מאמר שיטה

Neurobehavioral הערכות במודל של עכברים של פגיעה מוחית לפציעה Hypoxic-איסכמי Neonatal

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55838

⸱

24 בנובמבר 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

במאמר זה

סיכום

ביצענו חד-צדדית העורק הראשי סגר ביום כמחנכת CD 7-10-1 עכבר הגורים כדי ליצור מודל neonatal לפציעה hypoxic-איסכמי (איץ ' אי), חקר את ההשפעות של פגיעה מוחית HI. למדנו neurobehavioral פונקציות אלו עכברים לעומת עכברים רגילים שאינם המופעלים.

תקציר

אנו לבצע חד צדדית העורק הראשי סגר על עכברים CD-1 כדי ליצור מודל neonatal לפציעה hypoxic-איסכמי (איץ ' אי), חקר את ההשפעות של פגיעה מוחית HI neonatal על ידי לימוד neurobehavioral פונקציות אלה בעכברים לעומת שאינו מופעל (קרי, עכברים רגילה). במהלך המחקר, השתמשו בשיטה של אורז-Vannucci לגרום נזק מוחי HI neonatal בעכברים 7-10 (P7-10) יום לאחר הלידה. פעולת HI בוצע על הגורים על ידי העורק חד-צדדית מצדו וחשיפה היפוקסיה (8% O2 ו- 92% N2 ב 90 דקות). שבוע לאחר הניתוח, המוח הפגוע הוערכו בעין בלתי מזוינת דרך הגולגולת שקופה למחצה, היו מסווגים תת-קבוצות בהתבסס על העדר (קבוצת "אין פגיעה בקליפת המוח") או נוכחות (קבוצת "פגיעה בקליפת המוח") של פגיעה בקליפת המוח, כגון פגיעה בהאונה הימנית. בשבוע 6, neurobehavioral לערוך בדיקות בוצעו כדי להעריך את הפונקציות הקוגניטיביות ומוטוריים: הימנעות פסיבי פעילות הסולם (פט), הליכה, בדיקה של בדיקת חוזק אחיזה. המבחנים התנהגותית מסייעים בקביעת את ההשפעות של פגיעה מוחית HI neonatal ומשמשים במודלים אחרים של העכבר של מחלות ניווניות. במחקר זה, neonatal HI במוח פציעה עכברים הראה גירעונות מנוע שמשקף נזק האונה הימנית. תוצאות הבדיקה התנהגותית הרלוונטיים הגירעונות נצפתה בחולים אנושיים neonatal HI, כגון שיתוק מוחין או לחולי שבץ neonatal. במחקר זה, מודל העכבר של פגיעה מוחית HI neonatal היה הוקמה והראה דרגות שונות של גירעונות מוטוריים, פגיעה קוגניטיבית לעומת עכברים שאינם המופעלים. עבודה זו מספקת מידע בסיסי על המודל העכבר HI. MRI תמונות מדגימות את מתבטא בצורות שונות, מופרדים לפי חומרת נזק מוחי באמצעות בדיקות מוטוריות קוגניטיביות.

מבוא

פגיעה מוחית HI neonatal מתרחשת במהלך הילדות המוקדמים (כ שני חולים לכל 1,000 ילדים)1,2,3,4,5. מחקרים לגבי פגיעה מוחית HI neonatal חשובים, באמצעות הוקמה neonatal HI במוח פציעה עכבר דוגמן יכול להקל על ויוו מחקר פרה על פגיעה מוחית HI.

דגמי HI מסורתי משמשים על חולדות למבוגרים6. עבור המודל neonate, שיטת אורז-Vannucci משמש בדרך כלל על P7 חולדות7,8. עם זאת, מאז חולדות ועכברים הם שונה במקצת9,10, למרות שהם שניהם מכרסמים, ביצענו שיטה אורז-Vannucci שונה על CD-1 גורים-P7-10, בהתבסס על מחקרים קודמים שהראו כי P7-10 היא התקופה שמציעות oligodendrocytes ילדותי, המתאים האנושי מונח P011,12. המודל העכבר HI neonatal מוקמת דרך שניהם מצדו של העורק תרדמני חד צדדית את חשיפת העכברים היפוקסיה עם 8% חמצן ב- P7-10 גורים.

