הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות

12.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55835

⸱

24 באוקטובר 2017

 ,  , 
1Department of Biochemistry, Emory School of Medicine

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול fractionation מקוצר העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות מתואר.

תקציר

במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול מקוצרת fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. ? הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) solubilizes ביעילות באופן מקורי מקופל חלבונים ברקמת המוח המאפשר את העשרת של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מתוך מגוון רחב של proteinopathies ניווניות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון, נוירודגנרטיביות ומחלות פריון. לשליטת האדם ורקמות המוח לאחר המוות לספירה היו הומוגני, sedimented על ידי ultracentrifugation בנוכחות sarkosyl להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס כולל פיפטות phosphorylated טאו, מרכיב מרכזי neurofibrillary קשרים לספירה. סופג המערב הפגינו המסיסות דיפרנציאלית של טאו phosphorylated צבור, החלבון דטרגנט מסיסים, מוקדם 1 אנטיגן אנדוזום (EEA1) ב AD המוח ובקרה. ניתוח פרוטיאומיה מבנית גם גילה העשרה של β-עמילואיד (Aβ), טאו, snRNP70 (U1 - 70 K), ו אפוליפופרוטאין E (ספקיות) ב sarkosyl-לא מסיס שברים של המוח לספירה בהשוואה לאלו של שליטה, בקנה אחד עם אסטרטגיות fractionation רקמות הקודם . לפיכך, פרוטוקול העשרה פשוטה זה הינו אידיאלי עבור מגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי חלבון פונקציונלי צבירת שיתוף מבחני פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה.

מבוא

מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), נוירודגנרטיביות (ALS) ומחלות של פריון הקשורים קשר הדוק הן proteinopathies מאופיין על ידי הצטברות הדרגתית של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס במוח. עם ליווי קוגניטיבית לסרב. 1 , 2 תכונה פתולוגית משותפת זו הוא חשב לשחק תפקיד מרכזי אטיולוגיה, פתופיזיולוגיה של אלה מחלות ניווניות. 2 אגרגטים אלה בדרך כלל מורכבים של סיבי עמילואיד פולימריים, אשר מורכבים של חוזרות יחידות של חלבונים misfolded מפגין צלב β-מבנה. 1 , 2 , 3 , 4 . מבחינה ביוכימית, אגרגטים עמילואיד הם עמידים מאוד בפני דנטורציה כימי או תרמי ו- solubilization,3 אשר מציג אתגרים ייחודיים על טיהור שלהם, ניתוח וללמוד באמצעות טכניקות מסורתיות הביוכימי. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 באופן לא מפתיע, השבר לא מסיס-אבקת חלבון הייתה המוקד של מחקרים רבים לתוך הפתופיזיולוגיה של מחלות ניווניות הקשורות ההצטברות של חלבונים misfolded. 6 , 12 , 13 , 14

טכניקות fractionation הביוכימי כבר נעזרו לעיתים קרובות כדי להעשיר את השבר דטרגנט-לא מסיס מן המוח לאחר המוות homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 באחת השיטות הנפוצות ביותר כרוך החילוץ רציפים של רקמת homogenates עם מאגרי וחומרי ניקוי של הגדלת לכתחילה, ואחריו ultracentrifugation מחיצות שברים מסיסים ובחלקם לא מסיסים. נפוץ fractionation רציפים פרוטוקול6,14 מערבת את המגון דגימות רקמה קפוא במאגר מלח נמוכה ללא דטרגנט (האם), כדורי לא מסיסים תוצאות ואז מופקים באופן רציף עם מאגרי המכילה מלח גבוהה, חומרי ניקוי ללא יונית, סוכרוז גבוהה, דטרגנטים יוניים, ולבסוף chaotropes כמו שתנן. 6 , 14 חסרון ברור מהפרוטוקולים fractionation רציפים הוא זמן ניכר ומחויבות לעבודה הדרושה כדי להשלים אותם. כולל המגון ultracentrifugation, פרוטוקול טיפוסי fractionation חמישה צעדים יכולה לקחת כמה שעות או אפילו ימים כדי להשלים. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, אגרגטים חלבון פיפטות רבים נותרים מסיסים בסך הכל, אבל ה19,החריפה תנאים20 רוב השברים שנוצר הם בעלי ערך מוגבל. כך, המדרגות fractionation פחות מחמירים ניצול ריכוז המלח גבוה ודטרגנטים ללא יונית הם במידה רבה מיותר.

