מאמר שיטה

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו

8.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55793

⸱

21 ביולי 2017

 ,  , 
1Infection and Immunity Program, Monash Biomedicine Discovery Institute, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול מוצג עבור קריסטלוגרפיה רנטגן באמצעות microcrystals חלבון. שתי דוגמאות ניתוח vivo- microcrystals מגודלים לאחר טיהור או תאמול מושווים.

תקציר

הופעת של beamlines microfocus באיכות גבוהה במתקנים סינכרוטרון רבים אפשרה ניתוח שגרתית של גבישים קטנים מ 10 מיקרומטר במימד הגדול ביותר שלהם, אשר שימשו אתגר. אנו מציגים שני workflows חלופי עבור קביעת המבנה של microcrystals חלבונים על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן עם דגש מיוחד על גבישים הגדלים in vivo . Microcrystals הם גם מחלץ תאים על ידי sonication ו מטוהרים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלי, או ניתח ב תאית לאחר מיון התא על ידי cytometry הזרימה של תאים המכילים קריסטל. לחלופין, גבישים מטוהרים או תאים המכילים קריסטל נספגים בפתרונות אטום כבדים לניקוי ניסיוני. דגימות אלה מוכנים אז ניסויים עקיפה באופן דומה על ידי יישום על תמיכה מיקרומטר פלאש קירור חנקן נוזלי. אנו מתארים בקצרה ולהשוות ניסויים עקיפה טורית של microcrystals מבודדים,המכילים תאים באמצעות microfocus beamline synfrotron לייצר מערכי מתאים fasing, בניית מודל ועידון.

זרימות עבודה אלה מודגמות עם גבישים של פוליפרום מורי cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin המיוצר על ידי זיהום של תאים חרקים עם baculovirus רקומביננטי. במחקר זה, בניתוח תאית הוא יעיל יותר מאשר ניתוח של גבישים מטוהרים התשואות מבנה ~ 8 ימים מן הביטוי כדי חידוד.

מבוא

השימוש של קריסטלוגרפיה רנטגן לקביעת מבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות ביולוגיות חווה התקדמות מתמדת בשני העשורים האחרונים. הגדילה הגוברת של קריסטלוגרפיה רנטגן על ידי חוקרים שאינם מומחים מדגים את הדמוקרטיזציה של גישה זו בתחומים רבים של מדעי החיים 1 .

מבחינה היסטורית, גבישים עם מימדים מתחת ~ 10 מיקרומטר נחשבו מאתגרים, אם לא בלתי שמישים, עבור קביעת מבנה. הזמינות הגוברת של מיקרופוקוס ייעודי מקורות beamlinesat synchrotron קרינה ברחבי העולם והתקדמות טכנולוגית, כגון פיתוח של כלים לתפעל microcrystals, יש להסיר הרבה מחסומים אלה כי stymied השימוש הרחב של microcrystallography רנטגן. ההתקדמות מיקרוסקריאלוגרפיה טורית של רנטגן 2 , 3 ו מיקרו אלקטרונים עקיפה 4 חההראו כי השימוש מיקרו ו nanocrystals עבור קביעת המבנה הוא לא רק ריאלי אלא גם לפעמים עדיף על השימוש גבישים גדולים 5 , 6 , 7 .

התקדמויות אלה יושמו לראשונה על המחקר של פפטידים 8 גבישים טבעיים המיוצרים על ידי וירוסים חרקים 9 , 10 . הם משמשים כיום למגוון רחב של מקרומולקולות ביולוגיות, כולל המערכות הקשות ביותר, כגון חלבונים בממברנה ומתחמים גדולים 11 . כדי להקל על ניתוח של microcrystals אלה, הם נותחו ב meso , במיוחד חלבונים ממברנה 12 ו שבבי microfluidics 13 .

הזמינות של מתודולוגיות מיקרו-קריסטלוגרפיות חדשות אלה העלתה את האפשרות להשתמש בVivo התגבשות כמו תוואי חדש עבור ביולוגיה מבנית 14 , 15 , 16 מציע חלופה קלאסית במבחנה חוץ גופית . למרבה הצער, גם כאשר קריסטלים vivo יכול להיות מיוצר, מספר מכשולים להישאר כגון השפלה או אובדן ligands במהלך הטיהור מן התאים, קושי במניפולציה ו להדמיה של גבישים על beamline synchrotron ו מייגעת רנטגן ניסויים רנטגן. כמו גבישים חלופיים יש גם ניתחו ישירות בתוך התא ללא כל שלב טיהור 17 , 18 , 19 . ניתוח השוואתי מצביע על כך כי גישות תאית יכול להיות יעיל יותר מאשר ניתוח של גבישים מטוהרים נתוני התשואה של ברזולוציה גבוהה יותר 20 .