העכברים נתון ההליך הראה דרגות שונות של נגעים במוח באזור posterolateral של האונה הימנית. כדי לזהות את הגירעונות קוגניטיביות, מוטוריות, neurobehavioral הערכות על סמך את פאט, בוצעו הסולם הליכה, בדיקה של בדיקת חוזק אחיזה. ההבדלים בין שאינו מופעל (קרי, רגיל) ועכברים HI נותחו. עבודה זו מציגה מידע בסיסי על המודל העכבר HI. התמונות MRI להדגים את מתבטא בצורות שונות, מופרדים לפי חומרת הנזקים למוח באמצעות בדיקות מוטוריות קוגניטיביות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל החיות שוכנו בתוך כלוב רגיל (27 × 22.5 × 14 ס מ3) במתקן מוכרת על ידי האגודה מגוונת הסמכה של מעבדה חיה על עצמך (AAALAC) וקיבל מזון ומים ad libitum תחת לסירוגין 12-h/כהה מחזורים. המחברים עקב תקנות להגנת בעלי החיים, ואת ההליכים ניסיוני אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של Yonsei הספר לרפואה של אוניברסיטת (IACUC מס 2010-0252; 2013-0220).

1. עכבר מודל של פגיעה מוחית Neonatal HI

  1. עזים ומתנגד הגורים עם איזופלוריין.
    1. להכניס את הגורים (פחות מ 5) בתוך קופסת בהרדמת ולסגור את המכסה.
    2. להפעיל את המערכת בהרדמת למשך כ 15 דקות; להתאים את הדלק ואת איזופלוריין באמצעות מכונת הרדמה בראש הטבלה. התאם את זרימה חמצן כדי 1.5 ליטר לדקה התאם מאדה איזופלוריין ל- 3-5% עבור אינדוקציה של הרדמה.
    3. לאחר 15 דקות, להתאים את מאדה איזופלוריין ל- 1-2% לשם קיום הרדמה.
  2. שכב גור באופן מלא anesthetized תחת מיקרוסקופ לנתיחה (בטן בפני החוקר) ואבטח אותו עם סרט.
  3. עושים חתך ~0.7-mm בצוואר באמצעות מספריים מעוקר.
  4. בזהירות להסיר את רקמת שומן באמצעות מלקחיים סטיריליים ולחשוף את עורק התרדמה הימני חד צדדית.
  5. מאתרים ומפסיקים את עורק התרדמה הימני חד צדדית בתפר שנספג 5-0.
  6. תפר את החתך בצוואר 5-0 בתפר.
  7. מקם כל pup תא חם 37 ° C ובשפתיים לשעה עבור שחזור. לא תסגור את המכסה קאמרית.
  8. h 1 לאחר הניתוח, כאשר שהגורים ער לגמרי, סגור את המכסה קאמרית היפוקסיה ולא להקטין את רמות גז כדי ליצור תנאים ובשפתיים (8% O2 ו- 92% N2).
  9. לאחר 90 דקות של היפוקסיה, להחזיר את הגורים לכלובים.
  10. שבוע לאחר פגיעה מוחית HI, חזור על שלב 1.
    1. לאחר ההרדמה, לעשות חתך בקרקפת עם מספריים סטיריליים ומלקחיים לזהות את הנגע המוח באזור posterolateral של האונה הימנית.
      הערה: טיפול זה גורם היפוקסיה של הגורים. הנוכחות ואת מידת פגיעה מוחית בעכברים כל מוערך באופן חזותי בעין בלתי מזוינת דרך הגולגולת שקופה למחצה. כפי שנקבע על ידי הגודל או הנפח של שינוי צבע (קרי, הנגע המוח), הגורים מסווגים לקבוצות. אם אין פגיעה בקליפת המוח הגלויים, העכבר הוא מסווג לקבוצה "אין פגיעה בקליפת המוח". אם יש פגיעה בקליפת המוח הגלויים (קרי, פגיעה בהאונה הימנית), העכבר הוא מסווג לקבוצת "פגיעה בקליפת המוח". מאז סיווג של העכברים לקבוצות נעשה שבוע אחרי הניתוח, ניתן לשנות את קבוצות כאשר מורפולוגיות של הדגימות המוח מוגדרים בבירור בזמנו של הקרבה1,2,3, 4.

