אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

Colleen M. Garvey; Torin A. Gerhart; Shannon M. Mumenthaler

doi:10.3791/55844

Method Article

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

DOI:

10.3791/55844

⸱

June 30th, 2017

Colleen M. Garvey¹ , Torin A. Gerhart¹ , Shannon M. Mumenthaler¹

¹Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, University of Southern California (USC)

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו פרוטוקול חדש לחקר הדינמיקה האוכלוסייה הטרוקלולרית בתגובה הפרעות. כתב יד זה מתאר פלטפורמה מבוססת הדמיה המייצרת מערכי נתונים כמותיים לאפיון סימולטני של פנוטיפים סלולריים מרובים של אוכלוסיות הטרוסלריות בצורה חזקה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכים סלולריים הם מורכבים הנובעים משחק הגומלין בין סוגי תאים מרובים וסביבתם. קיימות ביולוגיה תא טכניקות לעתים קרובות אינם מאפשרים פרשנות מדויקת של משחק זה. באמצעות גישה כמותית מבוסס הדמיה, אנו מציגים פרוטוקול תוכן גבוהה לאפיון התגובות פנוטיפי דינמי ( כלומר מורפולוגיה שינויים, התפשטות, אפופטוזיס) של אוכלוסיות תאים הטרוגנית לשינויים גירויים סביבתיים. אנו מדגישים את היכולת שלנו להבחין בין סוגי תאים בהתבסס על עוצמת הקרינה או תכונות המורפולוגיה הטמון בהתאם ליישום. פלטפורמה זו מאפשרת אפיון מקיף יותר של התגובה subpopulation כדי הפרעות תוך ניצול זמן קצר יותר, כמויות קטנות יותר של ריאגנטים, ואת הסיכוי הנמוך יותר של שגיאה מאשר מבחני התא המסורתית ביולוגיה. עם זאת, במקרים מסוימים, אוכלוסיות תאים עשוי להיות קשה לזהות לכמת מבוסס על cellu מורכביםLar תכונות ידרוש פתרון בעיות נוספות; אנו מדגישים חלק מהנסיבות הללו בפרוטוקול. אנו מדגימים יישום זה באמצעות תגובה לתרופה במודל הסרטן; עם זאת, זה יכול בקלות להיות מיושם באופן רחב יותר על תהליכים פיזיולוגיים אחרים. פרוטוקול זה מאפשר אחד לזהות subpopulations בתוך מערכת תרבות משותפת ולאפיין את התגובה של כל אחד לגירויים חיצוניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבחני תאים מבוססי כבר workhorse במחקר בסיסי ופיתוח סמים הגדרות. עם זאת, המגבלות של מבחני תקן אלה הפכו בולטים יותר ויותר עם חוסר התאמה בין נתונים חוץ גופית לבין נתונים קליניים וכישלון של רוב התרופות לקבל אישור ה- FDA. כאן, אנו מציגים שיטה חדשה לשימוש הדמיה כמותית בו זמנית לנתח פנוטיפים heterocellular בתגובה לגירויים סביבתיים רלוונטיים, שיתוף המתרחשים.

מבחני מסורתיים המבוססים על תא המשמשים למדוד כדאיות התא כוללים: מבחני הרחקה כחול טריפאן, MTT / MTS, ו Annexin V-FITC זרימת cytometry מכתים. Trypan כחול מבחני הרחקה, בעוד פשוט וזול, דורשים מספר גדול של תאים, הם זמן רב, והם מושפעים לעתים קרובות על ידי המשתמש הטיה ¹ . MTT ו MTS מבחני בעקיפין למדוד כדאיות התא באמצעות מדידות של קצב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי. עם זאת, פעילות מטבוליתTy של תאים יכול להיות מושפע מתנאי תרבות שונים (כגון מדיה או ריכוז חמצן), אשר מוביל לתוצאות לא מדויקות ומונע סטנדרטיזציה על פני סוגי תאים ותנאים ² ^, ³ . חסרון גדול נוסף של טכניקות אלה הוא חוסר היכולת שלהם להבחין בין סוגי תאים מרובים - רוב המערכות הביולוגיות הן הטרוסלולרית. בעוד שיטות cytometry הזרימה יש את היכולת להבחין בין אוכלוסיות תאים מרובים, תוויות תאים נדרשים, הדגימה דינמי הוא מאתגר, וכאשר משתמשים בתאים חסיד, יישום זה הופך להיות זמן רב שגיאה נוטה.