פרוטוקול זה הוא בנוטה לסייע לחוקרים חדשים microcrystallography חלבון. הוא מספק מתודולוגיות התמקדות הכנה המדגם מניפולציה עבור רנטגן עקיפה ניסויים beamline synchrotron. שתי אפשרויות מוצעות באמצעות גבישים מבודדים microcrystallography קלאסי או תאים המכילים גביש מיון לפי cytometry זרימה לניתוח cellulo ( איור 1 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: ב התגבשות vivo דווחה אורגניזמים רבים, כולל חיידקים, שמרים, צמחים, חרקים ויונקים (נבדק בהתייחסות 21 ). התגבשות של חלבונים רקומביננטיים הושגה גם במעבדה באמצעות transfection חולף של תאים יונקים זיהום baculovirus של תאים חרקים. הפרוטוקול הבא פותח באמצעות Bypbyx מורי cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin הגן משובטים ב baculovirus רקומביננטי תחת האמרגן polyhedrin baculovirus, שנוצר לפי הוראות התייחסות 22 . לכן, למרות פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם סוגי תאים אחרים ( למשל תאים יונקים), אנו מתארים כאן את הנהלים עבור תאים חרקים. הפרוטוקול מניח כי יתר ביטוי של חלבון של עניין כבר הושג. שיטות לייצור baculovirus רקומביננטי ושימוש בו לביטוי של חלבון של עניין הם avAilable בהפניות 23 , 24 , 25 , 26 , 27 .

1. זיהוי של תאים המכילים קריסטל

  1. אם התאים גדלים monolayer, ישירות לבדוק אותם בבקבוק. אם התאים גדלים בתרבות נוזלית, השתמש בפרוטוקול הבא.
    1. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, העברת 500 μL של תאים לתוך צינור microcentrifuge. הקפד לוודא כי סטריליות של התרבות העיקרית נשמרת; לטפל בתאים בארון biosafety Class II ופעל טכניקות aseptic סטנדרטיים.
    2. Pipet 5 μL של תאים מן הצינור microcentrifuge על שקופית זכוכית.
    3. בזהירות במקום coverslip זכוכית על הנוזל, הימנעות היווצרות של בועות אוויר. אם השקופית לא יכול להיות דמיינו בתוך 15 דקות, לאטום את coverslip עם שמן ואקום, כדי למנוע אידויAtion.
  2. תמונה את הבקבוק או להחליק עם מיקרוסקופ הפוך. אם זמין, להשתמש בניגוד לעומת ו / או הפרעה הפרעות בניגוד מיקרוסקופ (DIC). שתי הטכניקות משפרות את הניגוד בדגימות שקופות ומדגישות קווים וקצוות, ובכך מאפשרות זיהוי של גבישי vivo .
  3. בדוק היטב את התאים. התחל בהגדלה 200X ו זום ב הגדלה מקסימלית בעת גילוי גביש פוטנציאלי. נוכחות של גבישים ניתן הציע בעקיפין על ידי שינויים במורפולוגיה התא ( איור 2 ). חפש קצוות חדים ושינויים במקדם השבירה (אם נעשה שימוש בניגודיות פאזה או ב- DIC). ידוע גבישים vivo לאמץ צורות שונות כולל מוטות, ערימות של מחטים, קוביות, פירמידות polyhedra (ראה איור 2 ו 1 טבלה עבור כמה דוגמאות).
    הערה: חלקם של תאים המכילים גבישים יהיה שונה בכל מקרה ויכול ערבN להשתנות בין ההכנות אבל בכלל לא צריך לצפות למצוא גבישים בכל התאים. כמו כן, מספר הגבישים לכל תא משתנה (ראה טבלה 1 ), וניתן למצוא יותר מ גביש אחד בתא אחד. גורמים אלה צריכים להיות ממוטבים היכן שניתן על ידי התאמת ריבוי של זיהום, שינוי אורך הביטוי משתנה המבנה חלבון. מצד אחד, תנאי ביטוי חלבון וצמיחת תאים הממקסמים את מספר התאים המכילים קריסטל ישפרו את הפרודוקטיביות ( למשל ריבוי גבוה יותר של זיהום ואיסוף מאוחר של תרבית תאים). מצד שני, התנאים שבהם תאים מכילים גביש אחד להקל על איסוף נתונים ( למשל ריבוי נמוך של זיהום). לאור העשרה שהובאה על ידי מיון הזרימה המתוארת בשלב 2.2, אנו ממליצים לכוון גבישים גדולים יותר ( למשל גביש בודד לכל תא) גם אם חלקם של תאים המכילים קריסטל הוא נמוך.
  4. אם קריסטלS מזוהים, להקליט את עמדתם (כאשר הדמיה monolayer בבקבוק), ולהעריך את אחוז תאים המכילים קריסטל. אם זמין, להשתמש במיקרוסקופ מצויד מצלמה שמסוגל לעקוב אחר שינויים ברמת תא בודד.
  5. עבור תאים ההשעיה, לקבוע את מידת הכדאיות התא בעקבות פרוטוקול מפורט בהתייחסות 28 . עבור תאים מתורבת monolayer, הערכה על ידי בדיקה ויזואלית את מידת משוער של מפגש וכמות של תאים מנותקים.
  6. לפקח על הצמיחה קריסטל, צמיחה התא ואת הכדאיות פעמיים ביום.
  7. קציר התאים ברגע הצמיחה גביש נראה לעצור. עבור גבישים חזקים להפליא כמו polyhedra ויראלי, פעמים הדגירה המורחבת (> 4 ימים) להגדיל את מספר גבישים גדולים. עם זאת, עבור גבישים חלבון טיפוסי, אנו ממליצים לקצור תאים כאשר הכדאיות טיפות מתחת 80% כדי למנוע נזק שנגרם על ידי תמוגה התא.
  8. הסר את הבקבוק מן האינקובטור ולהמשיךצעד 2.2 בהקדם האפשרי. שמור את התאים על הקרח במהלך השלבים הבאים, אלא אם צוין אחרת.