מחקרים קודמים הראו כי הנוזל יוניים לאוריל-N-sarcosine (sarkosyl) הוא מועמד מצוין עבור פרוטוקול fractionation דטרגנט מפושטת של צעד אחר צעד. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 כמו חומר ניקוי denaturing, sarkosyl היא מחמירה מספיק כדי solubilize הרוב המכריע של חלבונים מקופלים מקורי במוח ללא solubilizing אגרגטים חלבון misfolded המורכב בטא עמילואיד (Aβ),6,11 טאו phosphorylated (pTau),6 זפת DNA מחייב חלבון 43 (TDP-43),14 אלפא-synuclein,12,13 scrapie,23 או U1 קטן הגרעין ribonucleoproteins (U1 snRNPs) כגון U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 כמו sarkosyl הוא פחות מחמירים יותר סולפט dodecyl בכל מקום anionic נתרן דטרגנט (מרחביות), שומרת על צורות oligomeric פחות חזקים של אגרגטים חלבון misfolded שלא יכול לעמוד טיפול מרחביות. 9

בעבר, תיאר לנו פרוטוקול דטרגנט-fractionation מקוצר להשיג תוצאות להשוות מתודולוגיות fractionation רציפים יותר מפרך. 5 על-ידי השמטת את השלבים fractionation מחמירים פחות, הצלחנו לפתח פרוטוקול נתיישב fractionation צעד אחר צעד העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות. 5 פרוטוקול מפורט זה המתוארים בזאת הוא גם מתאים למגוון רחב של יישומים ניסיוני החל סופג המערבי, מבחני מבוססי ספקטרומטר מסה פרוטאומיקס חלבון פונקציונלי misfolding, צבירת זריעה. 5 , 6 , 21

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

אתיקה במשפט: לכל רקמות מוח, התקבלו האלצהיימר אמורי ' s מחלות מחקר במרכז (ADRC) המוח הבנק. רקמות לאחר המוות נרכשו תחת פרוטוקולים לוח סקירה מוסדיים (IRB) תקין.