פנוטיפים סלולריים חשובים אחרים, כולל שינויים מורפולוגיים, מתרחשים בתגובה לגירויים סביבתיים, אך אינם נלכדים על ידי מבחני תא מסורתיים. פרופילים תא פרופיל באמצעות אפיון מורפולוגי מיפוי הדמיון על פני דגימות הוא כלי רב עוצמה, משוחדת עם aכדי לספק תובנות חדשות לתוך היבטים רבים של מחקר בסיסי ו translational, כולל ביולוגיה תא בסיסי וגילוי סמים ⁴ . יתר על כן, מורפולוגיה תא הגידול הוצגה כדי לתאם עם תת סוגי הגידול ⁵ תוקפנות ⁶ . לפיכך, יש עניין רב ללמוד תכונות אלה הסלולר וכיצד הם מתייחסים perturbations סביבתיים ספציפיים. בנוסף, ניתן להשתמש בהבדלים בתכונות מורפולוגיות כדי להפלות בין subpopulations במערכות שיתוף תרבות. תאים תיוג fluorescently יש downfalls ( כלומר שינוי מאפייני התא הגלום, זמן רב) ולכן שיטות נוספות כדי לסווג סוגי תאים הם יתרון.

מיקרוסקופיה מבוססי הדמיה היא שיטה חלופית עבור פרופיל פנוטיפים הסלולר בצורה מרובעת, כמותית, וחזקה. בכתב יד זה, אנו מיישמים צינור הדמיה כמותי שלנו כדי להדגיש את evolutioדינאמיקה nary של אוכלוסיות תאים הטרוגניות בתוך הגידול. אנו מתמקדים באינטראקציה בין תאי סרטן ריאות לא-קטנים (NSCLC) ובין סרטן פיברובלסטים (CAF), סרטן השד הנפוץ ביותר שנמצא בגידולים. CAFs היו מעורבים ייזום הגידול, התקדמות, תגובה טיפולית; לכן, ביצוע מבחני פנוטיפי על תאים סרטניים בהעדר CAFs יכול להיות מטעה ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ . באופן ספציפי, הערכנו השפעות של CAFs על תאים סרטניים בתגובה ל- erlotinib, מולקולה קטנה המכוונת את ה- Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) המשמש לעתים קרובות בטיפול קליני ב- NSCLC. השתמשנו בפלטפורמת סינון תוכן גבוהה ובתוכנות ניתוח התמונה הנלוות שלה לצורך הערכה; עם זאת, בניסיון להפוך את המתודולוגיה לזמינה עבור חוקרים אחרים פיתחנו גם פרוטוקול במורד הזרם באמצעות תוכנת קוד פתוח:אנליסטים סלופרופיל ¹⁰ ו - CellProfiler ¹¹ . רוב מבוססי תמונה גבוהה תוכן מבחני ההקרנה מנותחים עם תוכנה ממוסחר ספציפי למודל מכשיר נתון. תוצאות קשה לשכפל במעבדות אחרות עם תוכנות שונות, כי האלגוריתמים הבסיסיים הם לעתים קרובות קניינית. באמצעות הצינור מבוסס התמונה, התפשטות תאים, מוות, מורפולוגיה של כל subpopulation של תרבות הטרוקלולרית בתגובה לטיפול תרופתי באמצעות פלואורסצנציה וגם מורפולוגיה מבוססי סיווג נמדדו. הפרוטוקול הבא מספק מתודולוגיה איתנה לחקר תהליכים תאיים מורכבים.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבות התא

הערה: כאן תגובות פנוטיפיות של תאים NSCLC (H3255) לסוכן EGFR מיקוד, erlotinib, כאשר שיתוף בתרבית עם fibroblasts הריאה (CCD-19Lu GFP) נחקרו. עבור אותו נתונים להגדיר, מבוסס על הקרינה מבוסס מורפולוגיה סיווג של שתי אוכלוסיות תאים (H3255 ו CCD-19Lu GFP) כדי להדגים את הקונקורדנס שלהם בוצע. עם זאת, יש להשתמש בשיטת סיווג אחת בלבד ויש לבחור אותה בהתאם ליישום.

הכן 500 מ"ל של RPMI-1640 בתוספת 10% חום FAB-inactivated ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין.
הערה: בינוני הצמיחה ותוספים ניתן להחליף כנדרש עבור סוגי תאים אחרים.
תאים תרבותיים 10 ס"מ ³ צלחות כמו אוכלוסיות טהור 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס ומעבר יחס המתאים בכל 3-4 ימים.