2. טיהור מדגם

הערה: אנו מתארים שתי שיטות ניתוח של קריסטלים vivo מ גבישים מטוהרים ב cellulo , בהתאמה.

  1. טיהור גבישים
    הערה: אלא אם כן יש ראיות כי גבישים של עניין רגישים לטמפרטורה נמוכה, לעבוד על הקרח ולהשתמש במאגרים קר כקרח כדי למנוע השפלה גביש.
    1. Pipet 50 מ"ל של תאים Sf9 נגוע בצינור 50 צנטריפוגה חרוטי מ"ל. זה מייצג ~ 4 x 10 8 תאים בניסוי טיפוסי.
    2. תאים גלולה ב XG 450 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. מחק supernatant ו resuspend גלולה ב 40 מ"ל של פוספט צונן שנאגרו מלוחים (PBS), pH 7.4.
      הערה: PBS מוצע כנקודת מוצא לטיהור כחיץ איזוטוני סטנדרטי במטרה mimIcking את הסביבה הסלולרית שבה גדל גבישים in vivo. זה כבר בשימוש עבור רוב קריסטלים vivo גדל בתרבית התא עד כה 9 , 14 , 29 . לחלופין, התקשורת DMEM גם שימש בהצלחה טיהור של גבישים vivo מ תאים יונקים 19 . אם הגבישים סובלים באופן ברור מהמעבר שלהם ב- PBS או בהפרעה לקויה, יש לבחון את הפרמטר הזה כמקור פוטנציאלי של השפלה.
    4. Sonicate גלולה resuspended עבור 30 ים ב 10 MA באמצעות sonicator מצויד בדיקה 19 מ"מ. כדי למנוע חימום המדגם, למקם אותו כוס מלאה קרח בעוד sonicating. שינויי תאים כימיים או מכניים עשויים לשמש כחלופות אם גבישים מופיעים פגומים על ידי sonication כפי שהוערך בשלב 2.1.7.
    5. צנטריפוגה ב XG 450 במשך 10 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, 2 שכבות ניכרות:שכבה עליונה של פסולת סלולרית, חום בהיר, וגלולה נמוכה יותר של גבישי פוליאדרין, לבנים וגיריים.
    6. מחק את supernatant ולהסיר את השכבה העליונה על ידי pipetting זהיר. Resupend גלולה התחתון 40 מ"ל של PBS צונן.
    7. להעריך את איכות הדגימות על ידי הדמיה עם מיקרוסקופ אור.
      1. פיפט 5 μL של תאים או גבישים מטוהרים על גבי שקופית זכוכית. זה יכול להיעשות בטמפרטורת החדר.
      2. בזהירות במקום coverslip זכוכית על הנוזל, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
      3. תמונה שקופית עם מיקרוסקופ הפוך בהגדלה 200X. תמונה המדגם בתוך 15 דקות של ההכנה בשקופית. אם השקופית לא יכול להיות דמיינו בתוך 15 דקות, לאטום את coverslip עם שמן ואקום, כדי למנוע אידוי.
        הערה: במקרה של polyhedra, גבישים יופיעו כמו קוביות refringent של ~ 1 - 10 מיקרומטר לכל צד. בדוק את שלמות הגבישים מחפש סימנים של אובדן חדות( למשל קצוות עגולים), סדקים או פירוק. כמו כן לפקח על נוכחות של פסולת התא שיופיע כמו גושים ואובייקטים של גודל וצורה לא סדירה.
    8. חזור על שלבים 2.1.5 ל 2.1.7, חצי נפח של PBS המשמש resuspend גלולה בכל מחזור עד הגבישים מופיעים ללא פסולת. Resuspend גלולה הסופי 1 מ"ל של PBS צונן ולהעביר את הגבישים לצינור microcentrifuge. חנות גבישים מטוהרים ב 4 ° C.
    9. להעריך את הריכוז של גבישים באמצעות hemocytometer כפי שתואר על ידי היצרן. ספור גבישים כאילו סופרים תאים.

