הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס

9.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/55851

⸱

2 באוגוסט 2017

 , 
1Department of Psychiatry, Douglas Mental Health University Institute, McGill University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להקלטת קצבית רשת עצבית theta ו תנודות גמא מ הכנה בהיפוקמפוס שלם מבודד. אנו מתארים את השלבים ניסיוני מן החילוץ של ההיפוקמפוס לפרטים של שדה, יחידית תא שלם קליפת הקלטות מהדק, כמו גם צעדה optogenetic של קצב theta.

תקציר

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים להכנת והקלטה של ​​ההיפוקמפוס כולו מבודד, של WT ו עכברים מהונדס, יחד עם שיפורים האחרונות במתודולוגיות ויישומים לחקר תנודות תטה. אפיון פשוט של ההכנה בהיפוקמפוס מבודדת מוצג לפיה היחסים בין מתנדים תטא בהיפוקמפוס פנימי נבדק יחד עם פעילות של תאים פירמידליים, ו intereurons GABAergic, של Cornu ammonis-1 (CA1) ותת תחומים (SUB) אזורים. בסך הכל, אנו מראים כי ההיפוקמפוס מבודד מסוגל לייצר תנודות תטה מהותי במבחנה וכי קצביות שנוצר בתוך ההיפוקמפוס ניתן מניפולציה מדויקת על ידי גירוי optogenetic של intervalons חיובי parvalbumin (PV). ההכנה במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס מציעה הזדמנות ייחודית להשתמש בשדה סימולטני ובתקן תאיים קליפ תיקון של ניאו מזוהה חזותיתRons כדי להבין טוב יותר את המנגנונים מאחורי הדור קצב.

מבוא

תנודות הטטה בהיפוקמפוס (4-12 Hz) הן בין הצורות השכיחות ביותר של פעילות קצבית במוח היונקי, והן מאמינות כי הן ממלאות תפקידים מרכזיים בתפקודים קוגניטיביים כגון עיבוד מידע spatiotemporal ויצירת זיכרונות אפיזודיים 1 , 2 , 3 . בעוד כמה מחקרים vivo המדגישים את הקשר של תאטה מקום תאים עם הניווט המרחבי ומחקרי הנגע, כמו גם ראיות קליניות, תומכים את הדעה כי תנודות טטה בהיפוקמפוס מעורבים היווצרות זיכרון 4 , 5 , 6 , המנגנונים הקשורים עם הדור של תנודות thta בהיפוקמפוס עדיין לא הבינו לחלוטין. מחקרים מוקדמים בתחום ה- vivo הראו שפעילות התטה תלויה בעיקר במתנדים חיצוניים, ובמיוחד בתשומות קצובותמן המבנים המוחיים כגון מחיצות וקורטקס אנטורהינל 7 , 8 , 9 , 10 . תפקיד של גורמים פנימיים - קישוריות פנימית של רשתות עצביות בהיפוקמפוס יחד עם המאפיינים של נוירונים בהיפוקמפוס - הונח גם על סמך תצפיות חוץ גופית 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . עם זאת, מלבד כמה מחקרים ציון 19 , 20 , 21 , קשיים בפיתוח גישות שעלולות לשכפל פעילות פיזיולוגית ריאליסטית האוכלוסייה בהכנת פשוטה במבחנה חוץ גופיתS יש, במשך זמן רב, עיכוב בדיקה ניסיונית מפורטת יותר של היכולות המהותיות של ההיפוקמפוס ואת האזורים הקשורים עצמית לייצר תנודות תטה.

חיסרון חשוב של תקן במבחנה דק פרוסה הגדרה ניסיונית היא כי הארגון הסלולר 3D ו הסינפטי של מבנים מוחיים נפגעת בדרך כלל. משמעות הדבר היא כי צורות רבות של פעילויות רשת מתואמות המבוססות על מכלולים תאיים מבוזרים מרחביים, החל מקבוצות מקומיות (רדיוס 1 מ"מ) לאוכלוסיות של נוירונים הפרושות על פני אזור מוח אחד או יותר (> 1 מ"מ), לא ניתן לתמיכה. בהתחשב בשיקולים אלה, נדרש סוג אחר של גישות כדי ללמוד כיצד מופיעות תנודות התטה בהיפוקמפוס, והן מתפשטות למבנים של קליפת המוח וקורטקורט.

