקופיות באמצעות שיטה הוכחה קסילן (עיפרון עובד הכי טוב). מכסים אותם עם פתרון הרכבה בסוף כדי לשמור על התווית.
  2. להרדים את החיה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת הוועדה אישרה.
  3. לאחר המתת חסד, במקום החיה על גבה על לוח לנתח ( איור 1 ). למתוח ולדק את כל ארבעת הגפיים, עם הגפיים האחוריות ויוצרים V הפוך (מחזיק סיכות או מחטים מד קטן לעבוד היטב).
  4. ריססו את הבטן בנדיבות עם אתנול 70% כדי לשמור על השיער מתוך המדגם החלב.
  5. בעזרת מלקחיים, למשוך את העור הבטן על קו האמצע ולעשות חתך קטן עםלנתח מספריים, נזהר לא לנקב את הצפק.
    1. החל חתך, לחתוך את העור עד לאזור הצוואר ולאחר מכן distally אל איבר הקדמי. חותכים לאזור המפשעה ולאחר מכן דיסטלי אל המפרק הראשון של האיבר האחורי באותו צד; חתך זה בדרך כלל מפריד בלוטות החלב 5 ו - 6. הימנע חיתוך peritoneum.
    2. משוך לאחור את העור עם כרית שומן החלב המצורפת באמצעות מלקחיים, להפריד אותו בעדינות מן הצפק באמצעות סוף קהה של מספריים לנתח. פרד ככל dorsally ככל האפשר כדי לחשוף את ה 4 במלואו 5 th בלוטות חלב מפשעתי על החלק התחתון של העור; סיכה את העור ללוח לנתח ( איור 2 ).
    3. בעדינות לתפוס את רקמת השד של בלוטת 5 th עם הצד המעוגל של מלקחיים מעוקלים לאט לקצץ את הבלוטה מהעור, נזהרת שלא ניק הבלוטה או העור.
    4. המשך לקצץ,נעים dorsally עד בלוטות 4 וה 5 th הוסרו לחלוטין מהעור. ודא כי אזור הפטמה מוסר עם שאר הבלוטה, כמו זה משמש נקודת המוצא של ניתוח Sholl. חותכים את רקמת החלב מן הגוף שבו הוא מחובר ב בלוטת 4.
  6. לאחר בלוטת מוסר מן החיה, להפיץ אותו באופן שווה על מטען אלקטרוסטטית, 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1 מיקרוסקופית מ"מ, עם הצד שהיה צמוד העור פונה כלפי מטה.
    הערה: עבור בלוטות מחיות זקנות או מניקות, ייתכן שיהיה צורך בשקופית 51 x 75 x 1 מ"מ.
  7. בעוד לובש כפפות, בעדינות לסחוט את כל בועות אוויר. לכסות את הבלוטה עם סרט פרפין פלסטיק ועוד שקופיות מיקרוסקופ לדחוס את הבלוטה לדבוק אותו לשקופית.
    הערה: צינור חרוטי 50 מ"ל מלא מים משמש משקל מתאים. כמות הזמן הדרוש כדי לדבוק בשקופית תלוי בעובי של הבלוטה. רזה, postnaיום טל (PND) 4 בלוטות צריך להיות דחוס במשך מינימום של 30 דקות, בעוד בלוטות בוגרים עבות יותר עשויים לדרוש ככל 2-5 שעות.

