מאמר זה מתאר שני תוספים ImageJ חדשניים לניתוח 'שעון סריקה' תמונה. תוספים אלה להרחיב את הפונקציונליות של התוכנית הבסיסית Visual 6 הבסיסית, והכי חשוב, להפוך את התוכנית זמינה לקהילת מחקר גדול על ידי bundling אותו עם ImageJ חינם תמונה ניתוח תוכנה החבילה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול סריקה השעון לניתוח התמונה הוא כלי יעיל לכמת את עוצמת פיקסל הממוצע בתוך, בגבול, ומחוץ (רקע) סגור או מקוטע באזור בצורת קמור של עניין, מה שמוביל את הדור של אינטגרלי אינטגרלי פיקסל אינטגרלי, פרופיל אינטנסיביות. פרוטוקול זה פותח במקור בשנת 2006, כמו תסריט ויזואלי בסיסי 6, אבל ככזה, זה היה הפצה מוגבלת. כדי לטפל בבעיה זו ולהצטרף לאחרונה המאמצים האחרונים על ידי אחרים, אנו המרה את השעון המקורי לסרוק קוד פרוטוקול לתוך שני מבוססי Java plugins תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין ניתוח תמונות תוכניות כמו ImageJ או פיג 'י ImageJ. יתר על כן, תוספים אלה יש כמה פונקציות חדשות, להרחיב עוד יותר את טווח היכולות של הפרוטוקול המקורי, כגון ניתוח של אזורים מרובים של עניין ערימות התמונה. תכונה זו של התוכנית הוא שימושי במיוחד ביישומים בהם חשוב לקבוע שינויים הקשוריםלזמן ולמיקום. לכן, ניתוח סריקה של השעון של ערימות של תמונות ביולוגיות עשוי להיות מיושם על הפצת Na + או Ca ++ בתוך תא בודד, כמו גם ניתוח של פעילות הפצה ( למשל , גלי ++ Ca) באוכלוסיות של סינפטי מחובר או פער צומת-מצמידים תאים. כאן, אנו מתארים את השעון החדש plugins לסרוק ולהראות כמה דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.
מבוא
מטרת עבודה זו היא להציג פרוטוקול סרוק השעון כי הוא ללא פלטפורמה חופשית זמין לכל חוקר מעוניין בסוג זה של ניתוח התמונה. פרוטוקול סריקה השעון פותחה במקור בשנת 2006 1 , במטרה לשפר את השיטות הקיימות של כימות פיקסל עוצמת בתוך קמור בצורת אזורים של ריבית (ROI), שיטה שבה יש יכולת אינטגרטיבית טובה יותר ברזולוציה מרחבית משופרת. במהלך הרכישה, פרוטוקול ברצף אוספת מספר רב של פרופילים אינטנסיביות פיקסל רדיאלי, סרוקים ממרכז ROI לגבול שלה, או למרחק קבוע מראש מחוץ ההחזר על ההשקעה לצורך מדידה של עוצמת "פיקסל" הרקע. הפרוטוקול מסמן את הפרופילים לפי רדיוס התא, הנמדד בכיוון הסריקה. לכן, המרחק מהמרכז לגבול ROI של כל סריקה רדיאלית בודדת הוא תמיד 100% של סולם X. לבסוף, התוכנית ממוצעת אלה אינדיבידואליםאל פרופילים לתוך אינטגרל אחד אינטגרלי פרופיל פיקסל אינטנסיביות. בגלל קנה המידה, פרופיל פיקסל בעוצמה מתכוון, המיוצר על ידי פרוטוקול "שעון סריקה", תלוי לא בגודל ROI ולא, בתוך גבולות סבירים, על הצורה ROI. שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה, או במידת הצורך, ממוצעים או חיסור של פרופילים של החזרים ROI שונים. הפרוטוקול מאפשר גם תיקון של אינטגרל פיקסל אינטנסיביות פרופילים, של כל אובייקט עבור רעש רקע, על ידי חיסור פשוט של עוצמת הממוצעת של פיקסלים הממוקמים מחוץ לאובייקט. למרות שזה נבדק רק דגימות ביולוגיות, פרוטוקול שלנו מספק תוספת ערך אחרים הקיימים כלי ניתוח התמונה המשמשים מחקרים של תמונות של תהליכים פיסיקליים או כימיים מסודרים סביב נקודת המוצא (כגון דיפוזיה של חומרים ממקור נקודה ) 1 .