בשנים האחרונות, הפיתוח הראשוני של "להשלים septo-hippocampal" הכנה לבחון interaional דו כיווניתCtions של שני מבנים 22 , ואת ההתפתחות שלאחר מכן של ההכנה "ההיפוקמפוס מבודדים", גילו כי תנודות תטה מהותי להתרחש ספונטנית בהיפוקמפוס חסר קלט קצבי חיצוני 23 . הערך של גישות אלה טמון על התובנה הראשונית כי המבנה הפונקציונלי כולו של אזורים אלה היה צריך להישמר על מנת לתפקד כמו מחולל קצב תטה במבחנה 22 .

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הנהלים בוצעו על פי פרוטוקולים והנחיות שאושרו על ידי מקגיל אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים.

1. היפוקמפוס חריף בהכנת ויטרו

הערה: בידוד ההכנה בהיפוקמפוס שלם כוללת שלושה שלבים עיקריים: (1) הכנת פתרונות וציוד, (2) ניחוח של ההיפוקמפוס ו (3) הגדרת מערכת קצב זלוף מהיר הדרוש ליצירת תנודות תטה מהותי. בפרוטוקול זה, את הביצועים בזמן של נהלים - מן לנתיחה כדי הקלטה - חשוב במיוחד משום ההיפוקמפוס מבודד מהווה כה צפוף, אבל עדין, הכנה כי שמירה על קישוריות תפקודית של המבנה במבחנה דורש טיפול רב. הכנת הכל מראש מבטיחה רמה נאותה של זלוף זמין מוקדם ככל האפשר כדי למזער תא דAmage ולשמור על תפקוד פיזיולוגי.

  1. Sucrose מבוססי מלאכותי מוחי עמוד השדרה נוזל (aCSF) פתרון
    1. הכן 1x המניות סוכרוז פתרון לשמש לנתיחה שלאחר הדגירה דיסקציה. שלב את כל המרכיבים המפורטים בטבלה 1 , למעט CaCl 2 , לתוך 1 ליטר של מים deionized, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 2 שבועות.
  2. פתרון ACSF סטנדרטי
    1. הכן aCSF סטנדרטי עבור זלוף קצב הזרימה הגבוה של ההיפוקמפוס מבודד במהלך הקלטות אלקטרו. כדי להפוך את aCSF מרוכז (5X) מלאי, להמיס את כל המרכיבים המפורטים בטבלה 2 , למעט CaCl 2 , ב 2 L של מים deionized ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את הציוד
    1. לפני תחילת הנתיחה, להגדיר את שטח הספסל עם מגש פלסטיק מלא קרח (30 x 20 x 5 ס"מ), קווי צינורות מחוברים carbogen ו thrEe זכוכית צלחות פטרי (10 x 2 ס"מ) (ראה איור 1 ).
    2. הוסף 300 מ"ל של תמיסת סוכרוז (מניות 1X) כדי 500 כוס מ"ל, בועה זה עם carbogen (95% O 2 , 5% CO 2 ) ולהוסיף Ca 2 + [1.2 מ"מ].
    3. העברת 60 מ"ל של תמיסת סוכרוז זה צלחת פטרי זכוכית ולהשאיר בטמפרטורת החדר. מניחים את שארית במקפיא 4 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
    4. בועה הפתרון סוכרוז קר כקרח עם carbogen לאורך לנתיחה.
    5. ממלאים צלחת פטרי השני (תא מחזיק קר) עם תמיסת סוכרוז (4 מעלות צלזיוס) ולשמור על הקרח.
    6. הוסף 30 מ"ל של פתרון סוכרוז קר כקרח כוס 50 מ"ל.

2. דיפלקציה של היפוקמפוס שלם

הערה: השיטה עבור לנתח את ההיפוקמפוס מבודד זהה במהותו לזה שפותחו ותיארו במקור 22 , אבל עם פרטים נוספים ושינויים לגבי peקצב rfusion וטכניקות הקלטה.

