מאמר שיטה

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55824

⸱

15 בספטמבר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacological Therapies Unit, Research Institute for Rare Diseases, Institute of Health Carlos III

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנדותל כלי הדם שולט בחוזקה ליקוציט גיוס. ליקוציט לקוי extravasation תורם למחלות דלקתיות. לכן, בחיפוש אחר הרומן יסודות ההפעלה אנדותל תקינה יש צורך לעצב משופרת טיפולים עבור הפרעות דלקתיות. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה מקיפה לאפיון הרומן הרגולטורים אנדותל היכולות לשנות ליקוציט סחר בעת דלקת.

תקציר

שכבת אנדותל חיוני לשמירה על הומאוסטזיס בגוף על ידי שליטה פונקציות שונות. ויסות התגובה דלקתיות על ידי השכבה אנדותל חיוני להילחם ביעילות נגד מזיקים תשומות וסיוע בשחזור של אזורים פגועים. כאשר תאי אנדותל נחשפים סביבה דלקתית, כגון הרכיב החיצוני של הממברנה חיידקים גראם שליליים, ליפופוליסכריד (LPS), הם אקספרס ציטוקינים פרו-דלקתיים מסיסים, כמו Ccl5, Cxcl1 ו- Cxcl10, ויפעיל הפעלה של מחזורי לויקוציטים. בנוסף, הביטוי של מולקולות אדהזיה E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1 על פני אנדותל מאפשר את האינטראקציה והצמדות לויקוציטים מופעל את שכבת אנדותל, בסופו של דבר את extravasation לעבר הרקמה מודלק. בתרחיש זה, הפונקציה אנדותל חייב להיות בחוזקה מוסדר כי הפעלה מוגזמת או פגומה בלשכת הגיוס ליקוציט עלול לגרום הפרעות הקשורות דלקתיות. מאז רבים של הפרעות אלה אין טיפול יעיל, חובה לחקור אסטרטגיות מקוריות עם דגש על שכבת כלי הדם. אנו מציעים מקיף מבחני שימושיות החיפוש של הרומן הרגולטורים אנדותל המשנים ליקוציט פונקציה. אנחנו מנתחים את הפעלת אנדותל באמצעות ביטוי ספציפי מטרות מעורב בגיוס ליקוציט (כגון, ציטוקינים, נוגדנים, מולקולות אדהזיה) עם מספר טכניקות, לרבות: (תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת RT-qPCR), במערב-כתם, flow cytometry והצמדות מבחני. גישות אלה לקבוע פונקציה אנדותל בהקשר דלקתיות, שימושי מאוד לביצוע מבחני המיון כדי לאפיין את הרומן הרגולטורים דלקתיות אנדותל שנמצאים ערך פוטנציאלי עבור תכנון אסטרטגיות טיפוליות חדשות.

מבוא

דלקת היא תגובת ביולוגי מועיל נגד מדבקים, עם המטרה הגדולות כדי לחסל את המחלה ותיקון רקמות שנפגעו. בתנאים מסוימים, כגון דלקות כרוניות או מחלות אוטואימוניות, דלקת לא נפתרת. במקום זאת, יש לתגובה חריגה עם חדירה מתמשכת של לויקוציטים, וכתוצאה מכך לתגובה החיסונית ממושך שמובילה נזק לרקמות, פיברוזיס, אובדן של הפונקציה, כללי, נכות, במוות כמה מקרים של המטופל. הפרעות אלה אנושי, ממוין כמו מחלות דלקתיות, כל לערב את כלי הדם עבור הפקד ליקוציט extravasation1,2.

תאי אנדותל לשחק תפקיד מהותי בוויסות התגובה דלקתיות על ידי שליטה ליקוציט סחר. כאשר שכבת אנדותל חשוף מתווכים דלקתיים כגון LPS, אנדותל מנוחתו מפעיל, מבטא ציטוקינים פרו-דלקתיים (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, וכו '), מולקולות אדהזיה (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1) הטובה. גיוס של מחזורי לויקוציטים לאתר זיהום. לויקוציטים טענתי על ידי ציטוקינים שפורסמו אז לתווך מתגלגל ואינטראקציה עם השכבה אנדותל באמצעות עמיתיהם דבק כתב: PSGL-1 בחירת שמלות, α4β1 אינטגרין VCAM-1 של אינטגרין αLβ2 ICAM-1. לבסוף, לויקוציטים נודדים על פני להערכת לכיוון המוקד של דלקת3.