עם זאת, המגבלה העיקרית של השיטה המקורית ניתוח התמונה היה כי הפרוטוקול היה dev(VB6) (קוד, ולכן, זה היה תלוי בפלטפורמה וקשה להפיץ (המחייב VB6). כדי להתמודד עם בעיה זו להצטרף למאמצים דומים לאחרונה על ידי חוקרים אחרים 2 , אנו המרה VB6 שעון סריקה תוכנית קוד לתוך שני התוספים מבוססי ג 'אווה, תואם NIH בחסות ו בחופשיות זמין קוד פתוח ו פלטפורמה עצמאית ניתוח תמונות תוכניות, ImageJ 3 ו פיג' י ImageJ 4. יתר על כן, תוספים אלה יש עכשיו כמה פונקציות חדשות להרחיב את היכולת של פרוטוקול המקורי כדי לעבד ROIs מרובים ערימות תמונה.יישומים רבים ניתוח התמונה אינם ידידותיים למשתמש, לגבי ביצוע ניתוח סטטיסטי של אובייקטים מרובים, ולכן, לעתים קרובות רק נתונים נציג מוצגים.עם תוסף רב סריקה Clock ImageJ, ניתן להקל על ניתוח של אובייקטים מרובים בו זמנית.הערכה סטטיסטית חזקה של נתוני מיקרוסקופ,לגבי הפצה עוצמת האות בתאים בודדים / אובייקטים, כעת אפשרי עם תוסף זה plugin. כאן, אנו מתארים את התוספים סריקה השעון ולהראות דוגמאות של היישומים שלהם בניתוח התמונה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. התקנת תוכנה
- התקן את הגרסאות העדכניות ביותר של Java ארוזות או ImageJ או פיג'י ImageJ כפי שמומלץ באתרים המתאימים (ראה טבלת חומרים עבור קישורים לאתרים המתאימים). בטקסט שלהלן, שתי התוכניות נקראות "ImageJ".
- העתק "Clock_Scan-1.0.1 צנצנת" ו "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" קבצי תוסף באמצעות הקישור בתנאי חומרים השולחן ולהדביק אותם בספרייה תוסף ImageJ. לחלופין, השתמש באפשרות "Plugins | Install plugin" כדי להתקין קבצים אלה לאחר שמירתם בכונן הקשיח של המחשב.
2. ניתוח סריקה השעון
- תוסף שעון רגיל ( איור 1 ):
- השתמש ImageJ "קובץ | פתח" הפקודה בתפריט לפתוח תמונה של עניין.
- לחץ על 'מצולע' כלי, או 'בחירת שורה מקוטע'ולאחר מכן לצייר על התמונה כדי לתאר את ההחזר על ההשקעה כולה או קטע של אזור זה. ראה איור 1 A עבור דוגמה לבחירת מצולע (מתאר מקווקו פנימי).
הערה: ניתן להשתמש גם בכלי בחירה אחרים, הזמינים בתוכנה (בחירה מלבנית, סגלגלה וקו חופשי). - בחר "Plugins | שעון סריקה" מהתפריט כדי לפתוח את חלון שעון רגיל סריקה חלון קופץ חלון אפשרות. שים לב כי פקודה זו תפתח גם את החלון ROI מנהל עם המתאר הוסיף באופן אוטומטי אליו.
- השתמש בחלון אפשרות התוסף כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- סקור ושנה את קואורדינטות X ו- Y של מרכז ההחזר על ההשקעה (מחושב אוטומטית כקואורדינטות של מרכז המסה הפיזית) באמצעות פסי גלילה או שינוי הערכים בתיבות הקלט המתאימות. ראה איור 1 ב .
- תלוי כמה אזור הרקע מחוץ אובייקט שוUld להיות מכוסה על ידי סריקה, להתאים את גבולות הסריקה באמצעות סרגל הגלילה "מגבלת סריקה". ראה איור 1 א .
הערה: מגבלת הסריקה היא המספר החלקי המייצג עד כמה הסריקה צריכה להתקדם מעבר לגבולות האובייקטים בכל כיוון נתון; ערך ברירת המחדל הוא 1.20, המציין כי אורך הסריקה יהיה 20% יותר מאשר רדיוס האובייקט בכיוון של סריקה; ראה איור 1 A , קו מקווקו החיצוני). - לשנות את הפלט של תוסף באמצעות "רדיוס אמיתי", "לחסר רקע", "הקוטב המרה" ו / או "העלילה עם סטיית תקן" תיבות.
- לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפלאגין. ראה איור 1 C-H .