figure-protocol-1
איור 3 : מטוהרים Microcrystals Vivo . טיהור נציג של גבישים של polyhedrin BmCPV1 מ Sf9 תאים חרקים מראה ( א ) פסולת התא גלולה ו בוכהגחלים לאחר sonication, ו ( ב ) תקריב על שכבות פסולת וגבישים. שכבת פסולת ניתן resuspended בזהירות supernatant וזורקים לטיהור גביש מהר. ( ג ) תמונה מיקרוסקופית אופטית של polyhedra מטוהרים. סולם בר = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. בידוד של תאים המכילים קריסטל על ידי זרימת cytometry
    הערה: כדי להקל על הגדרת השערים בציטומטריה זרימה, מומלץ לגדל תרבות שליטה במקביל לזה המבטא את החלבון של עניין. זה יכול להיעשות על ידי הדבקת בקבוק של תאים Sf9 עם baculovirus רקומביננטי לא רלוונטי, או על ידי הכנת תאים מדומים נגועים. מיון והדמיה של דגימות נעשה בדרך כלל בטמפרטורת החדר.
    זהירות: Propidium iodide הוא חשוד מסרטן ויש לטפל בועם דאגה.
    1. Pipet 4 מ"ל של תאים Sf9 נגוע - המייצג ~ 3 x 10 7 תאים - בצינור מותאם לניתוח זרימת cytometry. כמו כן, להכין צינור השני עם מספר שווה של תאים Sf9 נגוע baculovirus שאינם רקומביננטי.
    2. הוסף propidium יודיד (PI) לדגימות בשני ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​רק לפני הערכת cytometric זרימה. שלב זה הוא הכרחי כדי לזהות תאים מתים, גושי תאים ופסולת שעשויים לשנות או להסוות את התפלגות התא על קדימה ואת צד פיזור העלילה. הכן מניות PI של 1 מ"ג / מ"ל ​​במים חנות ב 4 ° C מוגן מפני האור.
    3. החל תאים על cytometer זרימה סטנדרטית מסוגל מיון תאים לפי קדימה (FSC) ו-פיזור צד (SSC). לנתח לפחות 20,000 אירועים של שליטה ( כלומר שאינם המכילים גביש) מדגם. לאחר השלכת תאים מתים, clumps התא ופסולת מן הניתוח, ליצור את FSC כדי העלילה SSC.
    4. לנתח לפחות 20,000 אפילוTS של המדגם המכיל קריסטל. השווה את FSC כדי העלילה SSC עם אחד ללעוג. חפש את המראה של אוכלוסייה ברורה המתאימים תאים המכילים קריסטל. בדרך כלל, תאים עם גבישים תאיים יהיה גבוה יותר SSC בשל המורכבות המורפולוגית גדל. FSC עשוי גם להגדיל אם הצמיחה גביש גורם לעלייה בנפח של התא. להגדיר את השערים של סדרן הזרימה לבודד אוכלוסיות תאים המתאימים לאזורים של פיזור העלילה שונה מן העלילה מזויף. תמונה את הדגימות מיון על ידי מיקרוסקופ אור כמתואר בשלב 1 כדי לאשר איזו אוכלוסייה קשורה תאים המכילים קריסטל.
    5. באמצעות השערים שהוגדרו בשלב 2.2.4, מיון תאים המכילים קריסטל PBS, או כל חיץ איזוטוני אחר. רשום את מספר תאים המכילים קריסטל מיון, כמו גם את נפח הסופי כדי להקל על הצעדים הבאים. חנות תאים ממוינים על הקרח או 4 ° C.
      הערה: בעוד שעה,> 300,000 polyhedra-conתאים מסווגים ממוינים על סדרן התא עם זרבובית 100 מ"מ (138 kPa עם תדר של 39 קילוהרץ). כמות זו של תאים מספיק כדי להכין> 1,000 meshes.
    6. בעקבות פרוטוקול מפורט בשלב 2.1.7, התמונה התאים עם מיקרוסקופ אור כדי לאשר את העשרה בתאים המכילים קריסטל. הכנת המדגם לאיסוף נתונים צריך להיעשות בהקדם האפשרי לאחר מיון תאים מאז גבישים עשויים להשפיל לאורך זמן או להשתחרר עקב תמוגה התא.

figure-protocol-2
איור 4 : מיון תאים. זרימת נציג cytometry פיזור מגרשים מ ( א ) תאים לא נגועים (מדומה), אשר אינם מכילים גבישים, ו ( ב ) Sf9 תאים נגועים על ידי recombinant baculovirus יתר ביטוי עבור polyhedrin BmCPV1. הבדלים בתבנית הפיזור בין שתי האוכלוסיות(גלאי אדום, ערכי SSC גבוהים). כל מגרש מייצג 20,000 מיון אירועים. SSC: פיזור אור בצד; FSC: פיזור אור קדימה. ( ג ) תמונה מיקרוסקופית אופטית של אוכלוסייה מייצגת של תאים ממוינים, מראה נוכחות של גבישים תאיים. סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. הכנת דוגמאות לאיסוף נתונים

הערה: אם תאים או גבישים הם להיות derivatized עבור פרוטוקול ניסיוני בצע פרוטוקול מפורט בסעיף 3.1. אחרת, עבור ישירות סעיפים 3.2 עבור גבישים מטוהרים או 3.3 לניתוח cellulo .