התפקיד החיוני של אנדותל בוויסות התגובה דלקתיות הוכח על עכברים ששונו גנטית כדי לבטא את קולטן LPS, קולטן דמוי אגרה 4 (TLR4), רק על תאי אנדותל. בעלי חיים אלה אנדותל-TLR4 הצליחו להגיב כדי דלקת בתיווך LPS וכדי לזהות את הזיהום שנוצר לאחר חיסון חיידקים, וכתוצאה מכך להשיג רזולוציה זיהום והישרדות ברמות דומות כמו עכברים פראי סוג4 , 5.

עבור מסלול מוסדר אנדותל תגובה דלקתית, אותו יש כבר הניחו כי עיכוב בשלבים מסוימים של האינטראקציה ליקוציט-אנדותל כתוצאה צמצום הגירה טראנס-אנדותל, פרוגנוזה טובה יותר עבור מחלות דלקתיות הקשורות. למעשה, מספר אסטרטגיות מיקוד האינטראקציה הפעלה, ליקוציט-אנדותל אנדותל עוצבו כדי לעכב את extravasation של תאים חיסוניים לטיפול הפרעות דלקתיות6,7.

בדו ח זה, אנו מתארים קבוצה יסודית של שיטות in vitro לקשרי לאפיין באופן מלא את הפעילות אנדותל בתגובה התקליטים גירוי דלקתי ותפקידו ליקוציט הפעלה והצמדות על שכבת כלי הדם. המודל תא אנדותל בשימוש כתב יד זה היה הקו תא אנדותל הריאות העכבר (MLEC-04), כפי שתואר על ידי. Hortelano et al. 8. שורת התאים MLEC ה-04 אומתה בספרות להיות מערכת המתאים ללמוד הפעלה אנדותל9,10. בהתבסס על תחומי המחקר, גישות אלה יכול להיות בקלות אקסטרפולציה בכל אנדותל או מערכות ליקוציט ופרופיל דלקתיות. לאחר הגדרת הפרמטרים אנדותל בתנאים שנבחר, המערכת באפשרותך לבדוק תרופות חדישות על הניסויים המוצע כדי להעריך את הפעלת כלי הדם. בהקשר זה דלקתיות, תאי אנדותל נבדק עם המתחם עניין ניתן להשוות את תנאי הבקרה של התאים, כל ההבדלים וכתוצאה מכך יכול לעדכן את התוצאה prognostic של התרופה על התפתחות והתקדמות של דלקת. לסיכום, אנו מציעים מערכת הרלוונטיים לאפיון מטרות חדשות סמים לתאי אנדותל, אשר יכולים להשפיע על העיצוב של טיפולים ספציפיים וסקולרית נגד מחלות דלקתיות הקשורות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים אנדותל

  1. תרביות רקמה מטופלים צלחות
    1. מעיל 100 מ מ תרביות רקמה צלחות עם ג'לטין 2.5 מ ל פתרון (בלוק, 0.1% ג'לטין במים מזוקקים) במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס; זה יכול להיות אומדן לתבנית טוב נדרש. האחות הפתרון ג'לטין ולהשאיר צלחות מילה נהדרת בשכונה תרביות רקמה.
  2. תנאים תרביות רקמה
    1. לטפח את התאים MLEC-04 בפנים החממה הביולוגית (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2). לגדל את התאים בתקשורת מלאה של Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני: תערובת מזין F-12 (DMEM/F-12) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg 100/mL (P/S).
    2. לספור את התאים בשיטה קאמרית סטנדרטי נויבאואר, ולהוסיף את התאים MLEC-04 הלוחות שטופלו ג'לטין 100 מ מ בתקשורת מלאה 10 מ"ל, על צפיפות נמוכה של 2-11 x 4 10 תאים/ס מ 2. לפצל את התאים 1:3 כאשר הם מגיעים למפגש.
      הערה: הדבר מתרחש בדרך כלל אחרי שלושה ימים בתרבות.
    3. תת-תרבות התאים ע י שטיפת הצלחות עם 10 מ"ל סטרילי פוספט Buffered מלוחים (PBS) ולאחר מכן על-ידי הוספת 2 מ"ל טריפסין-EDTA פתרון (0.25% טריפסין, 5 מ מ EDTA) ואת תקופת דגירה של 3 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. לעצור את התגובה טריפסין-EDTA ולשחזר את התאים על תנאי על-ידי הוספת מדיה מלאה 10 מ"ל. ספין למטה התאים (x 300 גרם, 5 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר הסלולר מדיה מלאה ו תת-תרבות כראוי.