2. הכנת תאים

כדי להכין ההשעיה התא, להסיר cEll התקשורת לשטוף תאים עם 5 מ"ל 1X פוספט שנאגרו מלוחים (PBS).
לשאוב את PBS, מוסיפים 1 מ"ל של 0.05% טריפסין מחומם ל 37 מעלות צלזיוס ו דגירה של 5 דקות (או עד התאים הם כבר לא דבק צלחת) ב 37 ° C.
כדי לנטרל טריפסין, להוסיף 4 מ"ל של RPMI ל H3255 ו CCD-19Lu צלחות GFP ו pipet פתרונות התא לתוך 15 צינורות חרוטי מ"ל.
צנטריפוגה תאים ב XG 150 במשך 5 דקות ב RT.
לשאוב את supernatant ו resuspend תא כדורי 10 מ"ל של התקשורת RPMI צינורות חרוטיים כדי להתכונן זריעה.

3. ציפוי תאים

לספור את התאים כדי סטנדרטיזציה זריעה.
1. הפוך צינורות לערבב תאים בפתרון. פיפטה 10 μL של ההשעיה התא לתוך צינור microcentrifuge ולהוסיף 10 כחול טריפאן μL.
2. פיפטה 10 μL של פתרון זה לתוך תא ספירה שקופית להכניס לתוך מונה תא אוטומטי.
  הערה: שיטות אחרות לספירת תאים ( כלומר. הממוציטומטר).
3. חזור על ספירת התאים לפחות שלוש פעמים, או עד לספירות שהתקבלו עקביות.
תאים זרעים על צלחת רב
הערה: מספר הצלחות לזרע תלוי במספר נקודות הזמן שיוצגו. לחלופין, צלחת אחת ניתן מחדש הדמיה לאורך זמן אם התאים transduced עם היסטון -2B-GFP (או כתמים גרעיניים lentiviral יציבים אחרים המספקים פילוח גרעיני נאות).
1. זרע סך של 1,500 תאים / גם 100 μL של RPMI. הכן שלושה השעיות תא לצלחת שלוש אוכלוסיות תאים: H3255, CCD-19Lu GFP, ו 50% H3255 + 50% CCD-19Lu GFP. בצע כל בשלושה עותקים עם הגדרות צלחת זהה עבור כל נקודת זמן.
  הערה: צפיפות זריעה ראשונית צריך להיות מותאם לכל שורה התא וגודל הצלחת.
2. תאים זרע 3 x 96 צלחות היטב באמצעות פיפטה רב. דגירה תאים O / N ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ .

4. מינון סמים

הוסף DMSO כדי erlotinib אבקה לעשות פתרון הסופי erlotinib המניות של ריכוז 10 מ"מ.
הערה: התרופה יכולה להיות מוחלפת לפי הצורך.
לדלל את התרופה עם בינוני תרבות התא 2x הריכוז הסופי עם הריכוז הסופי הגבוה ביותר ב 10 מיקרומטר ו סדרתי לדלל ארבע פעמים ביחס 1:10, עבור סכום כולל של חמישה ריכוזי סמים ללא בקרת סמים.
הערה: אם הריכוז של DMSO שווה או עולה על 0.1% v / v במינון התרופות הגבוה ביותר, אין בקרת סמים צריכה להכיל כמות שווה של DMSO על מנת להבטיח את ההשפעות הנצפות שנצפו אינן בשל רעילות DMSO.
פיפטה 100 μL של תמיסת התרופה לתוך המתאים גם לריכוז סמים הסופי של 1x מדולל בתקשורת.

5. רכישת תמונה

הערה: התמונות נרכשו בימים 0, 2 ו -3. בהתאם לסוגי התא והתהליכים הסלולריים הנלמדים, oניתן לבדוק את נקודות הזמן הרצויות.