1. המגון ו Fractionation

  1. רקמות הבחירה
    הערה: קפוא רקמות לאחר המוות החזיתית מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי מקרים מאושרים של המודעה נבחרו מתוך אמורי ADRC המוח הבנק (n = 2). הערכה neuropathological פוסט-מורטם של הפצה פלאק עמילואיד בוצעה על פי האיחוד להקים רישום עבור אלצהיימר ' s המחלה למחצה כמותיים ניקוד קריטריונים 24, למרות סבך neurofibrillary פתולוגיה הוערך לפי מערכת הזמני braak. 16
    1. קבל קפוא רקמת המוח לאחר המוות מ בקרה בריאים (Ctl), באופן פתולוגי לספירה מקרים מאומתים. ניצול מיכלים של קרח יבש, מלקחיים, סכין גילוח, בלו ~ 250 מ"ג חלקים של החומר האפור של כל דגימה רקמה על הפנויה tared שוקל סירות, לטפל כדי למנוע את הרקמה מפשיר. להקליט את המשקל של כל פיסת להיות הומוגני.
    2. בלו ~ 250 מ"ג של החומר האפור באמצעות מלקחיים, גילוח על-ידי בדיקה חזותית כדי לאתר את הממשק בין החומר האפור החיצוני לבין חומר לבן פנימי. להימנע חומר לבן וחשוב יותר, כל כלי דם גדולים או אזורים מדם, קרומי המוח או מאטר מעידה. לשמור את הרקמה קפוא במהלך תהליך חיתוך על ידי עובדים במהירות והצבת לעתים קרובות הסירה במשקל עם רקמת המוח לתוך מיכלים פוליסטירן עם קרח יבש
    3. רושמות את משקל מדויק של החומר האפור טוחנות מ כל חתיכה קפוא באמצעות איזון האנליטי. חישוב הנפח של מאגר מלח נמוכה (LS) (ראה טבלה 1) לצורך המגון דאונס (5 מ ל/g או 20% w/v).
    4. 10 להכין מאגר מ ל LS עם 1 x מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל ולא צונן על קרח
    5. להסיר רקמות שנשקל והסירה במשקל קרח יבש והן הקוביות לחתיכות מ מ 2 x 2 בערך כמו זה מפשירה. העברת צינור מהמגן 2 מ"ל דאונס טרום מקורר על קרח
    6. הוסף 5 מ ל/g (20% w/v) מאגר מלח נמוכה כקרח (LS) עם 1 X מעכב פרוטאז, פוספטאז קוקטייל.
    7. Homogenize רקמת המוח על קרח באמצעות כ 10 קווים של סיווג גבוהות שהעקב A ו- 15 משיכות של סיווג נמוך שהעקב B.
    8. העברת homogenate כל צינור פוליפרופילן 2 mL באמצעות כוס פסטר פיפטה. תווית ברכבת התחתית עם “ תאנון ” (כולל Homogenate), הרקמה קייס המספר, homogenate נפח. Aliquot 0.8 מ לתוך צינור שכותרתו mL 1.5. כל homogenate עודף יכול להיות דומה aliquoted ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס
    9. כל 0.8 מ ל aliquot, להוסיף 100 µL כל של 5 M NaCl ו- 10% (w/v) sarkosyl ריכוזים של 0.5 M ו- 1% w/v, בהתאמה. לערבב צינורות היטב על ידי היפוך, דגירה על קרח במשך 15 דקות צינורות בתווית עם " ה-S " (סה כ Homogenate-Sarkosyl) כדי לציין homogenates פועלות sarkosyl-מאגר (טבלה 1).
    10. Sonicate כל שפופרת עבור s 5 3 פולסים במהירות של 30% משרעת על קרח (העוצמה המקסימלית = 40%) באמצעות בדיקה microtip.
    11. לקבוע ריכוז חלבון homogenates באמצעות החומצה bicinchoninic (BCA) assay 25 שיטת.
      הערה: ריכוז חלבון הממוצע של ה-S homogenates מוכן ב 5 מ ל LS לגרם של רקמות היא 15-20 מ"ג/מ"ל. Homogenates ניתן fractionated מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C עד השימוש.
    12. Homogenates ה-S לדלל כדי 10 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר סארק כקרח (טבלה 1) עם 1 x מעכבי פרוטאז, פוספטאז.
    13. להעביר 5 מ ג חלבון (0.5 מ ל) של כל אחד homogenate ה-S לתוך 500 µL פוליקרבונט ultracentrifuge צינורות, זוג-איזון עם סארק-buffer. לטעון צינורות לתוך טרום מקורר רוטור ultracentrifuge ב 180,000 x g למשך 30 דקות ב- 4 supernatants העברה sarkosyl מסיסים מעלות צלזיוס (S1) כדי 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-80 מעלות צלזיוס
      הערה: (שטיפת אופציונלי) µL להוסיף 200 סארק-המאגר כדי ultracentrifuge צינורות המכילים שברים דטרגנט-לא מסיס (P1) ועוקרות כדורי (P1) מהחלק התחתון של הצינורות ultracentrifuge באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.
    14. בקצרה את הדופק-ספין הפוך צינורות עבור s 2-3 (≤ 2,500 x g) ב- microcentrifuge כדי להעביר את החבילות (P1) ואת מאגר הצינורות 1.5 mL להלן. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) במאגר-סרק על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח בגדר מופרת.
    15. זוג-איזון, צנטריפוגה ב 180,000 x g למשך 30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס
    16. למחוק את תגובת שיקוע שטיפת אופציונלי (S2), דגירה כדורי sarkosyl-לא מסיס (P2) ב- 50-75 µL מאגר אוריאה (טבלה 1) עם 1 x תמונה (פרוטאז, פוספטאז מעכב קוקטייל) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי solubilize צניפה-
      הערה: מאגר אוריאה חמים לטמפרטורת החדר לפני השימוש כדי למנוע מרחביות משקעים. ליישומים הרגישים דטרגנט, להשמיט זמנים תוססים מהמאגר אוריאה ולשקול שטיפה בגדר לא מסיסים (P2) במאגר מלח נמוכה לפני resuspending במאגר שתנן.
    17. להעביר את כדורי resuspended (P2) צינורות 0.5 mL ולהשתמש קצר (1 s) microtip sonication-משרעת 20% (העוצמה המקסימלית = 40%) כדי באופן מלא solubilize כדורי.
    18. לקבוע את ריכוזי חלבונים מסיסים sarkosyl (S1) ו- assay לא מסיסים שברים (P2) באמצעות BCA את השיטה. להשתמש שברים אלה באופן מיידי או לאחסן ב- 80 ° C עד שימוש.