figure-protocol-1
איור 1: מידול neonatal פגיעה מוחית HI בעכברים.
(א) גור בן יום-שבע העכבר נותח, עורק התרדמה הימני חד-צדדית היה מאתרים. (ב) הגורים הונחו בתוך תא ובשפתיים במשך 90 דקות עם 8% O2 ו- 92% N2. (C, D ו- E) השכל עם פציעה HI neonatal הראה שונים חומרת הנזק, היו לקטגוריות בהתבסס על מידת הנזק. בשבוע 14, המוח התקבלו, נגעים היו דמיינו. (ג) תמונה של מוח מסווגים "אין קורטיקלית פגיעה". שני (ד) ו- (E) סווגו לקבוצת "פגיעה בקליפת המוח". (F, G ו- H) MRI נציג של (ג), (ד), ועכברים (E), בהתאמה. (ו) נזק בהיפוקמפוס מזוהה עם חץ צהוב, נגעים בהאונה הימנית גם מסומנים עם חיצים צהובים (G ו- H). גודל ברים = 1 מ"מ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. neonatal מבחנים התנהגותיים

הערה: כאן, הבדיקות התנהגותי בוצעו רוב בגיל 6 שבועות.

  1. פעילות הימנעות פסיבי.
    הערה: כדי להעריך תפקוד זיכרון מבוסס על למידה ההתרחקות גירוי aversive, טפיחה דרך-שלב שני-תא צריך להיות מתנהל13,14,15,16.
    1. הנח את העכבר לתוך תא בהיר של תיבת הסעות פרספקס (41.5 × 21 × 35 ס מ3) של מנגנון פאט.
    2. לאחר 30 s, פתח את הדלת גיליוטינה ולהקליט את זמן השהיה העכבר כדי להזיז לתוך התא כהה (עד 300 s).
    3. סגור את הדלת גיליוטינה כאשר כל ארבעת הגפיים של העכבר באופן מלא בתוך התא כהה.
    4. לנהל הלם חשמלי רגל (0.5 mA) עבור 2 s וחזור העכבר בכלוב.
    5. להחליף את העכבר בתוך התא מואר 24 שעות לאחר הלם חשמלי ברגל.
    6. לפתוח את הגיליוטינה דלת 10 s לאחר העכבר ממוקם באופן מלא בתוך התא מואר, ולהקליט את זמן השהיה העכבר כדי להזיז לתוך התא כהה (עד 300 s).
  2. סולם מהלך הבדיקה.
    הערה: סולם רונג מהלך הפעילות מאפשרת האפליה בין הפרעות עדין של המוטורית באמצעות שילוב איכותי כמותני מיומן הליכה17,18.
    1. הפעל את מצלמת וידאו.
    2. במקום עכבר בלוח התחלה של הסולם ולהתחיל מיד את ההקלטה.
    3. להקליט הוידאו, התמקדות הגפיים העכבר.
    4. עצור הקלטה כאשר העכבר נוגע הלוח האחרון של הסולם. חזור על המסע חזרה וושוב ארבע פעמים.
    5. לנתח את הקלטת וידאו, באופן ידני לספור את מספר מתעודות משלוח של כל forelimb, כדלקמן:
      1. לשחק ההקלטה של הווידאו במחשב במהירות איטית (0.1 x) ולספור את השלבים באופן ידני.
  3. בדיקת חוזק אחיזה.
    הערה: הבדיקה חוזק אחיזה מתבצעת באמצעות מד כוח אחיזה, הכולל מד מתח שכיבות למשוך.
    1. לתקן את המנגנון חוזק אחיזה על גבי לוח אקרילי.
    2. במקום עכבר בלוח אקריליק והחזק זנבו.
      1. להזיז את יד אוחזת בזנב כך העכבר יכול להגיע אחיזה החוט מתכת של המנגנון.
    3. לאפשר ניסויים מרובים עד העכבר אוחז חתיכת משולש של חוט מתכת (2 מ מ קוטר); הכוח שיא רשום באופן אוטומטי על-ידי המנגנון גרמים.
      הערה: השתמש בכוח שיא רשע שלושה ניסויים עבור ניתוח19,20,21.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כל הנתונים מבוטא זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). ההשוואה של משתנים בין שתי הקבוצות נערך באמצעות עצמאית או מזווג t-מבחן ב- SPSS תוכנת סטטיסטיקה. P-הערך < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית.