כתם תאים להתכונן הדמיה.
1. להמציא את הפתרון לצבוע בריכוז הסופי הבא.
  1. עבור סיווג מבוסס פלואורסצנטי, להכין 5 מיקרוגרם / מ"ל כתם גרעיני ו 5 מיקרומטר כתם תאים מתים PBS (ראה טבלה של חומרים ).
  2. עבור סיווג מורפולוגיה מבוסס, להכין 5 מיקרוגרם / מ"ל כתם גרעיני, 5 מיקרומטר כתם תאים מתים, כתם 5 מיקרומטר תא ב PBS (ראה טבלה של חומרים ).
2. הוסף 20 פתרון צבע μL היטב כל אחד. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס מוגן מפני האור.
לייעל ולרכוש תמונות.
1. הסר את צלחת היטב מאינקובטור, לנגב את החלק התחתון של הצלחת עם EtOH 70%, ומניחים את הצלחת בחדר הדמיה.
2. בכרטיסייה 'הגדרות', לחץ על הלחצן '+' תחת 'בחירת ערוץ' כדי להוסיף ערוצים מתאימים( כלומר , brightfield, כתם גרעיני, כתם מתים, GFP, אותות RFP).
3. לחץ על 'פריסה בחירה', ולקחת z- מוערמים תמונות הבדיקה כל 2 מיקרומטר החל ב 0 מיקרומטר וכלה ב 20 מיקרומטר לזהות את המטוס של המוקד. הזן מרחק זה עבור כל ערוץ תחת 'גובה'.
4. לחץ על 'תצלום' מתחת לכל ערוץ כדי להעריך את העוצמות ולמטב את זמני החשיפה. הזן ערכים גבוהים יותר או תחתונים תחת 'זמן' כנדרש.
5. בצד ימין של המסך, הדגש בארות מתאימות (כדי להיות צילמו) על הצלחת סכמטי. בבארות הסכימטיות שלהלן, הדגש את עשרים וחמישה השדות שצולמו בצורה דומה.
6. תחת 'הפעל ניסוי', לזהות את הצלחת ב 'שם לוח' על הכרטיסייה השמאלית, ולחץ על כפתור 'התחל' (מתחת) כדי להפעיל את פרוטוקול רכישת התמונה עם המטרה 10X כדי ליצור בקנה מידה אפור תמונות TIFF בערוצים הנ"ל.
  הערה: שלב אחר שלבהרס עבור פרוטוקול הדמיה עשוי להיות שונה בין מכשירים, אבל ערכי הפרמטר עדיין צריך להיות מותאם.
7. חזור על ההדמיה בימים שתיים ושלוש.

6. ניתוח תמונה

הערה: כל ניתוח התמונה בוצע באמצעות תוכנה קניינית. עם זאת, בגלל זה לא זמין לציבור, ניתוחים דומים תוכננו גם על CellProfiler 2.2 ו CellProfiler אנליסט 2.0, עם פרוטוקול קצר המפורטים להלן פרוטוקול מפורט בתנאי חומר משלים (תמונות הבדיקה כבר נטען לתוך צינורות כדי לבדוק את זרימת העבודה). התמונות מניסוי זה היו מקובצים יחד על בסיס היטב, כך שכל טוב יכול להיות נטען בנפרד. צינורות ה- CellProfiler שלהלן מכילים ביטוי רגולרי המנתח מידע מטה-נתונים מכל שם קובץ תמונה ומאפשר לקבץ את התמונות לפי ערוצים.

הורד והתקן את תוכנת הקוד הפתוח: 'CellProfiler'9; ו 'CellProfiler אנליסט'. קבל את כל אפשרויות ברירת המחדל וההרחבות במהלך ההתקנה.
לסווג תרבויות הטרוקלריות לתוך subpopulations.
1. פתח את התוכנה 'CellProfiler', לחץ על 'קובץ' | 'ייבוא צינור' | "מתוך קובץ", ובחר את הקובץ המתאים ("Fluorescence_Classification.cppipe" עבור סיווג מבוסס פלואורסצנציה , או "Morphology_Classification.cppipe" לסיווג מבוסס מורפולוגיה).
  הערה: קבצים אלה מכילים פרוטוקולים לעיבוד תמונה בסיסיים ופילוח גרעיני / תא. בגלל כתם Hoechst אחיד הנוכחי על פני תאים אלה, גרעינים היו מפולח ומגודל, ולאחר מכן השתמשו כדי להסוות את התמונה כדי לאפשר פילוח של גרעינים עם עוצמות נמוכות יותר.
  1. בחר את צינור סיווג מבוסס פלואורסצנטי לסווג תאים כמו גם H3255 או CCD-19Lu מבוסס על עוצמת eGFP, וכדי לחשב תכונות המורפולוגיה.
    הערה: CCDתאים Lu -19 היו transduce עם GFP.
  2. בחר את הצינור מורפולוגיה מבוסס סיווג לפלח גרעינים ותאים, וכדי לחשב תכונות מורפולוגיה.
    הערה: ניתוח נוסף במורד הזרם ב 'CellProfiler אנליסט' נדרש לסיווג. תאים מתים מסווגים באמצעות סיווג מבוסס פלואורסצנטי.
2. לחץ על 'הצג הגדרות פלט' בפינה השמאלית התחתונה של המסך. בחר את המיקום של קבצי התמונה לניתוח ('תיקיית קלט ברירת המחדל') ואת היעד לנתונים שחולצו ('תיקיית פלט ברירת המחדל').
3. לחץ על 'ניתוח תמונות' כדי להתחיל את הניתוח. כאשר הניתוח הושלם, לחץ על 'אישור' ועבור אל 'תיקיית פלט ברירת המחדל' כדי להציג את הנתונים המחושבים.
  הערה: ערכים ותמונות פרמטרים לדוגמה זמינים בקובץ משלים 1-CellProfilerProtocol.pdf .
4. עבור סיווג מבוסס מורפולוגיה (בלבד) לעשות את הפעולות הבאות.
  1. פתח 'CellProfiler אנליסט' תוכנה, בחר את המאפיינים קובץ מסד נתונים שנוצר CellProfiler, ולחץ על 'פתח'.
  2. לחץ על הכרטיסייה 'מסווג' בפינה השמאלית העליונה של המסך. כדי להתקשר לתמונות אקראיות מהתא, לחץ על 'אחזור'; תמונות יופיעו בחלון ללא סיווג.
5. מסווג את התאים באופן חיובי (H3255) או שלילי (CCD-19Lu) על ידי בחירה וגרירת תאים לסל המתאים (ראה קובץ משלים 2-Pipeline.pdf : איור B ). לאחר סיווג לפחות 50 תאים לכל תת-אוכלוסייה, לחץ על 'רכבת מסווג' ולאחר מכן לחץ על 'בדוק התקדמות'.
  הערה: התאים מסווגים באמצעות אלגוריתם למידה אקראי של מכונה. אם הדיוק אינו מעל סף מאושר (> 90%), ייתכן שיהיה צורך לחזור ולבצע אופטימיזציה של פילוח תאים על 'CellProfiler', או שהתאים לא יהיו אידיאליים עבור classiגוסס על ידי מורפולוגיה.
6. לחץ על 'ציון הכל' כדי ליצור טבלה עם ספירת תאים עבור כל תת-אוכלוסייה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצרנו תמונה להגדיר המורכב של 25 שדות / טוב, 54 בארות / צלחת (3 אוכלוסיות תאים x 6 ריכוז סמים x 3 משכפל), על פני שלוש צלחות עבור סך של 4,050 תמונות בודדות. התמונה קבוצות שנוצרו במהלך הניסוי נותחו באמצעות תוכנה קניינית (ראה טבלה של חומרים) כדי לחלץ תכונות כמותיות שונות של תאים ( כלומר מורפולוגיה, הקרינה) אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לסווג subpopulations תא. עם זאת, בגלל התוכנה המסחריים בשימוש יש גישה מוגבלת, צינורות downstream דומה CellProfiler ו CellProfiler אנליסטים נוצרו.