2. טיפול LPS וכן

  1. צלחת התאים MLEC-04 בתקשורת מלאה-זרימה תת לתוך התבנית טוב הבאה: 7 x 10 5 תאים/טוב על לוחות 6-ובכן, 2.5 x 10 5 תאים/טוב על צלחות 96-ובכן.
  2. דגירה תרבות ש ח 6 בחודש חממה תא (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2). להחליף את התאים למדיה לא שלם (DMEM-F12, P/S) ולהשאיר לילה (ב) כדי לסנכרן וכדי להקטין את פעילות התא.
  3. מסיר את המדיה ולבדוק תרכובות הרומן תרופתי על ידי המקננת תאי אנדותל עם (או בלי) התרופה המדובר (למשל DT 10) מדולל בתקשורת לא שלם (30 דקות, 37 ° C); להוסיף 1.4 mL/במשך 6-ובכן צלחת או 0.14 mL/טוב עבור לוחות 96-ובכן).
  4. אתגר בתאים על-ידי הוספת LPS התקשורת דגירה (100 ננוגרם למ"ל, הריכוז הסופי) עבור תקופת הזמן שצוין בכל וזמינותו. השתמש PBS כפקד.

3. הערכה של פרופיל תעתיק על אנדותל מופעל על ידי RT-qPCR

  1. זרע MLEC-04 תאים על זרימה תת בתרבות 6-ובכן צלחות (7 x 10 5 תאים/טוב). תקופת דגירה של 6-אייץ ' (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2) ולהמשיך לאחר מכן לרעב סרום (דגירה ON).
  2. מסיר את המדיה ועל לטיפול (או לא להתייחס) תא אנדותל תרבויות עם התרופה עניין מדולל בתקשורת לא שלם (דגירה 30 דקות, 37 ° C); להוסיף 1.4 mL/במשך 6-ובכן צלחת (30 דקות, 37 ° C).
  3. אתגר בתאים על-ידי הוספת 100 ננוגרם למ"ל LPS התקשורת incubated (כפי שמתואר בשלב 2.3), דגירה עבור 6-אייץ לעצור את התגובה על ידי שטיפת פעמיים עם PBS קר ולשמור צלחות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה.
  4. החילוץ-RNA
    1. להפשיר את הצלחות ולהוסיף 1 מאגר החילוץ mL/טוב RNA (38% פנול ו- 0.8 מ' guanidinium isothiocyanate; ראה טבלה של חומרים). להשאיר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) תחת homogenate עצבנות ולאסוף צינורות 1.5 mL-
    2. להוסיף 200 µL כלורופורם, להתסיס בעדינות במשך 15 ס' Incubate למשך 3 דקות ב RT ו צנטריפוגה (11,600 x g, 15 דקות, 4 ° C).
    3. להעביר פאזה מימית עוד צינור 1.5 מ. לזרז RNA על-ידי הוספת אלכוהול איזופרופיל µL 500 ואחריו דגירה 10 דקות ב RT ולאחר מכן צנטריפוגה (11,600 x g, 4 ° C).
    4. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה עם 75% אתנול על-ידי מערבולת עצבנות ולאחר מכן צנטריפוגה (7,500 x g, 4 ° C).
    5. מילה נהדרת בגדר ו solubilize RNA 25 µL טהור H 2 O על ידי המקננת 10 דקות-55 מעלות צלזיוס RNA שמור ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה.
  5. כמות והטוהר של RNA
    1. לכמת את ריכוז ה-RNA על ידי מדידת ספיגת את המדגם-260 ננומטר בספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים).
    2. מידה ב- 230 nm ו 280 ננומטר כדי לקבוע את הטוהר רנ א.
      הערה: היחס ב 260/280 מציינת זיהום חלבון או פנול. יחס קרוב 2 מקובל. היחס במלון 260/230 מציין EDTA, פחמימות או פנול מזהמים. ערכים בין 2.0-2.2 מקובלים.
  6. RNA בדיקת תקינות
    1. לרוץ 2 µg של RNA הכולל ו- RNA סולם % 1.5 denaturing agarose ג'ל; להמחיש על מערכת תיעוד ג'ל (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: יחס של 2:1 ברורה וחדה 28S ו- 18S rRNA להקות מציינת של RNA ללא פגע. חלקית השפיל RNA פותר כמו מראה מרוח.
  7. RT-qPCR
    1. לסנתז DNA משלימים (cDNA) מ- RNA נטושים יחיד בעקבות התקן פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) 11-
  8. הערך ביטוי גנים מאת RT-qPCR
    1. להכין לתערובת תגובה עבור כל דגימה: לערבב 2 µL cDNA, 7 µL מתחם פלורסנט, 300 פריימר לפנים nM ו 300 ננומטר הפוכה פריימר (טבלה 1) ב הנפח הסופי של 13 µL, ולהוסיף הצלחת תגובה 96-ובכן (ראה טבלה של חומרים).
    2. לאטום את הצלחת עם מכסה אופטי דבק, צנטריפוגה (x 300 גרם, 1 דקות) ולהפעיל את התגובה על מערכת ה-PCR בזמן אמת (התחלה לוהטת 95 ° C עבור 20 s ואחריו 40 מחזורי: 95 ° C עבור 3 s ו- 60 ° C ל 30 s) (ראה טבלה של חומרים).
    3. לנתח את התוצאות על ידי כימות יחסית באמצעות השיטה השוואתי 2 -ΔΔCt עם חדרנית גנים גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) או phosphoprotein חומצי ribosomal P0 (36B4) 12 .