2. הכן החלב כולו Mounts

  1. הכן את הפתרון alum carmine לפחות 24 שעות מראש, כפי שהוא דורש רותחים וקירור.
    1. ממיסים 1 גרם של alum carmine ו -2.5 גרם של אלומיניום אשלגן גופרתי (AlK (SO 4 ) 2 · 12H 2 O) ב 500 מ"ל של מים מזוקקים להרתיח במשך 20 דקות בבקבוק 1-L. תביא את נפח הסופי 500 מ"ל באמצעות מים מזוקקים.
    2. סנן את הפתרון באמצעות נייר סינון תחת ואקום קירור לאחסון.
      הערה: פתרון כרמיום אלום ניתן לשימוש חוזר אבל צריך להיות מושלך כאשר הצבע מתחיל להתפוגג.
  2. לפני קיבעון, לקלף את הסרט פרפין מן הבלוטה, נזהר לא למשוך את הבלוטה את השקופית. מניחים את השקופית (ים) בתוך צנצנת זכוכית צלחת מכתים לטבול מקבע (אתאן 100%Ol, כלורופורם, חומצה אצטית קרחית ביחס 6: 3: 1) במשך 12-48 שעות, בהתאם לעובי של הבלוטות.
  3. יוצקים את מקבע להשרות את הבלוטות באתנול 70% במשך 15 דקות. לאט לאט לייבש את הבלוטות על ידי שפכו 1/3 של פתרון אתנול והחלפתו עם מים מזוקקים. משרים במשך 5 דקות. חזור על התהליך שלוש פעמים.
  4. לאחר שטיפה הסופי, לשפוך את כל הפתרון אתנול / מים ולהחליף אותו עם מים מזוקקים 100%. משרים את הבלוטות במשך 5 דקות.
  5. יוצקים את המים מזוקקים לטבול את הבלוטות פתרון alum carmine. כתם הבלוטות במשך 12-24 שעות, בהתאם לעובי.
    הערה: הבלוטות לא יכול להיות מוכתם יתר על המידה, אבל זמן מכתים עבור אצוות מרובים צריך להיות זהה, כך עוצמת מכתים הוא זהה.
  6. יוצקים את הפתרון אלום carmine ולשטוף את הבלוטות במים מזוקקים 100% במשך 30 שניות. בהדרגה לייבש את הבלוטות על ידי השריית אותם באתנול 70% במשך 15 דקות, אתנול 95% במשך 15 דקות,Nd 100% אתנול 20 דקות.
  7. נקה את בלוטות השומן על ידי השריית אותם קסילן עבור 12-72 שעות, בהתאם לעובי.
    הערה: הבלוטות צריכות להיות שקופות (צלולות). אם כל אטום (אזורים לבנבן) להישאר, להמשיך לשריית ב xylene עד שקוף. אם lactating או אחרת עבה מאוד בלוטות מוכתמות וניקוי, xylin ייתכן שיהיה צורך להחליף פעם אחת כדי לנקות את הבלוטות.
  8. הר שקופיות עם המדידה הרכבה מבוסס קסילן ידי pipetting מספיק בינוני רק לכסות את הבלוטה. הוסף coverslip, להבטיח כי אין בועות אוויר הטופס.
  9. אפשר את השקופיות להתייבש. כמו מתייבש בינוני מתייבש, זה יהיה חוזה תחת coverslip, וזה עשוי להיות נחוץ כדי להוסיף בינוני הרכבה נוספים. פעם אחת לא נדרש מדיום נוסף, לאפשר את השקופיות להתייבש לחלוטין; זה עשוי להימשך 2-3 שבועות.
  10. לאחר השקופיות יבשים לחלוטין, כל המדיום גובר שיורית ניתן להסיר עם צמר גפן כותנה כמות קטנה של קסילן. היזהר לא להשתמשיותר מדי קסילן, כמו זה יכול לפזר את המדיום גובר ולשחרר את coverslip. אם זה קורה בועות אוויר לאסוף מתחת coverslip, coverslip יש להסיר קסילן ואת תהליך הרכבה יש לחזור.