סיווג הטרוקלרי לתוך תת אוכלוסיות

גרעינים זוהו ופלוח על בסיס כתם ה- DNA (כאן Hoechst) ואוכלוסיות תאים סווגו או מבוסס על פלואורסצנציה או מוRphology ( איור 1 ). עבור סיווג מבוסס פלואורסצנציה, fibroblasts (CCD-19Lu) היו transduced בעבר עם lentivirus GFP. רמות העוצמה של ה- GFP נמדדו עבור כל גרעין, ואלה שחושבו מעל הסף המקובל (על סמך אות הרקע) סווגו כ- CCD-19Lu בעוד שאלו מתחת לזיהוי תאי הגידול (H3255). עבור סיווג מבוסס מורפולוגיה, תאים היו מוכתמים בעבר עם כתם הסלולר הלא רעיל (ראה טבלה של חומרים) וזה שימש כדי לזהות קטע את הציטופלסמה. אלגוריתם לומדת מכונה הוכשר עם ~ 50-100 תאים מכל האוכלוסייה. זיהו תכונות מורפולוגיות שהיו שונות באופן משמעותי בין האוכלוסיות, אשר שימשו לאחר מכן לעיצוב מסווג ליניארי כדי להבחין בין CCD-19Lu לבין תאים H3255. הקרינה ו מורפולוגיה סיווג פרוטוקולים היו 97.4% (n = 1403) concordant להבחין בין שני popul תאAtions בתנאים מטופלים ו 92.5% (n = 916) קונקורדנט בתנאים טיפול תרופתי (1 מיקרומטר erlotinib) ( איור 2 ).

אנליזה פנוטיפית של תת אוכלוסיות

בנוסף להפלות בין סוגי תאים, אנו מכוונים לאפיין תכונות פנוטיפיות של כל subpopulation. מבחני מרבב חוסך זמן ריאגנטים, מוסיף עקביות, ומספק מידע נוסף לגבי המערכת הנלמדת. ישנם רבים פוטנציאליים פנוטיפי פלטי ואחד צריך לבחור אותם בהתבסס על שאלות של עניין. כאן, נחקרו שינויים במורפולוגיה התא ובמצב החיוניות בתגובה לטיפול ארלוטיניב. לאחר שלושה ימים של טיפול תרופתי, ירידה באזור הגרעיני וגידול באזור הסלולר של תאים H3255 ( איור 3 א ) נצפתה. ההבדל הממוצע באזור הגרעיני ביןאוכלוסיית "לא סמים" ו "סמים" נמצאה מובהקת סטטיסטית באמצעות מבחן דו - צדדי דו - צדדי (שוני) ( p = 7.92 x 10 ^-16 ). אנו משערים כי תצפית זו היא תגובה סלולרית ללחץ שהוטל על ידי טיפול תרופתי.