  1. נגזרות של microcrystals מטוהרים או תאית
    זהירות: עיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש.רוב הכימיקלים המשמשים לניסויים ניסיוניים הם רעילים מאוד. השתמש בכל נוהלי הבטיחות המתאימים, כולל שימוש במכסה קטר כימי ובציוד מגן אישי. השלכת מוצרי פסולת בהתאם למדיניות המוסד שלך.
    הערה: הטבע של אטומים כבדים, ריכוז שלהם זמן הדגירה ניתנים על בסיס אינדיקציה גבישים של polyhedrin BmCPV1. פרמטרים אלה חייבים להיקבע באופן ניסיוני עבור כל יעד חדש. מכתים לאחר מכן עם כחול trypan בשלב 3.3.2 ניתן להשמיט אם תאים צבעוניים בקלות על ידי התרכובת הכימית המשמשת phasing.
    1. הכן פתרונות רוויים של אטומים כבדים הרצוי (או פתרונות של כימיקלים אחרים המשמשים שלב ניסיוני). בדרך כלל, כרכים נמוך מ 100 μL יידרש עבור כל אטום כבד. הסר מלחים בלתי פתורים ופסולת על ידי צנטריפוגה במהירות מקסימלית microcentrifuge למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הכן aliquots של ~ 50,000 גבישיםאו תאים ממוינים לכל תרכובת אטום כבדה. אם PBS אינה תואמת את הכימי המשמש derivatization ( כלומר טפסים המשקע ואת הפתרון הופך מעונן), גלולה את הגבישים ב XG 4,000 במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge, או התאים ב XG 150 במשך 3 דקות, להסיר את Supernatant ו resuspend בעדינות את גבישים או תאים 20 μL של חיץ מתאים. חזור על גלולה resuspension כדי להבטיח כי אין עקבות של PBS להישאר. להתאים את עוצמת הקול הסופי μL 20 לכל aliquots.
    3. הוסף 20 μL של פתרון אטום כבד או תרכובת כימית אחרת של בחירה גבישים או תאים. ריכוז אופטימלי של אטום כבד יהיה תלוי שילוב של פרמטרים הסלולר (חדירות, חלבונים היעד מחוץ ...) ואת אופי הגביש של חלבון של עניין. כנקודת מוצא, מבחן 3 ריכוזים שונים: רוויה מלאה, 1 / 10e, 1 / 100e.
    4. שמור את דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 ימים. קריסטלים של פוליEdrin הם עמידים מאוד צפוף ודורשים זמן רב soaks כדי לשלב את אטומים כבדים; עבור סוגים אחרים של גבישים תקופת הדגירה ואת הריכוז של אטומים כבדים יש לקבוע באופן ניסיוני. פעמים הדגירה קצר מדי לא יאפשר שילוב של כמויות נאותה של אטום כבד, בעוד פעמים הדגירה ארוכה יכולה להשפיע על שלמות הגבישים, ולכן הורדת איכות עקיפה שלהם או אפילו המסת אותם. כנקודת התחלה, נסה 3 פעמים הדגירה שונים עבור כל פתרון אטום כבד ( למשל 1 דקות, 1 שעה ולילה). גזירה מוצלחת מוערכת על ידי ניתוח של נתונים עקיפה כפי שתואר בקצרה בסעיף 5 והפניות בו.
    5. לשטוף את עודף של פתרון אטום כבד על ידי pelleting את הגבישים ב XG 4,000 במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge, או התאים ב XG 150 דקות 3, הסרת supernatant בעדינות resuspending גבישים או תאים μL 10 של חיץ .
  2. הכנת תמיכה במיקרושים עם מיקרו-קריסטל מטוהרים
    זהירות: שימוש בחנקן נוזלי קשור לסיכונים כגון asphyxiation, כוויות קרות, אש באווירה עשירה בחמצן ופיצוץ. יש לעיין בנוהלי ניהול הסיכונים ובנוהלי העבודה הבטוחים של המוסד שלך.
    1. מריכוז קריסטל המחושב בשלב 2.1.9, להתאים את הריכוז כדי 10 7 גבישים / מ"ל ידי דילול מדגם; או על ידי pelleting את הגבישים ב XG 4,000 במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge, התאמת נפח הסופי על ידי הסרת supernatant, ו resuspending בעדינות גבישים.
    2. אם דוגמאות נועדו להיות קפוא מראש, לקרר את השולח יבש או דיואר עם חנקן נוזלי. הכן את צלוחיות או pucks, לפי הצורך, וכן לקרר אותם עם חנקן נוזלי.