3. הכן תמונות הר שלם לניתוח

  1. לכידת תמונות של mounts כולו ( איור 3 ) באמצעות מיקרוסקופ או מיקרוסקופ לנתח מצלמה דיגיטלית עם התוכנה המתאימה.
    הערה: בעוד כל הגדלה כי לוכדת את האפיתל השטני כולו ניתן לבחור, זה הכרחי כדי ללכוד את כל הר תמונות כי יהיה להשוות זה לזה בהגדלה זהה.
  2. הורד ImageJ תוכנה (או תוכנה FIJI) 6 .
  3. פתח את התמונה במלואה הר החלב ב- ImageJ על ידי לחיצה על "קובץ" → "פתח". בחר את הכלי Freehand ו להתחקות סביב אפיתל בלוטתית. בחר "ערוך" & #8594; "נקה בחוץ".
    1. הסר את בלוטות הלימפה על ידי מעקב אחר הצומת ושימוש בכלי Freehand ו "ערוך" → "גזור".
  4. הפרד את ערוצי הצבע על ידי בחירת "תמונה" → "צבע" → "ערוצי פיצול". בחר בערוץ עם הניגוד הטוב ביותר, בדרך כלל הערוץ הכחול.
    הערה: תמונת RGB מורכבת מערימה של הרכיבים האדומים, הירוקים והכחולים של תמונה זו. פעולה זו מפרידה בין רכיבים אלה לשלוש תמונות בגווני אפור של 8 סיביות.
  5. הפחת את הרקע על-ידי בחירה באפשרות "תהליך" ← "הפחתת רקע". בחר את הפרמטרים הרצויים ולאחר מכן לחץ על "תצוגה מקדימה" כדי להציג את השינויים.
    הערה: "Subtract Background" מסיר רקע חלק, רציף. בנוסף, "תהליך" → "מסננים" → "Unsharp Mask" ניתן להשתמש כדי ליצור ניגודיות.
  6. בחר אחד שיטות הבאות להסרה אוטומטית של רעש: ניקוב או הסרת חריגים.
    הערה: ImageJ מציעה שיטה שלישית להסרת רעשים אוטומטית: הסרת NaN. עם זאת, הפקודה NaNs הסר אינה ישימה מאחר שהיא משתמשת בתמונות של 32 סיביות, והשיטה הנוכחית משתמשת בתמונות של 8 סיביות.
    1. הסר רעש באמצעות הפקודה despeckle על ידי בחירת "תהליך" → "רעש" → "Despeckle".
      הערה: זה שווה ערך הוספת מסנן חציון, אשר מחליף כל פיקסל עם הערך החציוני בשכונה 3 × 3 שלה.
    2. הסר רעש באמצעות הפקודה outliers להסיר על ידי בחירת "תהליך" → "רעש" → "הסר Outliers."
      הערה: תהליך זה מחליף פיקסל בחציון של הפיקסלים בסביבה הקרובה, אם הוא חורג מהחציון ביותר מערך מסוים (הסף).
  7. הסר את הרעש הנותר באופן ידני (Lass = "xfig"> איור 4).
    1. לפתוח עותק של התמונה המקורית ולהשתמש זה בתור מדריך למה הוא ומה לא רעש. לחץ על לחצן החץ הכפול-אדום בקצה השמאלי העליון של סרגל הכלים. בחר בכלי ציור; הלחצנים Tool Drawing יופיעו כעת בסרגל הכלים.
    2. לחץ על הכלי מחק. כוונן את קוטר המחק על-ידי לחיצה ימנית על לחצן הכלי מחק. החזק את לחצן העכבר השמאלי כדי למחוק רעש.
      הערה: ניתן לבטל רק הפעלה אחת של מחיקה. לאחר לחצן העכבר השמאלי משוחרר ולחץ שוב, המחיקה הקודמת לא ניתן לבטל.
  8. התאם את הסף על ידי בחירת "תמונה" → "התאם" → "סף". הזז את המחוונים כדי לכוונן את ערכי הסף המינימלי (המחוון העליון) ואת הערך המרבי (מחוון נמוך יותר) עד שיושג תיאור הולם של הבלוטה.
    הערה: הגדרת מקטעי ערך הסף גווני אפור לתמונות של עניין ורקע.
    1. לחץ על החל. במקרה הצורך, הסר רעש נוסף בנקודה זו על ידי ביצוע השלבים הבאים: 3.6.1 ו - 3.6.2.
  9. לשחזר את החלקים של האפיתל הבלוטית שהוסרו על ידי הסרת סף והרעש ( איור 5 ).
    1. ביצוע שחזור תמונה בזהירות על בסיס מינימלי כדי לשמור על שלמות התמונה המקורית. עיין בתמונה המקורית עבור הפניה לגבי מה הוא ומה לא אפיתל.
    2. לחץ על הכלי Spray Can (בסרגל הכלים עם כלי הציור). התאם את קוטר הרסס ואת קצב על ידי לחיצה ימנית על כפתור ריסוס הכלי. מלא בקטעי הבלוטה החסרים על ידי לחיצה או לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי.
  10. יצירת תמונה skeletized של הבלוטה לביצוע ניתוח Sholl. ודא כי התמונה thresholded הוא בינארי על ידי בחירת "תהליך" → "בינארי" → "בצע B Inary ".
    1. אם התמונה היא לבן על רקע שחור, בחר "תהליך" → "בינארי" → "אפשרויות" ובטל את "רקע שחור". Skeletonize את התמונה על ידי בחירת "תהליך" → "בינארי" → "Skeletonize".
      הערה: פעולה זו מסירה שוב ושוב פיקסלים מקצוות התמונה הבינארית עד להקטנתה לצורה ברוחב פיקסל יחיד.
    2. לשכפל את התמונה פעם אחת על ידי בחירת "תהליך" → "בינארי" → "דילאט".
      הערה: פעולה זו ממלאת פערים שנוצרו על ידי סף ו skeletonizing על ידי הוספת פיקסלים לקצוות של התמונה הבינארית.
  11. שמור את התמונה על ידי בחירת "קובץ" → "שמירה בשם". בחר סוג תמונה (בדרך כלל jpeg), הזן את שם הקובץ ולחץ על "אישור".
  12. בדוק את הדיוק של התמונה skeletized על ידי שכבת התמונה skeletized על התמונה המקורית (התחת = "xfig"> איור 6).
    1. יצירת שכבת על ידי פתיחת הן את התמונה המקורית ואת התמונה skeletized. בחר "תמונה" → "שכבה" → "הוספת תמונה". בתיבת הדו-שיח 'הוסף תמונה', בחר את תמונת השלד מהתפריט הנפתח 'תמונה להוספה' והגדר את האטימות ב -30%.
    2. שמור את התמונה של תמונת השלד על גבי המקור על ידי בחירת "קובץ" → "שמירה בשם". בחר סוג תמונה, הזן את שם הקובץ ולחץ על "אישור".