2. Immunoblotting

  1. המערבי סופג
    הערה: סופג המערבית בוצעה על פי הנהלים שדווחה בעבר עם שינויים קלים. 5 , 10
    1. 40 להכין דגימות µg סה כ homogenates (ה-S), סארק מסיסים (S1), סארק-לא מסיס שברים (P2) במאגר מדגם X Laemmli מרחביות-דף 1 עם 5 מ מ TCEP pH 7. דגירה בדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק
      2. דוגמאות
    2. טען ב- Bis-טריס precast 10-ובכן 4-12% מרחביות-דף ג'ל. Electrophorese-80 V על הסנטימטר הראשונה (10 דקות) ו 120 V עד לתום (60 דקות) או עד לצבוע מעקב מגיע לתחתית של הג'ל.
    3. להשתמש טריים גילוח וסכין ג'ל על פיצול-פתיחה בקלטת ג'ל טרומי. בעדינות לחתוך משם את קומבס ואת התחתון של הג'ל עם סכין גילוח טריים.
    4. Resuspend כדורי לא מסיסים (P1) 200 µl סארק-מאגר עם x 1 PIC על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
    5. העברת קרום ניטרוצלולוזה 0.2 µm באמצעות שיטת העברה יבש על מכונת blotting (ראה טבלת חומרים).
    6. לחסום את הקרום במאגר חסימה (BB) ללא Tween 20 למשך 30 דקות, ואחריו עם BB עם 0.05% 20 Tween (BB/T) למשך 30 דקות. לאחר חסימת, לשטוף את הקרום ב- TBS/T (0.1% Tween 20) עבור 5 דקות כדי להסיר עודפי מאגר חסימה.
    7. הכן דילולים 1:1,000 של נוגדנים ראשי pT231, טאו-2 (פאן טאו), AT8 ו EEA1 ב BB/T (0.05% Tween 20).
    8. תדגור על הממברנות בפתרון נוגדן ראשוני בין לילה ב 4 ° C עם עצבנות מעגלית לשטוף את הקרום ב- TBS/T עבור 3 x 15 דק
    9. בדיקה הקרום לדילול 1:20,000 שכותרתו fluorescently ליד-IR משני הנוגדן ב- BB/T עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך בשייקר. לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות ב- TBS/T ו- 2 x 5 min ב- TBS.
    10. לסרוק את הקרום באמצעות אינפרא מערכת-הגל המתאימים עירור (לדוגמא 700 nm (ערוץ אדום) עבור צבע אינפרא-אדום 680 עז העכבר אנטי איג (H + L) המשנית, 800 nm (ערוץ ירוק) עבור צבע אינפרא-אדום 790 החמור נגד אינץ ארנב IgG (H + L הדמיה ) משני).
    11. משתמש בתוכנת הדמיה לכמת עוצמות האות ולבצע מדידות densitometry לפי היצרן ' s הוראות, הבטחת אוטומטי-רקע הגדרת מוגדר ממוצע את הרקע כולו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול sarkosyl צעד אחר צעד מקוצרת-fractionation שימש להעשיר אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס של שליטה והמוח לספירה לאחר המוות (איור 1). חלבונים מן ה-S, S1, S2 ו- P2 שברים שנפתרו על ידי עמודים מרחביות, קבוע למשך 15 דקות Coomassie מאגר מקבע כחול ולאחריו מכתים עדין עם מאגר מוכתמים G-250 Coomassie כחול מבריק. הצעד resuspension הוא אופציונלי, מכיוון שהיו רמות לא לגילוי של חלבון השבר S2 (ראה 1.1.14). תספיג ניתוח (איור 2 א