    3. Resuspend גלולה קריסטל וליישם 0.5 טיפה μL של גבישים על micromesh ידי pipetting. השתמש meshes 700 מיקרומטר עם 25-מיקרומטר מרובעחורים כנקודת מוצא. שטח הרשת אינו קריטי אבל שטח גדול יותר מספק גבישים יותר לכל רשת מוביל איידוי איטי במהלך ההכנה. גודל החורים ייתכן שיהיה צורך להתאים את גודל הגבישים גדול מ 25 מיקרומטר. אם נדרש עבור מחקרים שיטתיים, רשתות mexes זמינים כדי להקל על סריקת רשת שיטתית במהלך איסוף הנתונים.
    4. הסר את רוב הנוזל עודף על ידי סופג עם פתיל נייר. הגבישים צריכים להתפשט באופן שווה על הרשת, בלי לגעת זה בזה. חזור על שלב 3.1.1. עבור אופטימיזציה של ריכוז המדגם. המשך במהירות ולא להסיר יותר מדי של הנוזל. בהיעדר cryoprotectant, הנוזל מתאדה במהירות עם הסיכון של יצירת גביש מלח ו / או הפסד של הסרט.
    5. הוסף cryoprotectant: פיפ 0.5 μL של פתרון של 50% אתילן גליקול במים על הרשת (הרכב cryobuffer הוא להיות מותאם המדגם, הצעות אופטימיזציה של cRyoprotectant ניתן למצוא בהתייחסות 30 ). הסר את הנוזל עודף על ידי סופג עם פתיל נייר. לעומת השלב הקודם, כאן הסרט הנותר של ממס צריך להיות דק ככל האפשר כדי להפחית את ההשפעות פרלקסה כי לסבך את תהליך היישור בין הגביש, את נתיב הקורה ואת goniometer; וכן למזער את הרקע הנגרם על ידי פיזור של צילומי רנטגן על ידי נוזל בנתיב הקורה.
    6. מיד פלאש מגניב את המיקרושים בחנקן נוזלי ולהעביר את הבקבוקון או דיסקוט רובוט, ולאחר מכן לשולח יבש או dewar לאחסון.
  3. הכנת מיקרומטר עם תאים המכילים קריסטל
    זהירות: שימוש בחנקן נוזלי קשור לסיכונים כגון asphyxiation, כוויות קרות, אש באווירה עשירה בחמצן ופיצוץ. יש לעיין בנוהלי ניהול הסיכונים ובנוהלי העבודה הבטוחים של המוסד שלך.
    1. מעבירים את התאים ממוינים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. מבוסס על התא cאוניות שנרשמו על ידי סדרן התא, להתאים את הריכוז ל 10 7 תאים / מ"ל ​​על ידי דילול המדגם עם PBS; או על ידי גלולה התאים ב 150 xg במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר microcentrifuge, התאמת נפח הסופי על ידי הסרת supernatant, ו resuspending בעדינות את התאים.
    2. מערבבים את התאים עם נפח שווה של פתרון כחול trypan (0.4% w / v) לריכוז סופי של 0.2% w / v.
    3. אם דוגמאות נועדו להיות קפוא מראש, לקרר את השולח יבש או dewar למטה עם חנקן נוזלי. הכן את צלוחיות או pucks, לפי הצורך, וגם מגניב אותם עם חנקן נוזלי.
    4. בעדינות resuspend התאים 0.5 μL pipet של תאים מיון על מיקרומטר.
    5. הסר את הנוזל עודף על ידי סופג עם פתיל נייר. התאים צריכים להתפשט באופן שווה על הרשת, בלי לגעת זה בזה. אם לא באמצעות cryoprotectant (שלב 3.3.6), הסרט הנותר של הממס צריך להיות דק ככל האפשר כדי להפחית את ההשפעות פרלקסה מסובךE תהליך של יישור בין הגביש, את נתיב הקורה ואת goniometer; וכן למזער את הרקע הנגרם על ידי פיזור של צילומי רנטגן על ידי נוזל בנתיב הקורה.
    6. לחלופין, להוסיף cryoprotectant לתאים: פיפ 0.5 μL של 50% אתילן גליקול, 50% פתרון PBS על הרשת. ההרכב של cryobuffer הוא להיות מותאם למדגם; הצעות אופטימיזציה של cryoprotectant ניתן למצוא בהתייחסות 30 . הסר את הנוזל עודף על ידי סופג עם פתיל נייר, משאיר רק סרט דק של ממס.
      הערה: השמטת שלב הקריופרוטציה לא שינתה את איכות עקיפה של קרני X כאשר גבישים של polyhedrin נותחו ב cellulo , בעוד צעד זה היה נדרש עבור גבישים מטוהרים 20 . זה חל רק על הדגירה של תאים עם פתרון cryoprotectant; המדגם עדיין צריך להיות מנותח ב 100K כדי למזער את ההשפעות של נזק קרינה על גבישים.
    7. מיידיAtely flash- מגניב את המיקרושים בחנקן נוזלי ולהעביר בקבוקון או רובוט דיסק, ולאחר מכן על השולח יבש או דיואר אחסון, לפי הצורך.