  1. דיסקציה מוחית
    1. להרדים עכבר (P20 - 35) תחת מכסה המנוע קטר עם מגבת נייר קטנה ספוג עם 1 מ"ל של isoflurane (100%) כי הוא הוסיף לתוך הכלוב.
    2. לערוף את העכבר הרדים במהירות לטבול את הראש פתרון סוכרוז קר כקרח (כוס 50 מ"ל, ~ 5 s). העברת על מגבת נייר.
    3. השתמש באזמל כדי לבצע חתך בעור המדיאלי (הזנב אל מקורי) ודחוף את העור בצדדים כדי לחשוף את הגולגולת.
    4. לחתוך את הגולגולת עם מספריים קטנים ולהשתמש מרית במהירות לחלץ את המוח ולשחרר אותו לתוך צלחת פטרי המכיל פתרון סוכרוז קר כקרח. אפשר 1-2 דקות למוח להתקרר.
    5. בעוד המוח הוא מחלים, להוסיף 2 - 3 מ"ל של תמיסת סוכרוז על נייר העדשה מכוסה פטרי (דיסקציה) צלחת על הקרח.
  2. בידוד את ההיפוקמפוס
    1. מניחים את המוח על צלחת לנתיחה ב positio זקוףנ.
    2. הסר את המוח הקטן ואת קליפת המוח הקדמית עם סכין גילוח. חותכים את המוח לחצי לאורך המטוס בינוני ולהחזיר את שתי ההמיספרות מבודדים לחדר ההחזקה. אפשר עוד 1 - 2 דקות להתאוששות.
    3. מקום אחד hemisected המוח זקוף על צלחת לנתיחה.
    4. סובב את המנה עד מבנים midsagittal הפנים הצופה ואת קווי המתאר מוטבע של מורכבות מחיצת גלוי כמו שכבת אגס דקה של רקמה קדמית התלמוס.
    5. החזק את המוח חמי- sected יציב עם microspatula ומקום הקצה הקטן של polytetrafluoroethylene (PTFE) מצופה המרית מיד מאחורי (הזנב אל) אזור המחצה.
    6. הכנס את המרית מצופה מתחת מחצה ולהזיז את קצה עד צלחת לנתיחה הוא הגיע. סבר את הסיבים המחברים את אזור המחיצות caudally. חזור על אותה פעולה לאורך הקצה הקדמי של מחצה וחותכים את הסיבים המתחברים לחלק הקדמי של המוח.
    7. עם מרית קלות מחזיק את החלק הפנימי של קליפת המוח רק מעל ההיפוקמפוס בעמדה זקופה, להשתמש microspatula כדי למשוך בזהירות למטה את תלמי, ההיפותלמוס הנותרים גזע גזע המוח. השתמש במרית כדי לחתוך ולהסיר את הרקמה משכו.
    8. הפוך את חצי הכדור מבודד על צדה ולזהות את קווי המתאר של ההיפוקמפוס.
    9. הכנס את המרית מצופה בחדר לרוחב, מתחת לקצה מקורי של ההיפוקמפוס הגב.
    10. להחזיק את המרית מיושר אופקית עם המטוס midsagittal של המוח חמי- sected ולהחליק אותו דרך קווי חלקה של קירות החדר עד קצה עולה caudally.
    11. החזק את המרית מתחת להיפוקמפוס ולחץ עליה קלות על סיבי החיבור, לאורך השכבה הפנימית שבה ההיפוקמפוס מצטרף לקליפת המוח. החל את microspatula בצד החיצוני של שכבה זו והחלק נגד מרית מצופה לפרוס דרך חיבור FiBers.
    12. כדי להשלים את החילוץ, לסובב את צלחת לנתיחה ולהכניס את המרית מצופה מתחת ההיפוקמפוס הגחון. החזק קלות את החלק הפנימי של לקפל קליפת המוח עם מרית וחתך דרך חיבורים entorhinal באמצעות חיתוך חתיכת נגד microspatula.
      הערה: ניתן להסיר את מכלול הספטוהיפוקמפוס כולו על ידי הנחת המרית המצופה מתחת לכל ההיפוקמפוס, ושליפת רקמת המוח הנותרת מתחת.
    13. לאחר בידוד מוחלט, לשמור על ההיפוקמפוס מנוחה על המנה להוסיף טיפת פתרון סוכרוז קר כקרח כדי לשמור על זה מגניב. בזהירות לקצץ את כל קליפת המוח הנותרים סיבים להפריד את ההיפוקמפוס מחיצות על ידי בעדינות החלת סכין גילוח דרך fornix.
      הערה: אם התצלומים של מהדק התיקון אמורים להתבצע מתאי פירמידה (ראה סעיף 4.6), ההיפוקמפוס המבודד ניתן לחתוך באופן רוחבי בזווית של 45 ° כדי לחשוף את שכבת הפירמידה של CA1 ("anglE-cut), מבלי לפגוע במעגל הרשת המקומית בחלק הנותר של ההיפוקמפוס.
    14. מעבירים את ההכנות לטמפרטורת החדר סוכרוז פתרון ולתת לו להתאושש במשך 15 - 30 דקות לפני ההעברה לחדר ההקלטה.