זה גם מעניין ללמוד האם לתרופה יש ציטוטוקסי ( כלומר עלייה במספר התאים המתים לאורך זמן) או cytostatic ( כלומר ירידה במספר לידות תאים לאורך זמן) השפעה על תאים, שכן יש לכך השפעה קלינית עמוקה. לדוגמה, אפקט התרופה cytostatic גורם מעצר הצמיחה עדיין לא לחסל את התאים מן הגידול, ולכן יש פוטנציאל תאים סרטניים כדי לתגמל את התפשטות תאים לאחר התרופה מוסר. תופעות לוואי יכולות להיות לעיתים קרובות הקשר, ריכוז ותלות בסוג התא. ראינו בעבר erlotinib לעורר תגובה ציטוטוקסית בסוג תא אחד, תוך הצגת ACתגובה ytostatic אחרת ¹³ .

מבחני הכדאיות המסורתית פלט מספר תא יחסית ולכן, לא להפלות בין מעצרים הצמיחה למוות התא. כאן, תאים מתים זוהו על בסיס propidium יודיד כתם ( איור 3 ב ). ההשפעות ציטוטוקסיות ו cytostatic של erlotinib על H3255 תאים נצפו, עם עלייה במספר מקרי המוות וירידה במספר הלידות לאחר טיפול תרופתי ( איור 3 ג ). ראוי לציין כי מספר התאים המתים טיפות לאחר יום 1 כנראה בשל פינוי התא. תאי CCD-19Lu לא הושפעו מהתרופה. יתרון נוסף של פלטפורמה זו הוא יצירת נתונים כמותיים. לדוגמה, בניסוי המשותף שלנו, תת-תזונה ראשונית של 1,118 (75.8%) H3255 תאים נמצאה 2,817 (87.9%) או 396 (57.2%) לאחר שלושה ימים ללא או עם erlotinאיב, בהתאמה ( איור 4 ). מכיוון שאנו יכולים לייצר ספירת תאים בפועל במקום אחוז יחסי (כמו בשיטות cytometry זרימה), אנו מסיקים כי השינוי בהרכב במהלך הטיפול התרופתי נובע לירידה בתאי H3255 ולא עלייה CCD-19Lu. זה לא שווה שום דבר כי שיעורי המוות ניתן לזלזל בשל פינוי התא, אשר קשה להעריך ניסויי סביר שונה בין סוגי תאים.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול ניתוח התמונות. שני פוטנציאל ניתוח הזרם התמונה צינורות כדי לסווג אוכלוסיות heterocellular באמצעות או סיווג מבוסס מורפולוגיה או סיווג מבוסס פלואורסצנטי. סולם ברים = 100 מיקרומטר. לחץ עליהדואר כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: קונקורדנציה בין מורפולוגיה סיווג מבוסס פלואורסצנטי. ( א ) קונקורדנציה העלילה המציג את החפיפה של שני פרוטוקולים סיווג. תאים אלה סווגו כמו H3255 באמצעות סיווג הן מורפולוגיה ו פלואורסצנטי מבוסס. שני הפרוטוקולים היו בהסכמה, עם סיווג עבור 97.4% (n = 1403) של תאים לא מטופלים ו 92.5% (n = 916) של תאים שטופלו erlotinib (הערה: שטח לבן קטן מדי כדי לדמיין). ( ב ) 10X תמונות המתארות דוגמאות של קונקורדנציה טובה וענייה בין מבוססי פלואורסצנציה מבוססי סיווג מורפולוגיה. החצים הלבנים מצביעים על תאים שלא היו מסווגים בין פלטפורמות. קלט תמונה: כחול - גרעינים (Hoechst); ירוק - CCD19Lu (GFP). קלאסיתמונות פיקציה: אדום - H3255; ירוק - CCD-19Lu. סולם בר = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: מדידות Pnotypic מרבב מתוך התקנה ניסויית יחיד. ( א ) תכונות מורפולוגיות, כגון גרעינים ואזור התא, חושבו ברמת התא אחת בנוכחות ובהיעדר התרופה. הערה: אזורים סלולריים שגודלם קטן מ -100 מיקרומטר ² נחשבו לפסולת ולא נכללו בניתוחים. תיבות של קופסאות בחציון חציון עם טווחי רבעונים ראשון ושלישי ו- 95% סרגלי שגיאות בביטחון. ( B ) H3255 (כחול) ו CCD-19Lu (ירוק) תאים היו שיתוף בתרבית תאים מתים זוהו על בסיס עוצמת propidIumide iumide כתם (אדום) ו צילמו באמצעות מטרה 10X. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ (לוח עליון); 100 מיקרומטר (תמונות תחתית). ( ג ) סך הכל של תאים חיים ומתים חושבו במשך שלושה ימים עם או ללא טיפול תרופתי, עם ירידה ברורה במספר תאים חיים להגדיל תאים מתים עם תוספת של erlotinib. ברים שגיאה מייצגים שגיאת תקן של הממוצע מבוסס על שלושה משכפל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4
איור 4: דינמיקה subpopulation לאורך זמן. נציג 10X תמונות של בארות המכילות H3255 (כחול) ו CCD-19Lu (ירוק) ביום 0 או יום 3 עם וללא תרופה. תאים השייכים לכל subpopulation נספרים תרשימים עוגה יחסית להראות אתשינוי טוטאלי בהרכב האוכלוסייה על פני דגימות. סולם ברים = 1 מ"מ (לוחות באמצע, shpwn ב, eftmost פאנל), 1 מ"מ (תמונה עליונה), 100 מיקרומטר (תמונות תחתית). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר לעיל משפר את מבחני הביולוגיה הנוכחיים של התא על ידי מתן תובנות מקיפות יותר לגבי דינמיקה פנוטיפית של סוגי תאים מרובים בתגובה להפרעות סביבתיות תוך שימוש בריאגנטים וזמן מופחתים. יתרון מרכזי של עיצוב ניסיוני זה הוא היכולת לנתח פנוטיפים מרובים עם הגדרה אחת ולהפיק נתונים כמותיים המאפיינים פנוטיפים אלה ברמת תא בודד. יתרון טכני אחד לפלטפורמה זו הוא קלות פתרון הבעיות הראשוני בהשוואה לבדיקות אחרות. מכיוון ששיטה זו מבוססת תמונה, ניתן לדמיין את הבארות לזריעה לכאורה יתר/מתחת. רצוי להחזיק תאים בשלב הצמיחה האקספוננציאלית למשך הניסוי ולא להיות מוגבלים על ידי אילוצים תזונתיים או מרחביים או מבולבלים על ידי הזדקנות עקב זריעה מועטה. אחרת, ייתכן שלא ניתן יהיה לשחזר את שיעורי הילודה והתמותה בין הניסויים. לעיון, CellPD היא תוכנה זמינה לציבור לחישוב שיעורי לידה ותמותה¹⁴. בנוסף, ניתן לדמיין אם נוספו ריכוזים נאותים של צבעים לכל באר. בעיות פיפטינג בבאר בודדת עלולות לגרום לפילוח שגוי ולנתונים מוטים, אך ניתן לזהות אותן בקלות באמצעות הפרוטוקול הנ"ל.