הערה: דוגמאות לפלט של הפרוטוקול עם "חלקת עם סטיית תקן" ו "פולאר המרה" או "רדיוס אמיתי" ו "פולאר transfאו "אופציות שנבחרו בתרשים 1 C ו - 1D ותרשים 1 E - ו 1F , בהתאמה, שים לב כי סטיית תקן החישוב (SD) מייצגת את השונות בין סריקות אינטנסיביות של פיקסלים רדיאליים בודדים של האובייקט. אורך "בחלון התוסף, המציג את המידע על אורך החזר ROI שנמדד בפיקסלים.
- ב שנוצר "שעון סריקה פרופיל מגרש", השתמש בפקודה "רשימה" כדי לשרטט ערכים המוצגים בשני, X ו- Y עמודות של נתונים עבור תמונות בקנה מידה אפור ב X ו 4 עמודות Y של נתונים עבור תמונות RGB, אשר Y0, עמודות Y1, Y2 ו- Y3 יהיו מלאות בעוצמת פיקסל הערוץ בעוצמת צבע אינטגרלית ואישית (אדום, ירוק וכחול).
- מספר ROI השעון סריקה תוסף - עבודה עם ROI מרובים ( איור 2 ):
- פתח תמונה המכילה החזר ROI מרובה.
- פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על "Analyse | Tools - ROI Manager".
- ברצף מתאר (ראה שלב 2.1.2) ולהוסיף כל החזר ה- ROI למנהל ROI על ידי לחיצה על "הוסף" בחלון מנהל החזר ROI; לעשות זאת עבור כל ההחזר על ההשקעה בתוך התמונה. השתמש בפקודה "ניתוח | מדידה" אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין.
- ראה איור 2 A עבור דוגמה לבחירות מרובות של קוים מפוצלים ואיור 2 E עבור דוגמה לבחירות מצולמות מרובות.
- בחר "Multi Clock Scan" בתפריט "תוספים" כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות.
- השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- במידת הצורך, אפס את מגבלת הסריקה בהתאם לשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20.
- אם יש צורך, בחר את optיון לשרטט את ממוצע השעון לסרוק פרופיל עם סורגים SD על ידי סימון "מגרש עם סטיית תקן" התיבה. ראה איור 2 C ו- D.
הערה: ערכי ה- SD המחושבים מייצגים וריאציה בין פרופילי סריקה לשעון אינטגרלי של אובייקטים שונים. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על "מספר החזרים ROI שנבחרו". - לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפרוטוקול.
- ב שנוצר "שעון סריקה פרופיל מגרש", השתמש בפקודה "רשימה" כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון "ערכי מגרש". עיין בחלון חלון "Multi Clock Scan Scan" (חלונית מרובת סריקה של שעון) עבור הגדרת עמודה לפי ערוץ צבעוני.
- שים לב כי החזרים ROIs הם ממוספרים ואת השעון שלהם סריקה פרופילים עבור כל ערוץ צבע נתון הם זממו באותו רצף שבו ROIs תוארו והוסיף "מנהל ROI".
- מולTiple ROI שעון סריקה תוסף - עבודה עם מחסנית תמונה ( איור 3 ):
- פתח תמונה מחסנית של עניין.
- פתח את מנהל החזר ROI על ידי לחיצה על "Analyse | Tools - ROI Manager".
- מתאר את החזר ה- ROI של התמונות בתוך הערימה והוסף אותו למנהל החזר ROI כמתואר בשלבים 2.1.2 ו -2.2.3. השתמש בפקודה "ניתוח | מדידה" אם ערכי החזר ה- ROI הם בעלי עניין.
- בחר "Multi Clock Scan" בתפריט "תוספים" כדי לפתוח את חלון האפשרויות המוקפצות.
- השתמש בחלון אפשרות הפרוטוקול כדי לבצע את הפעולות הבאות.
- אפס את מגבלת הסריקה כמתואר בשלב 2.1.4.2; ערך ברירת המחדל הוא 1.20.
- בחר את האפשרות לשרטט את פרופיל הסריקה הממוצעת של השעון באמצעות סרגלי SD על ידי סימון התיבה 'חריץ סטנדרטי'.
הערה: ערכי ה- SD המחושבים יציגו וריאציה בין מופעים שונים של האובייקט שנבחר בתמונה של התמונהCk. כמו כן, שים לב לקו בחלון התוסף המציג מידע על "מספר התמונות בערימה". - לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הפרוטוקול.