השכל עם פציעה HI neonatal הראה שונים חומרת הנזק ולא היו מסווגים בהתאם (איור 1C- E). המוח התקבלו בשבוע 14, נגעים היו דמיינו. איור 1C מראה מוח מסווגים מוח "אין פגיעה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

במחקר זה, אנו המושרה HI פגיעה מוחית ב עכבר P7-10 CD-1 neonatal, מזוהה הנגע המוח עם גירעונות קוגניטיביות, מוטוריות הרלוונטיים. במהלך הליך זה, חסימה של עורק התרדמה הימני חד-צדדית היה קריטי. בשלב זה, העורק יכול להיות פגום והוא נקרע. רוב הגורים שחוו את הקרע בעורק של מת. לעומת זאת, אם חוקרים מאתרים עוד וריד דם במקום עורק התרדמה הימני חד צדדית, המוח של הכלבלב נפגע רק במתינות, אין פנוטיפ משמעותי יכול להיות שנצפו24.

במחקר זה, בשל הבדלים עכברים, נפח הנגע, המוח היו מחולקת למספר ק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים יש אין אינטרסים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים קרן המחקר הלאומית (ה-NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), משרד המדע, הטכנולוגיה, רפובליקה של קוריאה, קוריאנית בריאות טכנולוגיית R & D הפרוייקט (HI16C1012), משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה, התוכנית לסיוע המחקר של הפקולטה "Dongwha" Yonsei מיוניברסיטי קולג לרפואה (6-2016-0126).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תא היפוקסיג'ונג דו ביו & Plant CoExperimental Builder
מכשיר PAT JeungDo Bio & Plant CoExperimental Builder
שלב הסולם הליכהJeung Do Bio & Plant CoExperimental Builder
SDI Grip Strength SystemSan Diego Instruments Inc.
מד חוזק אחיזהUgo Basile47200
מכשיר הרווארד מערכת הרדמה Fluovac הרווארד
קופסת אקריל
הרדמה כללית (איזופלורן 100 מ"ל)
CD-1 עכבריםאוריינט ושות', בע"מ
כחול ניילון מונו תפר לא נספג 5-0 50 ס"מAilee Co., Ltd.NB 521
IBM SPSS סטטיסטיקהIBMגרסה 23
קופסת הרדמה של מכשירי נוזל פראן (איזופלואורן) Hana Pharm. Co., Ltd.