3. הגדרת את זלוף מהיר להקלטת ההיפוקמפוס מבודד

  1. הגדר את מערכת זלוף- fed זלוף לאפשר זרימה רציפה במהירות גבוהה של aCSF מחומצן ב 20-25 מ"ל / דקות.
    1. הכן aCSF (1X) צלוחיות מראש לטבול אותם באמבטיה ההתחממות (~ 30 מעלות צלזיוס) לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי. הפעל את מערכת החימום בתוך הקו (30 ° C).
    2. השתמש bubblers אקווריום צינורות צינורות מחובר טנק carbogen כדי לחמצן aCSF לאורך הניסוי, ולהוסיף CaCl 2 [2 מ"מ] לפני תחילת זלוף.
    3. עצור זרימת aCSF ולהעביר את ההיפוקמפוס לתא הקלטה באמצעות רחבסוף של פיפטה זכוכית. אפשר את ההכנות רווי סוכרוז לשקוע להתיישב בתחתית.
    4. מניחים את ההכנה במרכז החדר ההקלטה (בקו עם ציר כניסת מוצא) עם משטח חלק של CA1 ו- SUB על גבי. לייצב את ההיפוקמפוס עם משקולות קטנות על הגפיים ואת הזמני מחטתי מחדש זרימת aCSF.