- בחלון "שעון סריקה של פרופיל שעון", לחץ על "רשימה" כדי לשרטט את הערכים המוצגים בחלון "ערכי שטח", כאשר מספר העמודה Y מייצג את מיקום התמונה בתוך הערימה - 1.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התמונות המשמשות כאן לצורך האיור, נלקחות מתוך מסדי נתונים שנוצרו במהלך התא הקודם שלנו ביולוגיה רקמות ביולוגיות 5 , 6 , 7 ו מן המוח אלן המוח אטלס 8 . שני plugins נבדקו בהצלחה באמצעות ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 ו פיג 'י ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66 סביבת התוכנית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שעון סריקה פרוטוקול: פרוטוקול סריקה השעון הוא כלי מהיר ופשוט של ניתוח התמונה. היתרונות של פרוטוקול זה, לעומת הקיים גישות משותפות של ניתוח תמונה (כגון ליניארי עוצמת פיקסלים סריקה או חישוב של עוצמת פיקסל הממוצע של ההחזר על ההשקעה), תוארו פרטים בפרסומים קודמים 1 , 9 . בקצרה, פרוטוקול זה מאפשר את הדור של אינטגרל אינטגרלי אינטנסיבית אינטנסיבית פרופילים על ידי כימות עוצמת הפיקסלים הממוקם במרחקים שונים ממרכז ROI ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
תודות
אנו מודים לד"ר טניה מריץ וד"ר פביאן Feutlinske (מכון לייבניץ של פרמקולוגיה מולקולרית, ברלין, גרמניה) לחלוק איתנו את הגירסה של Fuji ImageJ שעון סריקה תוסף ומעורר השראה לנו לפתח את הגירסה של התוכנית. אנו מודים גם לד"ר פריץ מלצ'רס (המחלקה לפיתוח לימפוציטים, מכון מקס פלנק לזיהום ביולוגיה) על רשותו להשתמש בתמונות ממסד הנתונים של המחלקה שלו לצורך בדיקה ושיפור של התוסף. תמיכה: המרכז עבור מדעי המוח טרנסציונל; מענק NIH: P30-GM110702-03.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מחשב | כל תואם | לתוכנה המפורטת להלן | |
| ImageJ או Fiji ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ או https://fiji.sc/ | מצורף עם Java 1.8 ומעלה |
| תוספי סריקת שעון | תוכנה חינמית | https://sourceforge.net/projects/clockscan/ | Clock_Scan-1.0.1 jar ו-Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar |
| Origin 9.0 OriginLab | נורת'המפטון, מסצ'וסטס, ארה"ב | תוכנית זו שימשה ליצירת כמה גרפים של נתוני סריקת השעון המקוריים. ניתן להשתמש בכל תוכנה גרפית אחרת לביצוע פונקציה זו |
מקורות
- Dobretsov, M., Romanovsky, D. "Clock-scan" protocol for image analysis. Am J Physiol Cell Physiol. 291, 869-879 (2006).
- Feutlinske, F., Browarski, M., Ku, M. C., et al. Stonin1 mediates endocytosis of the proteoglycan NG2 and regulates focal adhesion dynamics and cell motility. Nat Commun. 6, 8535(2015).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Dobretsov, M., Hastings, S. L., Stimers, J. R. Non-uniform expression of alpha subunit isoforms of the Na+/K+ pump in rat dorsal root ganglia neurons. Brain Res. 821, 212-217 (1999).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Dobretsov, M., Pierce, D., Light, K. E., Kockara, N. T., Kozhemyakin, M., Wight, P. A. Transgenic mouse model to selectively identify alpha3 Na,K-ATPase expressing cells in the nervous system. Society for Neuroscience. , Online Program No. 123.01/B54 1(2015).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., Ao, N., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Romanovsky, D., Mrak, R. E., Dobretsov, M. Age-dependent decline in density of human nerve and spinal ganglia neurons expressing the alpha3 isoform of Na/K-ATPase. Neuroscience. 310, 342-353 (2015).
- Campbell, J., Singh, D., Hollett, G., et al. Spatially selective photoconductive stimulation of live neurons. Front Cell Neurosci. 8, 142(2014).
- Yuryev, M., Pellegrino, C., Jokinen, V., et al. In vivo Calcium Imaging of Evoked Calcium Waves in the Embryonic Cortex. Front Cell Neurosci. 9, 500(2015).
- Qiao, M., Sanes, J. R. Genetic Method for Labeling Electrically Coupled Cells: Application to Retina. Front Mol Neurosci. 8, 81(2015).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