למרבה הצער, לא כל סוגי התאים עשויים להיות מתאימים ליישום זה. חשוב להיות מסוגל לפלח במדויק את הגרעינים והתאים, ולכן ניתוח של תאים המתארגנים במבנים דמויי כדור או גושים יותר עשוי שלא להתאים. עבור תאים מסוימים, זה עשוי להיות יתרון גם להשתמש במסננת תאים לפני הזריעה כדי להבטיח זריעה ראשונית של תאים בודדים. בנוסף, טכניקת המסווג הליניארי ישימה רק לסוגי תאים שניתן להבחין ביניהם בקלות על סמך תכונות מורפולוגיה.

להצלחת הפרוטוקול, חשוב לבצע תחילה אופטימיזציה של תנאי ההדמיה, שכן תוקף הניתוחים במורד הזרם תלוי באיכות התמונות. בעוד שכאן ביצענו ניסויים באמצעות פלטפורמת סינון בעלת תוכן גבוה, ניתן לבצע רכישת תמונה גם באמצעות כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אם כי פלטפורמת הדמיה אוטומטית אידיאלית לגישות בתפוקה גבוהה). יש לצלם תמונות בדיקה לפני כל נקודת זמן של הדמיה כדי לוודא שאין בעיות במיקרוסקופ או בפרוטוקול. יחס האות לרעש צריך להיות גבוה, במיוחד עבור הערוצים שישמשו לפילוח (כלומר גרעינים, כתמי תאים). בנוסף, חשוב לצלם במישור המיקוד האופטימלי. אם התמונות אינן ממוקדות, הפילוח הופך להיות הרבה יותר קשה וסביר להניח שהתכונות המורפולוגיות המחושבות לא יהיו מדויקות. הבדלי תאורה בין שדות יכולים לגרום לבעיות גם בפילוח התמונה. הבדלים גדולים בבהירות מקשים על הבחירה האוטומטית של ערכי הסף. בנוסף, אם יש עוצמות פלואורסצנטיות הטרוגניות בין התאים, ייתכן שערך סף יחיד לא יפלח מספיק את כל התאים בתמונה. בניתוח זה, התגברו על בעיות אלה על ידי יצירת מסכות סביב אוכלוסיות תאים בהירות ועמומות יותר ופילוח כל אוכלוסייה בנפרד.