4. אלקטרופיזיולוגיה בהיפוקמפוס מבודד

  1. הקלטת תאיים של תנודות תזה בהיפוקמפוס במבחנה
    1. עבור ניטור תאיים של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) או יחידה יחידה פעילות של במבחנה מבודדת בהיפוקמפוס, להשתמש micropipettes זכוכית (1 - 3 MΩ) מלא aCSF. רשמו רעש נמוך עם אותות פוטנציאליים של שדה פוטנציאלי עם מגבר מהדק תיקון של x1000 x1, מעבר מקוון של סינון פס 0.1 - 500 הרץ וקצב דגימה של 5-20 קילו-הרץ.
      הערה: מיקרוסקופ נבנה בהתאמה אישית בפרוטוקול זההוא מצויד נמוך (2.5X) ו-הגדלה גבוהה (40X) מטרות עבור נוף ההגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, כמו גם מיקרוסקופ וידאו אינפרא אדום epifluorescence להכרה תא בודד. הרכיבים של מערכת זו כוללים מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף, קוביות סינון פלואורסצנטי, מצלמת וידאו אנלוגי חוטף מסגרת דיגיטלית עם תוכנת הדמיה, על הבמה חדר זלוף מותאם אישית ( איור 2A , inset i) ו micromanipulators דיוק גבוהה עבור הקלטות עצביים ו מיקום סיבים אופטיים.
    2. השתמש המצלמה רכוב על המיקרוסקופ מחובר לתצוגת המחשב כדי לבדוק את ההכנה בהיפוקמפוס תחת הגדלה נמוכה (2.5X) ו לבדוק במהירות כי אין חתכים או נזק על פני השטח החיצוניים. הסדר באלכסון בכיוון של סיבי alveus לאורך משטח חלק של CA1 צריך להיות גלוי ( איור 2 א , הבלעה השנייה) כאשר זורחת אור מועבר דרך ההיפוקםמוּגלָה.
    3. השתמש נמוכה-הגדלה רחב שדה המטרה כדי להציג את ההיפוקמפוס מבודד ואת המיקום של אלקטרודות LFP במקומות הקלטה ספציפיים.
      הערה: פריסה של ההכנה בהיפוקמפוס מבודד עם אלקטרודות מרובות להציב במקומות הקלטה שונים מתואר באיור 2 א .
    4. מנמיכים אלקטרודה LFP לתוך האמבטיה עד שהוא נוגע פני השטח (alveus) של אזור CA1.
      הערה: זה בדרך כלל מייצר חולף מהיר הקלטה AC מצמידים דומה למה שקורה כאשר האלקטרודה בא במגע עם התקשורת ההקלטה. צג שמע יכול להיות שימושי כדי להאזין לערוץ LFP ערוץ לאחר שלב זה.
      הערה: לעתים קרובות, סימנים מוקדמים של פעילות יופיע רק לאחר 10-15 דקות, ולכן חשוב לא להתקדם במהירות לתוך ההכנה. אם לאחר תקופה זו פני השטח LFP אלקטרודה הוא עדיין לא להרים את הפעילות, להתקדם קצת יותר למטה דרך שכבות oriensו להשהות מעת לעת כדי לראות אם כל סוג של פעילות עולה בעת מתקרב שכבת התא העיקרית. אם דבר אינו מזוהה לאחר 5-10 דקות נוספות, בזהירות retract האלקטרודה ומניחים אותו במקום אחר באותו אזור.
    5. לקדם את האלקטרודה LFP דרך שכבת פירמידה. שימו לב כי פעילות spiking תאיים בהתחלה מגדילה כמו פריקה יחידה יחידה של נוירונים בודדים (בעיקר פירמידלית תאים סל מעכבי) מזוהה. הנמיך את האלקטרודה נוספת וציין כי spiking מתחיל להתפוגג שוב עם קצה חוצה את הרדיאטום. שים לב כי תנודה ברורה ברשת גלוי בטווח תדר תדר (4-12 Hz) מתברר ומגיע משרעת מקסימלית (~ 100 - 300 μV) כמו מיקום ההקלטה הוא הוריד דרך הרדיאטום.
  2. תנודות תטא ברחבי אזור אחד
    1. כדי לבדוק את המאפיינים המרחביים של תנודות תטא ספונטנית ברחבי האזור CA1, במקום את קצה oFE התייחסות LFP אלקטרודה באתר CA1 המדיאלי (הממוקם באופן רפואי לאורך ציר האורך הטמפורלי האורך) ולהוריד אותו לתוך הרדיאטום כפי שתואר לעיל.
    2. מניחים אלקטרודה LFP השני לתוך אתר CA1 (200 - 800 מיקרומטר מחרוזת או הזמני של LFP הראשון) ולהבחין כי תנודות CA1 תטה יכול לסנכרן על פני מרחקים גדולים יחסית.
  3. תנודות תטה על פני שכבות
    1. כדי לבדוק את המאפיינים של תנודות thta על פני שכבות בהיפוקמפוס, להשאיר אלקטרודה LFP התייחסות באתר רדיאטום CA1. החל רק מעל השכבה ourens, התחתון אלקטרודה שנייה לתוך שכבת התא פירמידה, דרך הרדיאטום. שים לב היפוך הדרגתי של האות LFP (היפוך פאזה יחסית) על פני השכבה פירמידלית.
      הערה: לדוגמאות מייצגות של סוגי פעילות אלה, ראה איור 2 ב . דוגמאות לפרופילים למינרית / עומק ולמשתנים מקוריים של צפיפות מקור (CSD)הוא ממחיש את האתר של היפוך פאזה בהיפוקמפוס מבודד פורסמו בעבר 23 , 24 , 25 .
  4. תנודות גמא וצימוד תטא-גמא בהיפוקמפוס שלם
    1. מניחים שדה אלקטרודה בגבול CA1 / SUB ומורידים אותו עד שהוא יושב על הממשק בין השכבות הפירמידליות והמולקולריות. ברמה זו, פוטנציאל שדה הצגת תנודות גמא ברור עם שינויים משרעת כי שלב לנעול את המקצב תטה המקומי ניתן להקליט 24 . התאם את קנה המידה כדי לצפות בסולם הזמן האיטי של צימוד הגטא-גמא. שים לב כי התפרצויות גמא מתרחשות בשתי להקות תדר שונות, אשר יכול להתגלות על ידי הלהקה לעבור סינון האות LFP מתמשכת בטווח איטי (25 - 50 הרץ) וגאמה מהירה (150 - 250 הרץ) טווח (ראה איור 2 ג עבור נציג מסונן עקבות).
  5. כל תא תיקון מהדק מהדק במהלך תנודות תבה בהיפוקמפוס במבחנה
    הערה: בחלק זה של הפרוטוקול, המטרה היא לקבל ויזואלי מודרך כולו תא תיקון מהדק מהדק מן interneurons מזוהה בהיפוקמפוס מבודדים מן עכברים PV-TOM מהונדס להביע את החלבון פלואורסצנטי, tdTomato, בשליטת היזם PV (עבור פרטים נוספים ראה חומרים ו Ref 26 ).
    1. השתמש מיקרוסקופ וידאו פלואורסצנטי עם הגדלה (2.5X) גבוה כוח (40X) הגדלה לדמיין interneurons חיובי tdTomato הממוקם ליד פני השטח של הכנה בהיפוקמפוס מ עכבר PV-TOM ( איור 3 ). שים לב כי בעוד נוירונים PV-TOM יכול להיות דמיינו בהצלחה וממוקדים תיקון באמצעות alveus (עד 100 מיקרומטר), תאים פלורסנט שאינם פלורסנט ניתן גם להגיע בקלות יחסית כאשר ההיפוקמפוס מוכן עם טכניקת חיתוך זווית (ראה סעיף 2.2.14 הערה).
    2. תחת תצוגה הגדלה נמוכה של ההיפוקמפוס, במקום אלקטרודה LFP ב CA1 / SUB לפקח תנודות theta בעת הכנה עבור ניסויים מהדק תיקון.
    3. עבור הגדלה 40X ו לטבול את המטרה מעל אזור היעד; הורד אותו עד שהשכבות העליונות יהיו גלויים. לתפעל את המיקום של המיקרוסקופ כדי להבטיח גישה פתוחה מספיק עבור פיפטה תיקון הגישה מן הצד הנגדי.
    4. תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בחר תא PV- טון ניאון לגשת אליו עם פיפטה תיקון (2 - 3 MΩ) מלא פתרון תאיים רגיל.
    5. השתמש חתיכת הפה כדי להחיל לחץ חיובי אור פיפטה לפקח על ההתנגדות כמו האלקטרודה הוא הוריד על התא. כאשר קצה פוגש את התא היעד, ההתנגדות פיפטה מגביר גומת חן ברורה מופיע כמו לחץ חיובי דוחף על הממברנה. שחררו את הלחץ וודאו כי הדופק הנוכחי משתטח כמו גושפנקה מתחיל הטופס. מיד clמגבר על פוטנציאל hyperpolarized (-70 mV), ופעם חותמת GΩ מושגת, לקרוע את קרום התא עם כמות קטנה של לחץ שלילי מיושם באמצעות בעל פיפטה.
    6. פעם בתצורה תא שלם, לבחון את המאפיינים הפיזיולוגיים של תא PV מזוהה במהלך תנודות בהיפוקמפוס ספונטני ( איור 3 ב ).
    7. שימו לב כי פוטנציאל הקלטה ממברנה תאיים מ תאים PV מאופיינים התנהגות מהירה spiking ו בפרצי פוטנציאל פעולה מסונכרנים ל CA1 / SUB קצב תטא.
    8. החלף את המתח-מהדק והחזק את התא פוטנציאלים שונים של קרום לאפיין את היחס בין זרמים סינפטיים מעוררים לעומת מעכב שנוצר על ידי פעילות קצבית מהותי. דוגמה של הקלטה מהדק תיקון מתא פירמידה מוצג באיור 3A להשוואה.
  6. שליטה אופטוגנטית בהיפוקמפוס המבודד
    הערה: עבור שליטה optogenetic של פעילות הרשת בהיפוקמפוס, אסטרטגיה ספציפית מסוג תא הקשורים הפעלה קצבית של תאים המכילים PV- GABAergic משמש כאן כמו תאים אלה הוצגו לשחק תפקיד מרכזי בסנכרון אוכלוסיות תאים ראשיים בהיפוקמפוס מבודד 25 . ביטוי סלקטיבי של הערוץ channelrhodopsin-2 (ChR2) בתאים PV מושגת על ידי חציית קו העכבר PV-Cre עם עכברים המבטא באופן קונבנציונאלי ChR2 Cre- תלוי (Ai32), ובכך לייצר PV-Chy עכברים. לחלופין, מבנים וקטוריים ויראליים ( למשל , AAVdj-ChETA-eYFP) ניתן להזריק לתוך ההיפוקמפוס של PV-Cre או PV-TOM עכברים (P15-16) כדי להניע את הביטוי של opsin מעורר ב CA1 / SUB interneurons ( איור 4 א ).
    הערה: אסטרטגיה זו תוארה בעבר 25.
    1. מניחים אלקטרודה LFP באזור CA1 / SUB ו תיקון תא הפירמידה הקרובה של ההיפוד מבודדיםAmpus של עכבר להביע את האור כחול רגיש opsin מרגש ChR2 ב interneurons PV.
    2. מניחים סיב אופטי מדריך אור (0.2 - 1 מ"מ קוטר) מעל ההכנה בהיפוקמפוס ומרכז אותו באזור נרשם. השתמש באור כחול (473 ננומטר) ממקור LED עבור גירוי אופטוגנטי, המורכב מפעימות אור (10 - 20 אלפיות השנייה, מופעלות באמצעות אות טרנזיסטור טרנזיסטור טרנזיסטור) או פקודות מתח גל סינוס הנשלחות בתדרי תטה (12-12 הרץ).
      הערה: מותאם אישית LED מבוסס גירוי אור הרכבה תוארה במקום אחר 25 .
    3. מעבר הנוכחי מהדק ולאפיין את הפעילות של פירמידה במהלך תנודות תטא ספונטני.
    4. הפעל את פרוטוקול גירוי ולתעד את התגובות האור. Observe כי תנודות שדה ופעילות סינפטי הנוירון נרשם להיות מסונכרן יותר במהלך גירוי optogenetic וכי הקצב הקצבי של תאים PV תוצאות שליטה חזקה של שני תדריםEncy והעוצמה של תנודות theta ( איור 4 ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות שניתן להשיג על ידי לימוד תנודות theta בהכנת העכבר בהיפוקמפוס מבודד במבחנה . הליך לנתיחה לחילוץ ההיפוקמפוס מבודדת באיור 1 . באמצעות הכנה זו, תנודות תטה מהותי ניתן לבחון במהלך המיקום של אלקטרודות שדה מרובים, הקלטה הפעילות הכוללת סינכרוני תשומות סינפטיות לאוכלוסיות נוירונים באזורים שונים ושכבות של ההיפוקמפוס מבודדים ( איור 2 ). תוצאות נציג מ סימו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעוד הקלטות אלקטרו מפרופילים בהיפוקמפוס חריף מהווים תקן במבחנה טכניקה, השיטות המוצגות כאן שונה באופן משמעותי מן הגישה הקלאסית. שלא כמו ההכנות פרוסת דק שבו שכבות תאים ספציפיים גלויים על פני השטח ניתן לבדוק ישירות, ההכנות בהיפוקמפוס שלם דומים יותר בתצורות vivo שבו האלקטרודות מופחתים לתוך אזורים במוח ממוקד בעת חציית שכבות בודדות. יושרה של ההיפוקמפוס נשמר יחד עם קישוריות תפקודית ומאפיינים של אוכלוסיות נוירונים מקומיים. זה מספק כלי מורכב ורב עוצמה לחקור תנודות רשת קטנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מכריזים על אינטרסים מסחריים או פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות ומחקר מדעי הטבע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S9625
סוכרוזסיגמא אולדריץ'S9378
נתרן ביקרבונטסיגמא אולדריץ'S5761
NaH<תת>2PO<תת>4 - נתרן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S8282
מגנזיום גופרתיסיגמא אולדריץ'M7506
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץP3911
D-(+)-גלוקוזסיגמא אולדריץ'G7528
סידן כלוריד דיהידרטסיגמא אולדריץ'C5080
נתרן אסקורבטסיגמא אולדריץ'A7631-25G
<חזק>שם <חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>ציוד
סטנדרטי מספריים חיתוךפישר סיינטיפיק08-951-25מיצוי מוח
ידית אזמל #4, 14 ס"מWPI500237מסנן מיצוי מוח
מלקחיים, לסתות שטוחות, ישרות (11 ס"מ)WPI500456מיצוי מוח
פרגון להבי אזמל נירוסטה #20Ultident02-90010-20מיצוי מוח
מספריים לחיתוך מעוקל נקודהעדינה תרמו פישר 711999 מדעימיצוי מוח
טפלון (PTFE) - מרית דקה מצופהVWR82027-534הכנת
היפוקמפוסהיימן סטייל מיקרוספטולהפישר סיינטיפיק21-401-25Aהכנת היפוקמפוס
כף מעבדהפישר סיינטיפיק14-375-20הכנת היפוקמפוס
בורוסיליקט זכוכית פסטר פישרסיינטיפיק13-678-20Aהכנת היפוקמפוס
טפטפתהכנת היפוקמפוסמדעית
סכיני גילוח חד שולייםVWR55411-055הכנת היפוקמפוס
נייר עדשה (4 x 6 אינץ')VWR52846-001הכנת היפוקמפוס
צלחות פטרי זכוכית (100 x 20 מ"מ)VWR25354-080הכנת היפוקמפוס
מגש פלסטיק לקרח; גודל 30 x 20 x 5 ס"מהיפוקמפוס
מחמם פתרון מוטבע יחיד וורנרמכשיריםמערכתזלוף
אבני אוויר לאקווריום לבעבועמערכת זילוףn.a.n.a.a
צינורות Tygon E-3603 (מזהה 1/16 OD 1/8)Fisherbrand14-171-129מערכת זלוף
מחבת חשמליתשחורה & מערכת דקרn.a.perfusion
95% O2/5% CO2 תערובת גזים (קרבוגן) מערכת זלוףSG466204A Vitalaire
בקבוקי זכוכית/צלוחיות (4 x 1 ליטר)מערכת זילוף
הקלטה שקועעיצוב מותאם אישית (FM)n.a.ניתן להשתמש בחלופה מסחרית
פיפטות זכוכית (1.5/0.84 OD/ID (מ"מ) ) WPI1B150F-4אלקטרופיזיולוגיה
Hum Bug 50/60 הרץ מסלק רעשQuest ScientificQ-Humbugאלקטרופיזיולוגיה
Multiclamp 700B מגבר טלאי-מהדקהתקנים מולקולרייםMULTICLAMPאלקטרופיזיולוגיה
Multiclamp 700B Commander Programהתקנים מולקולרייםMULTICLAMPאלקטרופיזיולוגיה
ממיר דיגיטלי/אנלוגיהתקנים מולקולרייםDDI440אלקטרופיזיולוגיה
PCLAMP10מכשיריםמולקולרייםPCLAMP10אלקטרופיזיולוגיה
טבלת בידוד רעידות ניופורטn.a.electrophysiology
מיקרומניפולטורים (מופעלים ידנית)Siskiyou MX130אלקטרופיזיולוגיה (LFP)
מיקרומניפולטורים (אוטומטיים)Siskiyou MC1000eאלקטרופיזיולוגיה (תיקון)
מוניטור אודיו A-M Systemsדגם 3300אלקטרופיזיולוגיה
חולץ פיפטה מיקרופיפטה/תיקוןSutterP-97אלקטרופיזיולוגיה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף שנבנה בהתאמה אישיתSiskiyoun.a.מצלמת
וידאו אנלוגיתCOHU4912-2000/0000הדמיה
תופס מסגרת דיגיטלי עם תוכנת הדמיהEPIX, IncPIXCI-SV7הדמיה
אולימפוס 2.5X אובייקטאולימפוסMPLFLNהדמיה
אולימפוס 40X מטרת טבילה במיםאולימפוסUIS2 LUMPLFLNהדמיה
מערכת דיודות פולטות אור (LED) בהתאמה אישית אופטוגנטי מותאם אישית(Amhilon et al., 2015)
שםCompanyCatalog NumberComments
Animals
PV::Cre (KI) עכברימעבדת ג'קסוןמספר מלאי 008069אפשר  ביטוי גנים מכוון Cre באינטרנוירונים PV
עכברי Ai9 מכוננים-מותנים (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))מלאימעבדת ג'קסון007905 Express TdTomato בעקבות רקומבינציה בתיווך Cre
עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFPJackson Laboratory stock
number 012569		מבטאים את חלבון ההיתוך המשופר channelrhodopsin-2/EYFP לאחר חשיפה ל-Cre
עכברי PVChYרקומבינאז בגידול ביתיn.a.צאצאיםשהתקבלו מהכלאה של קו PV-Cre עם עכברי Ai32 (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP
' פישר n.a.n.a.הכנת SH-27Bn.a.n.a.a.תא הדמיה גירוי מספר

מקורות

  1. Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
  2. Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
  3. O'Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
  4. Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
  5. M'Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
  6. Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
  7. Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit's septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
  8. Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
  9. Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
  10. Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neuroscience. 81 (4), 893-926 (1997).
  11. Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
  12. Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
  13. Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
  14. Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
  15. Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
  16. Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
  17. Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
  18. Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
  19. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  20. Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
  21. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  22. Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
  23. Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
  24. Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
  25. Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
  26. Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
  27. Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
  28. Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
  29. Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Patch ClampCA1 Subiculum
כוונון להקת הטטה בהיפוקמפוס
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.