איסוף נתונים

הערה: פרמטרים המשמשים לאיסוף נתונים ניתנים כמדריך וצריכים להיות מותאמים לכל סוג קריסטל וקו בינכרוני.

  1. איסוף נתונים על microfocus berystline crystallography (ראה התייחסות 7 עבור רשימה של beamlines microfocus ומאפיינים שלהם). אם זמין, השתמש קרן collimated התואמת את הגודל של גבישים.
  2. עבור Phasing ניסיוני על ידי יחיד אורך גל שיטה חריגה פיזור (SAD), לאסוף על אנרגיה למקסם את האות חריגה של אטום כבד של בחירה. כדי להשתמש בשיטת החלפה מרובה איזומורפית (MIR), לאסוף מעל האנרגיה של קצה קליטה מתאים עבור אטום כבד של בחירה (זמין ב http://skuld.bmsc.washington.edu/scAtter / AS_periodic.html).
  3. לאחר טעינת הרשת על goniometer, להתחיל על ידי מרכוז את micromesh עם נתיב קרן באמצעות פנים על (קמור בצד) ו בצד על הכיוונים. לאחר מכן, כשהמיקרומה פעילה, כוונן את היישור על-ידי יישור מרכז נתיב אופקי מסוים של המיקרוש (לדוגמה, התחל עם החלק המרכזי). ואז לאסוף נתונים לאורך נתיב אופקי זה עם רק התאמות קלות כדי יישור. אם זמין, להשתמש במרכז מבוסס על rastering במינון נמוך עקיפה קרני ה- X עבור כוונון עדין היישור (להתייעץ עם איש הקשר המקומי על beamline synchrotron).
    הערה: כמו כמות מוגבלת של נתונים ניתן לאסוף על microcrystals עקב נזק קרינה (בדרך כלל, 10 עד 30 תמונות עם תנודה 1 °), בתיאוריה הגביש רק צריך להיות מיושר עם נתיב קרן עבור 10-30 מעלות. עם זאת, חשוב כי היישור הוא מדויק כמו גביש יכול בקלות על ידי החמיץ על ידי microbeam (בדרך כלל collimated כדי diametאה של ~ 10 מיקרומטר או קטן יותר).
  4. איסוף נתונים עקיפה עד עקיפה הוא איבד בשל נזק לקרינה. עבור קריסטלים של polyhedrin, זמן החשיפה של 10 שניות משמש בדרך כלל עבור תנודה 1 ° עבור השטף של כ 3.6 x 10 11 פוטונים / s ב 13 keV עם גלאי CCD (מנה סך <30 MGy). בצע אופטימיזציה של הגדרות אלה בהתאם לקווי הטלפון ולטבע של הגביש המשמש. בפרט, מינון נמוך וחתך דק מומלץ לגלאי רנטגן פיקסל.
    הערה: אם באמצעות אסטרטגיה תאית , התאים מוכתמים כחול טריפאן יופיע כמו נקודות כחולות על רקע תמיכה, מה שהופך אותם קל יותר ליישר אל הקורה. אם microbeam collimated יש בערך באותו גודל כמו התאים (~ 10 מיקרומטר), כל הגבישים הכלולים בתא יהיה מואר בו זמנית. עבור תאים המכילים microcrystals מרובים, זה מוביל תצפית של דפוסי השתברות מרובים, אשר יכול להיות קשה לעבד. עם זאת, diFfraction מאחד הגבישים נוטה לעתים קרובות לשלוט על דפוס עקיפה והוא באינדקס מועדף במהלך עיבוד הנתונים. עבור beamlines עם קרן רנטגן קרן קטנה באופן משמעותי כי התא, rastering נמוך מאוד רנטגן שטף (> 95% הנחתה) יש להשתמש במרכז על גבי גביש אחד לפני איסוף הנתונים.
  5. המשך אל גביש הבא במסלול.
  6. לאחר שכל הגבישים של הנתיב נבדקו, המשך לנתיב הבא וחזור על תהליך היישור. המשך עד שנאספו נתונים מספיקים או כל הגבישים נבדקו.
    1. ודא כי הנתיבים שעובדו מזוהים בבירור כך גבישים לא החמיצו או ירו פעמיים (אם יש צורך, לצייר סקיצה). בדרך כלל, כחול טריפן הופך צהוב לאחר התא כבר מוקרן, אשר עשוי לשמש כסמן.

figure-protocol-3
איור 5 : אסטרטגיה איסוף נתונים מ דוגמאות על תמיכה Micromesh. ( א ) אסטרטגיה של איסוף נתונים לנתיב; יישור נעשה בתחילת כל נתיב (נקודות) ונתונים נאסף לאורך הנתיב. ( ב ) תקריב של טריפאן מוכתם כחול, תא המכיל קריסטל על רשת, כפי שניתן לראות על המסך beamline microcrystallography. ( ג ) תקריב של polyhedra מטוהרים על רשת, כפי שניתן לראות על המסך microcrystallography beamline. רשת הריבועים הם 25 מיקרומטר x 25 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. עיבוד נתונים

הערה: כאן, אנו מזכירים רק בקצרה את השלבים של עיבוד נתונים ספציפיים ספציפיים microcrystallography, שבו נתונים גבישים מרובים הם התמזגו. מאמרים מצוינים רבים הםזמין תיאור עיבוד נתונים לעומק 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 וקביעת מבנה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה.