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בזאת אנו להציג ולדון פרוטוקול דטרגנט-fractionation צעד אחר צעד מקוצר הרלוונטיים למגוון רחב של יישומים ניסיוני ועד ניתוח פרוטאומיקס מסה ספקטרומטר מבוססי חלבונים פונקציונליים misfolding מבחני אפילו השחרת המערבי. 5 , 6 , 7 , 10 מתודולוגיה זו היא אולי הכי יעיל כאשר נעשה שימוש כדי ללמוד proteinopathies ניווניות כגון אלצהיימר, ALS, מחלת הנטינגטון, פריון ומחלות של tauopathies שונים. בהשוואה לפרוטוקול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים ד"ר ג'ים בורסי, אלן Levey, היחידה לנוירולוגיה של אמורי, על הערות מועילות והצעות. עבודה זו מומן בחלקו על ידי האצת שותפות רפואה המענק (U01AG046161-02), אמורי האלצהיימר של מרכז המחקר של המחלה (P50AG025688) ואת הלאומי להזדקנות הענק (R01AG053960-01) ל- N.T.S. מחקר זה גם נתמך בחלקה על ידי הגרעין Neuropathology של המענק אמורי Neuroscience NINDS הליבה מתקנים, P30NS055077.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז, ללא EDTA (100X)קוקטייל מעכב פרוטאז ופוספטאז קוקטייל מעכב
סוניק מערכת דיסמברטור (אולטרסאונד)Fisher ScientificFB505110מיקרו-טיפ אולטראסוניקטור
אופטימקס TLX אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר361545רוטור אולטרה-צנטריפוגה מקוררת
TLA120.1בקמן קולטר362224רוטור אולטרה-צנטריפוגה
500 ul (8 x 34 מ"מ) צינורות פוליקרבונט,צינורות אולטרה-צנטריפוגה עבים של בקמן קולטר 343776 לרוטור TLA120.1
4X SDS מאגר דגימהתוצרת ביתתוצרת N/ASDS-PAGE
TCEP, pH ניטרליThermo Fisher77720חומר הפחתה
חוסם (TBS) מאגר תרמופישר37542מאגר
חוסם (TBS) מאגר חוסם + 0.05% Tween 20Thermo Fisher37543חוצץ חוסם ומדלל נוגדנים
4-12% ג'ל Bolt Bis-Tris Plus, 10 בארותThermo FisherNW04120BOXג'ל SDS-PAGE טרומי
MES SDS מאגר ריצה (20X)Thermo FisherB0002SDS-PAGE מאגר רץ
N-Lauroylsarcosine מלח נתרן (סרקוזיל)Sigma חומר ניקויL5777-50G
נוגדן נגד Tau-2 (פאן טאו)ChemiconMAB375נוגדנים
נגד פוספו-תראונין 231 נוגדן טאוMilliporeMAB5450נוגדנים
אנטי-פוספו-סרואין 202 ותראונין 205 נוגדן טאו (AT8)נוגדניםThermo FisherMN1020
נוגדנים אנטי-אנדוזום מוקדם 1 (EEA1)abcamנוגדניםab2900
Alexa Fluor 680 עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משניThermo FisherA21058נוגדנים
Alexa Fluor 790 חמור נגד ארנב IgG (H+L) נוגדן משניThermo FisherA11374נוגדנים
iBlot2 Dry Blotting SystemThermo FisherIB21001העברת ג'ל
iBlot2 Transfer Stacks, ניטרוצלולוז, מיניתרמו פישרIB23002העברת ג'ל
Aldrich נוגדנים

מקורות

  1. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
  2. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
  3. Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
  4. Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
  5. Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
  6. Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
  7. Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
  8. Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
  9. Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003(2014).
  10. Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
  11. Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
  12. Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
  13. Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
  14. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130(2006).
  15. Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
  16. Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
  17. Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
  18. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  19. Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
  20. Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
  21. Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
  22. Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15(2014).
  23. Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  24. Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
  25. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  26. Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
  27. Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Sarkosyl FractionationWestern BlotTau Phosphorylated Tau EnrichmentBCA Assay
העשרה של אגרגטים חלבון דטרגנט-לא מסיס מהמוח האנושי לאחר המוות
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.