מקורות

  1. Yager, J. Y. Animal models of hypoxic-ischemic brain damage in the newborn. Semin Pediatr Neurol. 11 (1), 31-46 (2004).
  2. Vannucci, R. C., et al. Rat model of perinatal hypoxic-ischemic brain damage. J Neurosci Res. 55 (2), 158-163 (1999).
  3. Im, S. H., et al. Induction of striatal neurogenesis enhances functional recovery in an adult animal model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuroscience. 169 (1), 259-268 (2010).
  4. Clowry, G. J., Basuodan, R., Chan, F. What are the Best Animal Models for Testing Early Intervention in Cerebral Palsy? Front Neurol. 5 (258), 1-17 (2014).
  5. Colver, A., Fairhurst, C., Pharoah, P. O. Cerebral palsy. Lancet. 383 (9924), 1240-1249 (2014).
  6. Levine, S. Anoxic-ischemic encephalopathy in rats. Am J Pathol. 36, 1-17 (1960).
  7. Rice 3rd, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  8. Lafemina, M. J., Sheldon, R. A., Ferriero, D. M. Acute hypoxia-ischemia results in hydrogen peroxide accumulation in neonatal but not adult mouse brain. Pediatr Res. 59 (5), 680-683 (2006).
  9. Brazel, C. Y., Rosti 3rd, R. T., Boyce, S., Rothstein, R. P., Levison, S. W. Perinatal hypoxia/ischemia damages and depletes progenitors from the mouse subventricular zone. Dev Neurosci. 26 (2-4), 266-274 (2004).
  10. Buono, K. D., et al. Mechanisms of mouse neural precursor expansion after neonatal hypoxia-ischemia. J Neurosci. 35 (23), 8855-8865 (2015).
  11. Rumajogee, P., Bregman, T., Miller, S. P., Yager, J. Y., Fehlings, M. G. Rodent Hypoxia-Ischemia Models for Cerebral Palsy Research: A Systematic Review. Front Neurol. 7 (57), 1-20 (2016).
  12. Hagberg, H., Peebles, D., Mallard, C. Models of white matter injury: comparison of infectious, hypoxic-ischemic, and excitotoxic insults. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 8 (1), 30-38 (2002).
  13. Wi, S., Yu, J. H., Kim, M., Cho, S. R. In Vivo Expression of Reprogramming Factors Increases Hippocampal Neurogenesis and Synaptic Plasticity in Chronic Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Neural Plast. 2016 (2580837), 1-11 (2016).
  14. Lu, Y., Christian, K., Lu, B. BDNF: a key regulator for protein synthesis-dependent LTP and long-term memory? Neurobiol Learn Mem. 89 (3), 312-323 (2008).
  15. Manabe, T., et al. Facilitation of long-term potentiation and memory in mice lacking nociceptin receptors. Nature. 394 (6693), 577-581 (1998).
  16. Alonso, M., et al. BDNF-triggered events in the rat hippocampus are required for both short- and long-term memory formation. Hippocampus. 12 (4), 551-560 (2002).
  17. Seo, J. H., et al. In Situ Pluripotency Factor Expression Promotes Functional Recovery From Cerebral Ischemia. Mol Ther. 24 (9), 1538-1549 (2016).
  18. Kim, M. S., et al. Environmental enrichment enhances synaptic plasticity by internalization of striatal dopamine transporters. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (12), 2122-2133 (2015).
  19. Lee, M. Y., et al. Alteration of synaptic activity-regulating genes underlying functional improvement by long-term exposure to an enriched environment in the adult brain. Neurorehabil Neural Repair. 27 (6), 561-574 (2013).
  20. Rha, D. W., et al. Effects of constraint-induced movement therapy on neurogenesis and functional recovery after early hypoxic-ischemic injury in mice. Dev Med Child Neurol. 53 (4), 327-333 (2011).
  21. Chong, H. J., Cho, S. R., Jeong, E., Kim, S. J. Finger exercise with keyboard playing in adults with cerebral palsy: A preliminary study. J Exerc Rehabil. 9 (4), 420-425 (2013).
  22. Chong, H. J., Cho, S. R., Kim, S. J. Hand rehabilitation using MIDI keyboard playing in adolescents with brain damage: a preliminary study. NeuroRehabilitation. 34 (1), 147-155 (2014).
  23. Seo, J. H., Yu, J. H., Suh, H., Kim, M. S., Cho, S. R. Fibroblast growth factor-2 induced by enriched environment enhances angiogenesis and motor function in chronic hypoxic-ischemic brain injury. PLoS One. 8 (9), e74405(2013).
  24. Washington, P. M., et al. The effect of injury severity on behavior: a phenotypic study of cognitive and emotional deficits after mild, moderate, and severe controlled cortical impact injury in mice. J Neurotrauma. 29 (13), 2283-2296 (2012).
  25. Cho, S. R., et al. Astroglial Activation by an Enriched Environment after Transplantation of Mesenchymal Stem Cells Enhances Angiogenesis after Hypoxic-Ischemic Brain Injury. Int J Mol Sci. 17 (9), 1-15 (2016).
  26. Tsuji, M., et al. A novel reproducible model of neonatal stroke in mice: comparison with a hypoxia-ischemia model. Exp Neurol. 247, 218-225 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MRI

מאמרים קשורים