4. לבצע את ניתוח Sholl

  1. פתח תמונה שלד ולהפוך את התמונה בינארי על ידי בחירת "תהליך" → "בינארי" → "לעשות בינארי".
    1. לפני הגדרת סולם ההגדלה, מדוד את מספר הפיקסלים / מ"מ באמצעות מיקרומטר עבור ההגדלה שבה נלכדו התמונות.
    2. הגדר את ההגדלה שנמדדהCale על ידי בחירה באפשרות "Analyse" → "Set Scale". הזן את מספר הפיקסלים / מ"מ. הגדר את "מרחק ידוע" ואת "יחס הממדים פיקסל," הן 1. הזן "מ"מ" עבור "יחידת אורך" ולבדוק "גלובל" (שומר על אותו קנה מידה עבור כל תמונה).
  2. קביעת רדיוס הסיום (רדיוס מצרף) עבור ניתוח Sholl על ידי ציור קו מתחילת צינור הראשי (מרכז ניתוח) לנקודה הדיסטלית ביותר של האפיתל הבלוטות ( איור 7 ).
    1. השתמש בכלי ציור קו בסרגל הכלים כדי לצייר קו בין נקודות עניין. לחץ על מקש "M" כדי לבצע מדידה וציין שחלון תוצאות ייפתח.
      הערה: הערך בעמודה "אורך" הוא אורך השורה ב- mm. ערך זה יוזן באופן אוטומטי כרדיוס הסיום בעת הגדרת הפרמטרים Sholl. תוסף Sholl ישתמש בנקודת ההתחלהשל הקו כמרכז של הטבעות centric.
  3. הפעלת ניתוח Sholl.
    1. הפעל את הניתוח על ידי בחירת "Plugins" "ניתוח Sholl מתקדם;" יופיע חלון פרמטר.
    2. הגדר את רדיוס ההתחלה ב "I. הגדרת פגזים" עד 0.00 מ"מ; אורך הקו הנמדד בשלב 4.2 יוכנס באופן אוטומטי ל"רדיוס הסוף ".
    3. הגדר את "רדיוס צעד צעד" 0.1 מ"מ.
      הערה: גודל הרדיוס קובע את מספר הצלצולים (למעשה מספר האיטרציות); גודל צעד קטן יותר יגדיל את מספר הצלצולים, בעוד שגודל צעד גדול יותר יקטין את מספר הטבעות. הרדיוס לא יכול להיות קטן מדי, אם כי רדיוס קטן מדי יגרום למספר גדול שלא לצורך של טבעות. עם זאת, ניתן להגדיר גדול מדי, אשר תיצור טבעות פחות ולאחר מכן לזלזל במספר האמיתי של צמתים. עיין סטאנקו et al.(2015) לקבלת מידע נוסף על קביעת גודל צעד.
    4. הגדר את "# דוגמאות" ל 1 ואת "אינטגרציה" ל "ממוצע" ב "דוגמאות מרובות לכל רדיוס."
    5. הגדר את "חתוך רדיוס לחתוך" ל 1 לבדוק "להסיק החל רדיוס החל" עבור "# סניפים ראשיים" ב "ג תיאורים ו עקומת הולם."
      הערה: ניתן לסמן את האפשרות "התאמת פרופיל ומחשב" ו "הצג פרטים מתאימים" לפי הצורך.
    6. בדוק "ליניארי" ובחר "התאמת הטוב ביותר" ב "פרופילים ללא נורמליזציה;" לבדוק "אינפורמטיבי ביותר." בחר "שטח עבור פרופילים מנורמל" ב "שיטות Sholl IV."
    7. בדוק "צור צמתים מסכה" ב "V. אפשרויות פלט" כדי ליצור מפת חום של צמתים (אופציונלי).
    8. לחץ על "Cf. Segmentation" כדי ליצור חלון תצוגה מקדימה של התמונה עם טבעות כדי לאשר את האזורניתוח.
  4. לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הניתוח.