  1. בחר את הגביש עם רזולוציה עקיפה הטובה ביותר ואיכות כנקודת התייחסות.
  2. באופן אינדיבידואלי תהליך כל גביש באמצעות חבילות קריסטלוגרפיות סטנדרטיות כגון HKL-2000 31 , Mosflm 32 , או XDS 33 . כדי להבטיח נזק קרינה לא להידרדר את איכות הנתונים, לבחור בקפידה את התמונה האחרונה עם נזק קרינה מקובל. קריטריונים להקטנת הנזק קרינה מוגזמת הם ספציפיים של כל סוג גביש, בפועל עיבוד מטרת הניסוי. עבור phasing של גבישים BmCPV1 polyhedrin, נתונים נמחק פעם האות ל- nO / <σ (I)> לכל תמונה ירדה מתחת ל -2, או שה- R סיים עלה על 50% כפי שדווח על ידי HKL-2000 31 .
  3. עבור כל קריסטל, להגדיר את מגבלת רזולוציה ומספר מסגרות עיבוד מחדש עם הפרמטרים הנכונים, כדי למנוע שילוב נתונים עם אות קטן או לא.
  4. קנה מידה ומזג נתונים מן הגבישים הטובים ביותר לקריסטל הייחוס באמצעות חבילות סטנדרטיות כגון Scalepack ב- HKL-2000 31 , SCALA ב- CCP4 34 , 35 או XSCALE ב- XDS 33 . מוסיפים את הנתונים מן הגבישים השונים בהדרגה תוך מעקב אחר האיכות הגלובלית של מערך הנתונים, באופן אידיאלי עד שהמערך מגיע לשלמות מקובלת (> 95%). לדחות גבישים המציגים איזומורפיזם עניים עם גביש הטוב ביותר / התייחסות כפי שזוהו על ידי הבדלים פרמטרים התא היחידה ואת המסכן R מיזוג / כיכר מרובע לכל תמונה. אם יותר מדי נתונים באיכות טובהאל תדרג את הגבישים (קריסטל), השתמש בתוכנה כמו BLEND 36 שמבצעת קיבוץ היררכי כדי להגדיר את השילוב הטוב ביותר של מערכי נתונים כדי להתמזג.
    הערה: בקבוצות חלל מסוימות יש לבדוק את אפשרויות האינדקס החלופיות כך שיתאימו לקריסטל הייחוס.
  5. המשך לשלב ניסיוני, תחליף מולקולרי או חידוד באמצעות חבילות קריסטלוגרפיות סטנדרטיות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סקירה של שתי שיטות חלופיות לקביעת מבנה באמצעות microcrystals vivo מוצג ( איור 1 ). Polyhedra יכול בקלות להיות מטוהרים על ידי sonication ו צנטריפוגה. בשל הצפיפות שלהם, הם יוצרים שכבה בתחתית הצינור מתחת לשכבת פסולת שניתן להסיר על ידי pipetting ( איור 3 א ו 3 ב ). המדגם הוא נתון אז כמה סיבובים של sonication ו שוטף עד לרמה מספקת של טוהר הוא הגיע כפי שנשפט מן היבט לבן ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מספק שתי גישות לנתח microcrystals במטרה להקל על ניתוח של גבישים קטנים מאוד, כי היה להתעלם בעבר.

צעדים קריטיים לטיהור microcrystal
הפרוטוקול המוצג כבר אופטימיזציה באמצעות Bombyx מורי CPV1 polyhedrin לידי ביטוי בתאים Sf9 כמערכת מודל. עם זאת, ב microcrystals vivo להציג השתנות גדולה בהתנגדות מכנית. לדוגמה, Chedpsin B מחטים דמויי מחט הגדלים בתאי חרקים נוקש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים היו רוצים להודות Chan-Sien Lay על מתן תמונות של microcrystals מטוהרים, דניאל אריקסון וטום Caradoc-Davies לתמיכה בקו mx2 של סינכרוטרון האוסטרלי, ו קתרין פלנגן ואנדרו פריגה ממכון FlowCore באוניברסיטת מונאש עבור שלהם לא יסולא בפז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי Sf9Life Technologies
SF900-SFM מדיוםחרקים Life Technologies
1 L בקבוק תרבית תאיםThermofisher Scientific
Shaking Incubator לתרבית תאי חרקיםEppendorf
50 מ"ל צינורות חרוטייםפלקון
עם דליי נדנדה ל 50 מ"ל צינורותאפנדורף
סוניקטור מצויד בבדיקה 19 מ"מMSE Soniprep 150 
שקופיות זכוכיתהמפטון מחקר
HemacytometerSigma-Aldrich
Propidium iodideThermofisher Scientific
BD Influx תאים סדרן רשתות BD Biosciences
Hampton Heavy AtomHampton Research
MicrocentrifugeEppendorf
MicromeshMitigen700/25 מציעות משטח גדול יותר. ניתן לרכוש רשתות אינדקס למחקרים שיטתיים.
פתיל ניירMitigenניתן לשנות את גודל פתיל הנייר לזרימה אופטימלית. זה יהיה תלוי במידה רבה באופי הגבישים וחומר ההקפאה המשמשים.
אתילן גליקולסיגמא-אולדריץ
טריפן כחולLife Technologies
MX2 מיקרו-פוקוס אלומהסינכרוטרוןרשימה של קווי אלומה מיקרו-פוקוס זמינים ניתן למצוא ב- Boudes et al. (2014) השתקפויות על ההיבטים הרבים של חלבון
מיקרוקריסטלוגרפיה. כתב העת האוסטרלי לכימיה 67 (12), 1793– 1806,
doi:10.1071/CH14455.
צנטריפוגה רשתות ' אוסטרלי

מקורות

  1. Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
  2. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 0(2014).
  3. Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
  4. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2 (0), e01345(2013).
  5. Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
  6. Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
  7. Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
  8. Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
  9. Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
  10. Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
  11. Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
  12. Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
  13. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451(2015).
  14. Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
  15. Gallat, F. -X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).
  16. Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
  17. Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
  18. Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
  19. Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
  20. Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
  21. Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
  22. Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).
  23. Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
  24. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
  25. Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
  26. Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
  27. Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
  28. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
  29. Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
  30. Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
  31. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
  32. Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).
  33. Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).
  34. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
  35. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).
  36. Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
  37. Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
  38. Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).
  39. Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
  40. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463(2016).
  41. Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
  42. Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
  43. Nass, K. Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XMicrofocus BeamlineMicro Mesh Mounting

מאמרים קשורים