בעוד שהפנוטיפים הנחקרים בפרוטוקול זה מוגבלים לאפיון חי, מת ומורפולוגי, ניתן בקלות להרחיב אותם כדי לחקור תכונות אחרות. לדוגמה, ניתן להוסיף מחקרים גנטיים פונקציונליים עם RNAi, ביטוי יתר או הפרעות כימיות אחרות.

במאמר זה הודגמו יכולות הפרוטוקול למדוד את התגובה של תאי סרטן ריאה של תאים לא קטנים לארלוטיניב בנוכחות ובהיעדר CAFs. עם זאת, זוהי רק דוגמה אחת לסוגי התאים הרבים והפרמטרים המיקרו-סביבתיים שניתן לבדוק. הרחבנו פרוטוקול זה לשימוש עם סוגי תאים אחרים ומחקרי תרופות, כולל תאים ראשוניים שבודדו מגידולים של חולים^13,15.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לסרטן (NCI) מענקים U54CA143798 ו U54CA143907 להקים מדעי הפיסיקה- אונקולוגיה מרכזי (PS-OCs) במכון הסרטן דנה-פרבר ואוניברסיטת דרום קליפורניה, בהתאמה. SM Mumenthaler קיבל פרס PS-OC transnetwork שתמכה חלק מהעבודה הזאת.

ברצוננו להביע את תודתנו העמוקה לתומכים הפילנתרופיים שלנו, בייחוד למשפחת סטפנסון, לאמט, לטוני ולטסה, על תרומתם לפלטפורמת האופרטה HCS. כמו כן, ברצוננו להודות לג'ו פו על ההדרכה ועל המרכז לחברי רפואה יישומית מולקולרית: ד 'אגוס על הדרכה קלינית וחונכות, ק' פאטש לשיחות משמעותיות עם עיצוב ניסיוני, ר 'ראוואט לסיוע בפרוטוקולי ניתוח תמונות , ג 'כץ לעזרה טכנית עם האופרטה, ופ' מקלין וד 'רודרמן לדיונים מועילים ומשוב.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	קורנינג	10-040-CV	תרבית תאים מדיום
סרום בקר עוברי (FBS)	תאומים	100-106	תוסף בינוני
פניצילין/סטרפטומיצין	Gibco	15-140-122	תוסף בינוני
TC20	Biorad	1450102	מונה תאים
TC20 שקופיות עם תא	1450003 Biorad		שקופיות דלפק
צלחות 96 בארות	קורנינג	3904	צלחות שחורות תחתונות שקופות
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	פתרון להשעיית התרופה
Hoechst	Invitrogen	H21491	צבע גרעיני
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P1304MP	כתם תאים מתים
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	כתם תא שלם
מערכת הדמיה בתוכן גבוה Operetta	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	גרסה 2.2.0 (גרסה 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
חממת			תרביות תאיםכל חממת תרבית תאים תתאים - התאים תורבבו מתחת ל-37 º C ב-5% CO_2.
15 מ"ל צינורות חרוטיים פלקון	פלקון	14-959-53A
10 ס"מ² לוחות תרבית תאים	TPP	93040

כחול

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanemura, Y., et al. Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity. J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).
Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay. Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).
Hsu, S., et al. Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes. J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).
Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. Applications in image-based profiling of perturbations. Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).
Sero, J. E., et al. Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells. Mol Syst Biol. 11 (3), 790(2015).
Chen, J. F., et al. Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases. Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).
Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. Fibroblast heterogeneity in the cancer wound. J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).
Paraiso, K. H., Smalley, K. S. Fibroblast-mediated drug resistance in cancer. Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).
Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100(2006).
Jones, T. R., et al. CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens. BMC Bioinformatics. 9, 482(2008).
Dao, D., et al. CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets. Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).
Garvey, C. M., et al. A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics. Sci Rep. 6, 29752(2016).
Juarez, E. F., et al. Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD. BMC Syst Biol. 10 (1), 92(2016).
Mumenthaler, S. M., et al. The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells. Cancer Inform. 14, Suppl 4. 19-31 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

אפליה ואפיון אוכלוסיות הטרוסקלריות באמצעות טכניקות הדמיה כמותית

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles