כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת והקלטה של ההיפוקמפוס כולו מבודד, של WT ו עכברים מהונדס, יחד עם שיפורים האחרונות במתודולוגיות ויישומים לחקר תנודות תטה. אפיון פשוט של ההכנה בהיפוקמפוס מבודדת מוצג לפיה היחסים בין מתנדים תטא בהיפוקמפוס פנימי נבדק יחד עם פעילות של תאים פירמידליים, ו intereurons GABAergic, של Cornu ammonis-1 (CA1) ותת תחומים (SUB) אזורים. בסך הכל, אנו מראים כי ההיפוקמפוס מבודד מסוגל לייצר תנודות תטה מהותי במבחנה וכי קצביות שנוצר בתוך ההיפוקמפוס ניתן מניפולציה מדויקת על ידי גירוי optogenetic של intervalons חיובי parvalbumin (PV). ההכנה במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס מציעה הזדמנות ייחודית להשתמש בשדה סימולטני ובתקן תאיים קליפ תיקון של ניאו מזוהה חזותיתRons כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי הדור קצב.
מבוא
תנודות הטטה בהיפוקמפוס (4-12 Hz) הן בין הצורות השכיחות ביותר של פעילות קצבית במוח היונקי, והן מאמינות כי הן ממלאות תפקידים מרכזיים בתפקודים קוגניטיביים כגון עיבוד מידע spatiotemporal ויצירת זיכרונות אפיזודיים 1 , 2 , 3 . בעוד כמה מחקרים vivo המדגישים את הקשר של תאטה מקום תאים עם הניווט המרחבי ומחקרי הנגע, כמו גם ראיות קליניות, תומכים את הדעה כי תנודות טטה בהיפוקמפוס מעורבים היווצרות זיכרון 4 , 5 , 6 , המנגנונים הקשורים עם הדור של תנוד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים בוצעו על פי פרוטוקולים והנחיות שאושרו על ידי מקגיל אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.
1. היפוקמפוס חריף בהכנת ויטרו
הערה: בידוד ההכנה בהיפוקמפוס שלם כוללת שלושה שלבים עיקריים: (1) הכנת פתרונות וציוד, (2) ניחוח של ההיפוקמפוס ו (3) הגדרת מערכת קצב זלוף מהיר הדרוש ליצירת תנודות תטה מהותי. בפרוטוקול זה, את הביצועים בזמן של נהלים - מן לנתיחה כדי הקלטה - חשוב במיוחד משום ההיפוקמפוס מבודד מהווה כה צפוף, אבל עדין, הכנה כי שמירה על קישוריות תפקודית של המבנה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד תנודות theta בהכנת העכבר בהיפוקמפוס מבודד במבחנה . הליך לנתיחה לחילוץ ההיפוקמפוס מבודדת באיור 1 . באמצעות הכנה זו, תנודות תטה מהותי ניתן לבחון במהלך המיקום של אלקטרודות שדה מרובים, הקלטה הפעילות הכוללת סינכרוני תשומות סינפטיות לאוכלוסיות נוירונים באזורים שונים ושכבות של ההיפוקמפוס מבודדים ( איור 2 ). תוצאות נציג מ סימו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד הקלטות אלקטרו מפרופילים בהיפוקמפוס חריף מהווים תקן במבחנה טכניקה, השיטות המוצגות כאן שונה באופן משמעותי מן הגישה הקלאסית. שלא כמו ההכנות פרוסת דק שבו שכבות תאים ספציפיים גלויים על פני השטח ניתן לבדוק ישירות, ההכנות בהיפוקמפוס שלם דומים יותר בתצורות vivo שבו האלקטרודות מופחתים לתוך אזורים במוח ממוקד בעת חציית שכבות בודדות. יושרה של ההיפוקמפוס נשמר יחד עם קישוריות תפקודית ומאפיינים של אוכלוסיות נוירונים מקומיים. זה מספק כלי מורכב ורב עוצמה לחקור תנודות רשת קטנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מסחריים או פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות ומחקר מדעי הטבע.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| נתרן כלורי | סיגמא אולדריץ' | S9625 | |
| סוכרוז | סיגמא אולדריץ' | S9378 | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא אולדריץ' | S5761 | |
| NaH<תת>2PO<תת>4 - נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא אולדריץ' | S8282 | |
| מגנזיום גופרתי | סיגמא אולדריץ' | M7506 | |
| אשלגן כלורי | סיגמא אולדריץ | P3911 | |
| D-(+)-גלוקוז | סיגמא אולדריץ' | G7528 | |
| סידן כלוריד דיהידרט | סיגמא אולדריץ' | C5080 | |
| נתרן אסקורבט | סיגמא אולדריץ' | A7631-25G | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>ציוד | |||