4. להעריך אנדותל להפעלה באמצעות Cytometry זרימה

  1. לטיפול תאי MLEC-04 בעקבות התנאים המתוארים בסעיף 2, להעריך את השינויים את החלבונים פני אנדותל מאת cytometry זרימה.
  2. ניתוק התאים לאחר 6 שעות של LPS גירוי עם השיטה טריפסין-EDTA המתוארים שלב 1.2.3, לשטוף עם התקשורת לא הושלמה ב-4 מעלות צלזיוס
  3. לספור את התאים בשיטה קאמרית נויבאואר, למקם תאים 10x10 4 u-96-ובכן לוחות. צנטריפוגה (x 300 גרם, 5 דקות), supernatant על ידי סיבוב 180 מעלות ביטול הצמדה של כף היד מלמעלה למטה, התאוששות מהירה למיקום המקורי.
  4. להוסיף 50 µL של הנוגדן שנבחר מדולל בתקשורת לא שלמה (10 µg/mL, הריכוז הסופי) לתאים, דגירה (30 דקות, 4 ° C).
  5. לרחוץ את התאים w פעמייםith התקשורת לא שלם בעקבות ההליך המתואר צעד 4.3, דגירה עם µL 50-µg/mL 10 של הנוגדן המשני המתאים בשילוב FITC או דומה המספר המשלים (30 דקות, 4 ° C בחלל האפל).
  6. לשטוף את התאים פעם אחת עם התקשורת לא שלם ולאחריה שטיפה PBS. לשחזר את התאים עם PBS 300 µL באמצעות טיפים פיפטה 1 מ"ל ומניחים cytometry צינורות.
  7. להעריך את הדגימות במערכת cytometry זרימה (ראה טבלה של חומרים). התאם את האוכלוסייה התא על ידי העבר לצד פיזור פרמטרים. שער האוכלוסייה של ריבית. להתאים את השערים בהתבסס על הפקד שלילי מתאי מודגרות עם שליטה isotype. לנתח את התוצאות כאחוז של תאים חיוביים או מתכוון עוצמת קרינה פלואורסצנטית 8.