5. מדידת MEA

  1. למדוד את MEA על ידי מעקב אחר המרחק הקצר ביותר סביב העץ אפיתל ( איור 8 ).
    1. ב- ImageJ עם תמונת השלד של הבלוטה הפתוחה, לחץ על הכלי מצולע. לחץ על נקודה על היקף של אפיתל העץ להתחיל את המצולע, לנוע סביב המערכת של הבלוטה, ולחץ כדי להוסיף קטע שורה.
    2. כאשר אזור אפיתל כולו כבר לעקוף, לחץ פעמיים כדי לסגור את המצולע. לחץ על "M" כדי לפתוח חלון תוצאות; הערך בעמודה "אזור" הוא MEA.
  2. במקרים בהם האפיתל הבלוטלי הורחב מעבר לצומת הלימפה, הפחת את אזור הצומת הלימפה (LNA) מן MEA בעת חישוב צפיפות הסתעפות.
    1. למדוד את LNA על ידי מעקב אחר הצומת הלימפה באותו mannאה כמו עץ ​​אפיתל הקשה על "מ"
      הערה: LNA חייב להיות מופחת מן MEA במקרים אלה, כי הצומת הלימפה מונע את ניתוח מספור צמתים בתוך LNA. כאשר האפיתל לא הגיע לנקודת הלימפה, ה- LNA הוא אפס.