| סטנדרטי מספריים חיתוך | פישר סיינטיפיק | 08-951-25 | מיצוי מוח |
| ידית אזמל #4, 14 ס"מ | WPI | 500237 | מסנן מיצוי מוח |
| מלקחיים, לסתות שטוחות, ישרות (11 ס"מ) | WPI | 500456 | מיצוי מוח |
| פרגון להבי אזמל נירוסטה #20 | Ultident | 02-90010-20 | מיצוי מוח |
| מספריים לחיתוך מעוקל נקודה | עדינה תרמו פישר 711999 מדעי | מיצוי מוח | |
| טפלון (PTFE) - מרית דקה מצופה | VWR | 82027-534 | הכנת |
| היפוקמפוסהיימן סטייל מיקרוספטולה | פישר סיינטיפיק | 21-401-25A | הכנת היפוקמפוס |
| כף מעבדה | פישר סיינטיפיק | 14-375-20 | הכנת היפוקמפוס |
| בורוסיליקט זכוכית פסטר פישר | סיינטיפיק | 13-678-20A | הכנת היפוקמפוס |
| טפטפת | הכנת היפוקמפוס | מדעית | |
| סכיני גילוח חד שוליים | VWR | 55411-055 | הכנת היפוקמפוס |
| נייר עדשה (4 x 6 אינץ') | VWR | 52846-001 | הכנת היפוקמפוס |
| צלחות פטרי זכוכית (100 x 20 מ"מ) | VWR | 25354-080 | הכנת היפוקמפוס |
| מגש פלסטיק לקרח; גודל 30 x 20 x 5 ס"מ | היפוקמפוס | ||
| מחמם פתרון מוטבע יחיד וורנר | מכשירים | מערכת | זלוף |
| אבני אוויר לאקווריום לבעבוע | מערכת זילוף | n.a.n.a.a | |
| צינורות Tygon E-3603 (מזהה 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | מערכת זלוף |
| מחבת חשמלית | שחורה & מערכת דקר | n.a.perfusion | |
| 95% O2/5% CO2 תערובת גזים (קרבוגן) | מערכת זלוף | SG466204A Vitalaire | |
| בקבוקי זכוכית/צלוחיות (4 x 1 ליטר) | מערכת זילוף | ||
| הקלטה שקוע | עיצוב מותאם אישית (FM) | n.a. | ניתן להשתמש בחלופה מסחרית |
| פיפטות זכוכית (1.5/0.84 OD/ID (מ"מ) ) WPI | 1B150F-4 | אלקטרופיזיולוגיה | |
| Hum Bug 50/60 הרץ מסלק רעש | Quest Scientific | Q-Humbug | אלקטרופיזיולוגיה |
| Multiclamp 700B מגבר טלאי-מהדק | התקנים מולקולריים | MULTICLAMP | אלקטרופיזיולוגיה |
| Multiclamp 700B Commander Program | התקנים מולקולריים | MULTICLAMP | אלקטרופיזיולוגיה |
| ממיר דיגיטלי/אנלוגי | התקנים מולקולריים | DDI440 | אלקטרופיזיולוגיה |
| PCLAMP10 | מכשירים | מולקולרייםPCLAMP10 | אלקטרופיזיולוגיה |
| טבלת בידוד רעידות | ניופורט | n.a.electrophysiology | |
| מיקרומניפולטורים (מופעלים ידנית) | Siskiyou | MX130 | אלקטרופיזיולוגיה (LFP) |
| מיקרומניפולטורים (אוטומטיים) | Siskiyou | MC1000e | אלקטרופיזיולוגיה (תיקון) |
| מוניטור אודיו | A-M Systems | דגם 3300 | אלקטרופיזיולוגיה |
| חולץ פיפטה מיקרופיפטה/תיקון | Sutter | P-97 | אלקטרופיזיולוגיה |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף שנבנה בהתאמה אישית | Siskiyou | n.a.מצלמת | |
| וידאו אנלוגית | COHU | 4912-2000/0000 | הדמיה |
| תופס מסגרת דיגיטלי עם תוכנת הדמיה | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | הדמיה |
| אולימפוס 2.5X אובייקט | אולימפוס | MPLFLN | הדמיה |
| אולימפוס 40X מטרת טבילה במים | אולימפוס | UIS2 LUMPLFLN | הדמיה |
| מערכת דיודות פולטות אור (LED) בהתאמה אישית | אופטוגנטי מותאם אישית | (Amhilon et al., 2015) | |
| שם | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) עכברי | מעבדת ג'קסון | מספר מלאי 008069 | אפשר ביטוי גנים מכוון Cre באינטרנוירונים PV |
| עכברי Ai9 מכוננים-מותנים (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | מלאי | מעבדת ג'קסון | 007905 Express TdTomato בעקבות רקומבינציה בתיווך Cre |
| עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory stock number 012569 | מבטאים את חלבון ההיתוך המשופר channelrhodopsin-2/EYFP לאחר חשיפה ל-Cre | |
| עכברי PVChY | רקומבינאז בגידול ביתי | n.a.צאצאים | שהתקבלו מהכלאה של קו PV-Cre עם עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
מקורות
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