5. להעריך אנדותל להפעלה באמצעות ווסטרן כתם

  1. זרע של אנדותל-זרימה תת ב 6-ובכן תרבות צלחות (7 x 10 5 תאים/טוב), להתייחס עם LPS כמתואר בסעיף 2. לנתח את הביטוי דלקתי חלבון באמצעות פרוטוקול תספיג הבאה.
  2. מפסיק את הגירוי LPS בנקודות זמן שונות התירי היבטים שונים של התגובה אנדותל:
    1. לברר את הפרופיל דלקתיות חלבונים אחרי 6 שעות של גירוי LPS.
    2. לקבוע את התא איתות כל 15 דקות תקופת 60 דקות.
  3. בשני המקרים, התגובה כביסה פעמיים עם PBS קר ולקבל לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד הדגימה.
    4. מאגר
  4. תאים Lyse והפקת חלבונים
    1. להוסיף 200 µL פירוק כדי מכל קידוח (1% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, 150 מ מ נתרן כלורי, רב-תכליתי נתרן 30 מ מ, 50 מ מ נתרן פלואוריד, מ מ 2.1 orthovanadate נתרן ב pH 7.6, בתוספת מעכב פרוטאז קוקטייל) (ראה טבלה של חומרים).
    2. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C תחת עצבנות, לגרד וולס עם טיפ פיפטה ולאסוף את homogenate צינורות 1.5 mL-
    3. Centrifuge הצינורות ב 11,600 x g ב-4 מעלות צלזיוס
    4. לאחסן את תגובת שיקוע צינורות mL 1.5 נקי ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד.
  5. למדוד ריכוז החלבון על ידי וזמינותו חומצה bicinchoninic בעקבות התקן פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים) 13.
  6. לפתור את µg 30 lysate עבור כל דגימה הכוללת חלבון בטכניקה סטנדרטית של 0.1% נתרן גופרתי dodecyl, 10% לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) 14. הפעל דגימות עם 10 מ מ β-mercaptoethanol (הפחתת תנאי) או בלי (תנאי שאינו בהפחתת) בהתאם הנוגדן המשמשים לזיהוי החלבון עניין.
  7. להעביר את החלבונים מופרדים הג'ל לזיהוי polyvinylidene difluoride (PVDF) העברת קרום עם גודל הנקבוביות מיקרומטר 0.45, באמצעות הליך סטנדרטי.
  8. לאחר העברה, לשטוף את הקרום פעמיים עם PBS, 0.1% ציטוזאן (PBS-T), לחסום אתרי קישור לא ספציפי על-ידי הוספת 20 מ ל 2% BSA מדולל ב- PBS-T phosphoproteins שאותרו או 5% שומן חלב יבש ב- PBS-T הכולל חלבונים, תחת עצבנות (90 דקות, RT).
  9. לדלל הנוגדן שנבחרו ב- 10 מ"ל המאגר חסימה המתאים-הריכוז המומלץ, דגירה הקרום מתחת עצבנות (ON, 4 ° C). לחלופין, למקם את הקרום שקיות אטומות ומשמש 5 מ של הנוגדן מדולל.
  10. ביום למחרת, לשטוף את הקרום שלוש פעמים (עודף PBS-T, 15 דקות, RT).
  11. Incubate הקרום מתחת עצבנות (30 דקות, RT) עם 10 מ"ל של הנוגדן משני כתב מאוגדים חזרת peroxidase (HRP) מדולל ב 1:10,000 במאגר חסימה המתאים.
  12. לרחוץ את הקרום שלוש פעמים תחת עצבנות (עודף PBS-T, 15 דקות, RT).
  13. דגירה הקרום עבור 1 דקות עם 0.1 מ"ל/cm 2 של chemiluminescence המצע משופרת peroxidase (ECL). מקם את הקרום סחוט בין שתי יריעות פלסטיק שקוף ולאחר להכניס אותו לתוך מערכת זיהוי chemiluminescence הכולל מצלמה Charged-Coupled התקן (CCD).
    1. להשתמש במצלמה של מצלמות כדי לזהות את האות והתוכנה שלה לתמונות רשומה עם התוכנית המצטברת (תמונות להציג אות שהצטברו אצל כל חשיפה של 30 לתקופה סה כ 15 דקות).
  14. לכמת את עוצמת הלהקה מאת densitometry באמצעות שימוש בתוכנה ImageJ הפרוטוקול המתואר במדריך למשתמש 15.
    1. פתח את הדגימה בתוכנה ImageJ ובחר את הלהקה עניין בכלי בחירה מלבנית.
    2. בחר כמו ליין הראשון, הקש על העלילה נתיבים כדי להשיג את החלקות פרופיל.
    3. מפריד את האזור של הפסגות עם הבחירה בקו ישר.
    4. למדוד את הגודל של כל הלהקה על ידי לחיצה על החלק הפנימי של כל שיא.
    5. מייצגים את התוצאות לגבי טעינת פקד חלבון (β-אקטין, טובולין, וכו ').