6. נתוני דיווח

  1. דווח על ערכי הרדיוס המקיף, MEA, N, k וצפיפות הסתעפות.
    הערה: הרדיוס המצורף נקבע בשלב 4.2 וה- MEA נקבע בשלב 5.1.
    1. הפעל את הניתוח כדי ליצור חלון תוצאות Sholl.
      הערה: N דיווח הוא הערך עבור סכום inters. K מדווח הוא הערך עבור מקדם רגרסיה Sholl (חצי יומן). ניתוח Sholl יחזיר ערך עבור k על כל אזור נמדד של האפיתל הבלוטות. כדי להשיג ערך מדויק עבור k על אפיתל מלא, הקצוות ductal חייב להיות נוכח.
    2. שנה את הE ניתוח Sholl עבור בלוטת החלב באמצעות ערך הפלט עבור N לחשב את צפיפות הסתעפות (נקודת הקצה הבסיסית של שיטה זו). חישוב צפיפות הסתעפות באמצעות נוסחה N / (MEA-LNA) ולדווח על הערך כמו N / mm 2 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכים עבור רדיוס סגורה נמדד, MEA, N, k , וצפיפות הסתעפות מחושב עבור בלוטת החלב ניתח בפרוטוקול זה מדווחים בטבלה 1 . ניתוח Sholl מייצר מגרשים ליניארי ו חצי יומן של מספר צמתים בכל רדיוס ( איור 9 ), ואם נבחר, מפת חום של צמתים ( איור 10 ). בלוטות פחות מפותחות התערוכה פחות צמתים בתוך MEA זהה ולכן יש צפיפות הסתעפות נמוכה יותר. בלוטה מפותח ימשיך סניף אחידה לאורך כל האפית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מלידה עד גיל ההתבגרות, הצמיחה בלוטת החלב היא allometric. לאחר גיל ההתבגרות, בלוטת החלב מתפתחת דרך הסתעפות הדוקטריים התארכות, אשר ממשיכים עד אפיתל החלב תופסת את כרית שומן כולו. מאפייני הסניף הם היבט חשוב של התפתחות בלוטת החלב, והיכולת לאמוד באופן אובייקטיבי מאפיינים אלה יכולה להיות שימושית מאוד להערכת התפתחות החלב הנורמלית ולזיהוי התפתחות חריגה בעקבות חשיפות מוקדמות לחיים של רעילות החלב.

ניקוד מאפיינים מורפולוגיים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לגלות.

תודות

המחברים מבקשים להודות לד"ר מיכאל אסטרלינג (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) על עזרתו עם אימות השיטה הזאת וד"ר טיאגו פריירה (אוניברסיטת מקגיל, מונטריאול, קוויבק, קנדה) סיוע עם יישום Sholl.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לוח חיתוךNANAחתיכת קלקר בערך 10 "x12" מתאימה.
T-PinsDaiggerEF7419A
עם אתנולNANA 70% אתנול מתאים.
מספריים לחיתוך מעוקליםFine ScienceTools 14569-09
מספריים ישרים לניתוקכלי מדע עדינים14568-09
מלקחיים מעוקליםכלי מדע עדינים11003-12
Superfrost Plus 24 x 75 x 1 מ"מ שקופיות מיקרוסקופThermoFisher Scientific4951PLUS-001תרמו סיינטיפיק סופרפרוסט פלוס & שקופיות Colorfrost Plus מחזיקות קטעי רקמה לצמיתות ללא צורך בציפויים יקרים ביישומי IHC ופתולוגיה אנטומית. טיפול זה מפחית את אובדן הרקמות במהלך הצביעה כמו גם שעות של הכנת שקופיות. שקופיות מושכות אלקטרו-סטטית קטעי רקמות קפואות ותכשירים ציטולוגיים וכוללות כימיה דומה לסילאן, אם כי מותאמת לשיפור ביצועי היישום.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest Premium Cover Glass 24 x 60 x 1 מ"מFisher scientific12-548-5P
Bemis Parafilm M סרט עטיפת מעבדהFisher scientific13-374-12
כלורופורםSigma-AldrichC2432
חומצה אצטית קרחוניתSigma-AldrichA9967
אתנול אבסולוט, ≥ 99.8% (GC) סיגמא-אולדריץ'24102
קסילןסיגמא-אולדריץ'214736
אלום קרמין Sigma-AldrichC1022
אלומיניום אשלגן גופרתי סיגמא-אולדריץ'A6435
אמצעי הרכבה פרמאונטפישר סיינטיפיקSP15
מקרוסקופLeicaZ16 APO זוהי החומרה והתוכנה ללכידת התמונות המשמשות במעבדה זו. מכיוון שישנן אפשרויות רבות ושונות, השיטות והיישומים עשויים להשתנות בין מעבדות.
מצלמה דיגיטליתLeicaDFC295
תוכנת מצלמהLeicaLeica Application Suite v3.1 
תוכנת ImageJקוד פתוחhttp://imagej.net/Welcome
Sholl http://imagej.net/Sholl_Analysisקוד פתוח
ניתוח בקבוק ספריי ניתוח

מקורות

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5(2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373(2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ImageJSkeletonized ImageWhole mountImage Thresholding

מאמרים קשורים