6. הערכת גורם אנדותל שוחרר מן ליקוציט להפעלה באמצעות מבחני אדהזיה

  1. להשיג את המדיה ממוזגים אנדותל.
    1. לטיפול תאי MLEC-04 כמצוין בסעיף 2, לאסוף את התרבות supernatant לאחר גירוי 24 שעות עם LPS (100 ng/mL).
    2. לאסוף את המדיה ממוזגים תאים שטופלו MLEC-04, צנטריפוגה (600 x g). לשמור את תגובת שיקוע ב- 0.5 מ ל aliquots ב-80 מעלות צלזיוס עד שימוש.
  2. Assay אדהזיה ליקוציט
    1. מעיל צלחות 96-ובכן עם µL 50/טוב של חלבונים מטריצה חוץ-תאית שנבחר מדולל ב- PBS (למעט קולגן, אשר הוא מדולל ב 0.1 M חומצה אצטית): fibronectin (1-10 µg/mL ), laminin (1-10 µg/mL), קולגן מסוג I (10-40 µg/mL). על חופשה ב 4 º C
    2. למחוק את המדיה מצופה, לחסום אתרי קישור לא ספציפי על וולס עם 150 µL הציבורית, 1% BSA להשבית-חום (1 דקות, 100 ° C) במשך 90 דקות ב- RT.
    3. לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS ולהוסיף µL של שנאספו בעבר אנדותל ממוזגים 100 מדיה (סעיף 6.1) הבארות.
      הערה: לוחות מוכנים עבור ביצוע וזמינותו אדהזיה.
    4. תרבות העכבר מונוציט-macrophage התא בשורה J774 חממה ביולוגי (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5% CO 2) עם רוזוול פארק אנדרטת מכון בינוני (RPMI), 10% FBS, 1% P/S.
      הערה: התאים J774 גדלים ההשעיה.
    5. לאסוף את התאים J774 לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה (x 300 גרם, 5 דקות). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר הסלולר עם 10 מ"ל סרום ללא מדיה. לספור את התאים בתוך תא Neubauer. Centrifuge התאים (x 300 גרם, 5 דקות), למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את התאים בתקשורת ללא סרום-15 x 10 4 J774 תאים לכל מדיה µL 50-
    6. הוסף 15 x 10 תאים 4 J774 לכל אחד טוב בתקשורת ללא סרום µL 50, תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C ואחריו 1 h ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תא 2 CO.
    7. לרחוץ הבארות פעמיים, בעדינות על-ידי הוספת PBS חמים; צנטריפוגה (300 x גרם, 5 דקות) ולמחוק את תגובת שיקוע על ידי הצמד 180° של כף היד מן העליון התחתון, התאוששות מהירה למיקום המקורי. לתקן את התא מצורףs על-ידי הוספת µL 100/טוב של 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS דגירה (10 דקות, RT).
    8. למחוק את המדיה בעדינות, permeabilize בעדינות את התאים עם מתנול 2% ב- PBS למשך 2 דקות ב RT. להשליך המדיה ואת כתם בתאים על-ידי הוספת µL 50/טוב של 0.5% קריסטל ויולט ב 20% מתנול עבור 90 s-RT.
    9. לשטוף את הצלחת עם שפע מים זורמים, למחוק את הנוזל העודף, אנו נותנים מילה נהדרת... הדו ח המצורף התאים על ידי מצלמה דיגיטלית מצמידים מיקרוסקופ אור-
    10. לדלל את התא צביעת על-ידי הוספת µL 100/טוב של 0.1 M סודיום ציטרט, 50% אתנול. למדוד ספיגת 545 ננומטר, מייצגים תוצאות כמו יחידות שרירותי של ספיגת או אחוז הדבקה על ידי שוקל 100% כמו תא אדהזיה הגיעו עד בארות מצופה עם ריכוז גבוה יותר של ליגנד

7. מבחן אנדותל להפעלה באמצעות ליקוציט-אנדותל אדהזיה שיתוף Assay

  1. לטיפול תאי MLEC-04 על 96-ובכן לוחות כמתואר בסעיף 2, דגירה עם LPS (6 שעות, 37 ° C).
  2. Fluorescently תווית J774 תאים עם אסתר Succinimidyl Carboxyfluorescein (CSFE).
    1. לשטוף J774 תאים ב- PBS בעקבות ההליך ב 6.2.5. ספירת התאים על ידי נויבאואר הקאמרית שיטה ו resuspend-עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל ב- PBS, BSA 0.1%-
    2. דגירה את התאים עם CFSE (5 מיקרומטר, הריכוז הסופי) עבור 20 דקות 37 ° C. הוסף 5 מ ל מדיה לא שלם, דגירה (5 דקות, 4 ° C).
    3. לשטוף פעם עם מדיה לא שלם, כמוסבר 6.2.5., resuspend ב- 15 x 10 4 תאים/100 µL והמשך שיתוף אדהזיה וזמינותו.
  3. לאחר הטיפול אנדותל, לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם מדיה לא שלם. הוסף תאים CFSE-J774 (15 x 10 4 תאים/100 µL) לכל אנדותל מצופים היטב. דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות ב 4 ° C ולאחריו 60 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
  4. לשטוף בעדינות, כפי שמתואר 6.2.7 הבארות. באמצעות PBS ומחוממת, ולדווח את הידבקות J774 על שכבת אנדותל משתי השיטות הבאות:
    1. Lyse התאים 0.1 M טריס-HCl pH 8.8, 1% מרחביות (100 µL טוב) ולמדוד אות CFSE-J774 על ידי fluorometry (עירור/פליטה = nm nm/517 492). מייצגים את התוצאות בתור יחידות שרירותי של עוצמת קרינה פלואורסצנטית או אחוז אדהזיה ביחס בקרה חיובית (אות מתאי סה כ הוסיף כדי מכל קידוח).
    2. לתקן את התאים 4% PFA ודוח את הקובץ המצורף של תאי CFSE-J774 אנדותל דמיין תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור/פליטה = nm nm/517 492).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הערכה של LPS-induced תא אנדותל הפעלת מאת RT-qPCR

התאים MLEC-04 סרום מורעבים היו מגורה על ידי 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור 6-אייץ ', בביטוי הגן אנדותל הוערכה באמצעות RT-qPCR על-ידי השוואת הביטוי של הפעלת סמנים למצב מנוחה. כפי שמוצג באיור 1A, התאים MLEC-04 מודגרות-LPS המושרה הביטוי mRNA של מולקולות אדהזיה שנבחר מעורב ליקוציט הגיוס במהלך התגובה דלקתיות (E-בחירת שמלות, VCAM-1 ו- ICAM-1). PECAM-1 שימש בקרה פ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול אנדותל זה מתאר טכנולוגיה stepwise היוצרת את היסודות לחקר מנגנוני הרומן מעורב בוויסות התגובה דלקתיות. גישות אלה מבוססים על המחקר של הפעילות אנדותל מגורה על ידי LPS ולהעריך את השלבים הקריטיים מעורב ליקוציט הגיוס במהלך לתגובה דלקתית, במיוחד: שחרור ציטוקינים אנדותל, אדהזיה אנדותל מולקולות אדהזיה הביטוי ולבנות על שכבת כלי הדם. ברגע הפרמטרים אנדותל מבוססים, המערכת באפשרותך לחפש תרכובות הרומן מעורב ברגולציה של הפונקציה אנדותל וכתוצאה מכך התקדמות דלקתיות. הסמים רגולטורית עלולה להיות עניין לשוק התרופות. התחזית העיקריים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad (MINECO) ודה אינסטיטוטו סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII) (מענק מספר IERPY 1149/16 א. ל; MPY 1410/09 ל S. Hortelano); על ידי MINECO דרך en Fondo Investigación דה סאלוד (FIS) (מעניקה מספרים PI11.0036 ו- PI14.0055 S. Hortelano). ס Herranz נתמכה על-ידי IERPY 1149/16 מ ISCIII.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ג'לטיןסיגמהG9391
DMEM-F12לונזהBE12-719F
סרום בקר עובריסיגמאA4503
פניצילין סטרפטומיציןלונזהDE17-602E
טריפסיןלונזהBE17-160E
EDTAסיגמאED2SS
LPSסיגמאL2880
TrizolSigmaT9424מאגר מיצוי RNA
איזופרופנולסיגמא33539
אתנול אבסולוטוPanreac1,310,861,612
טהור H2OQiagen1017979RNAse
AgarosePronadisa8020
כתם לג'ל אגרוזInvitrogens33102
SuperScript III ראשון גדילInvitrogen18080051ריאגנטים עבור RT-PCR
מהיר SYBR Green Master MixApplied Biosystems4385610כתם פלואורסצנטי עבור qPCR
מיקרו אמפר מהיר אופטי 96 בארמיושם ביו-מערכות4346906צלחות עבור qPCR
U-bottom 96 צלחות בארפלקון353072
שפופרות ציטומטריהFalcon352054
TX100Panreac212314פעילי שטח לא יוני
Tris-HClPanreac1,319,401,211
נתרן כלוריMerck1,064,041,000
נתרן פירופוספטסיגמא221368
נתרן פלואורידסיגמאS7920
נתרן אורתוואנדאטסיגמא13721-39-6
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמאP8340
פירס BCA ערכת בדיקת חלבוןפירס23225ריאגנטים לבדיקת חומצה ביסינכונית
ובטא;-מרקפטואתנולמרק805,740
קרום העברת PVDF, 0.45 ומיקרו; mThermo Scientific88518
Tween-20Panreac1,623,121,611פוליסורבט 20
PBSLonzaBE17-515Q
ECLMilliporeWBKLS0500
פיברונקטיןסיגמאF1141
למיניןסיגמאL2020
קולגן מסוג Iסיגמאc8919
חומצה אצטיתPanreac1,310,081,611
טריפן כחולSigmaT8154
ParaformaldehydeSigmaP6148
מתנולPanreac1,310,911,612
סגול קריסטלSigmaHT90132
נתרן ציטראטSigmaC7254
אתנול 96%Panreac1,410,851,212
CFSESigma21888
RPMILonzaBE12-115F
SDSBio-Rad161-0418
Infinite M200TecanM200Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000Bio-Rad2000מערכת תיעוד ג'ל
StepOnePlusמערכת AppliedBiosystems StepOnePlusqPCR
Analyzer 10Miltenyi BiotecAnalyzer 10ציוד ציטומטריה
ChemiDoc MPBio-RadMPמערכת זיהוי כימילומינסנציה
שםCompanyCatalog NumberComments
><חזקים>נוגדנים
PECAM-1BD Biosciences553370לשימוש בגיל 10 ומיקרו; גרם/מ"ל
ICAM-2Biolegend1054602לשימוש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל
E-selectinBD Biosciences553749לשימוש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל
VCAM-1BD Biosciences553330לשימוש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל
ICAM-1Becton Dickinson553250לשימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
נגד חולדות IgG-FITCJackson Immuno Research112-095-006לשימוש בגיל 10 ומיקרו; גרם/מ"ל
אוגר אנטי ארמני-FITCJackson Immuno Research127-095-160לשימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
Rat IgG isotyope controlInvitrogen10700שימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
אוגר ארמני בקרת איזוטיפ IgGInvitrogenPA5-33220שימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
P-Iκ &בטא;-ואלפא;איתות סלולרי2859שימוש ב-10 ומיקרו; גרם/מ"ל
&בטא;-ActinSigmaA5441לשימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
P-ERKאיתות תאים9101שימוש ב-10 ומיקרו; g/mL
נגד עכבר HRPGE HealthcareLNXA931/AEשימוש ב-1:10,000
נגד ארנב HRPGE HealthcareLNA934V/AGשימוש ב-1:10,000
נגד חולדות HRPSanta CruzSc-3823שימוש ב-1:10,000
ללא ראשון חומר MACSQuant

מקורות

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, Á, Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , Life Technologies. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013).
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Pierce BCA Protein Assay Kit. , Thermo Scientific. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017).
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. ImageJ User Guide. , ImageJ. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017).
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930(2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149(2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RT qPCRWestern BlotLPS

מאמרים קשורים